鄭晶 張雨溫 李天客 包陽 張素欣

河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔科，石家莊 050011

舌鱗狀細(xì)胞癌的患病率約占口腔癌的43%，是一種常見的具有強浸潤性、高淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率的口腔癌[1-2]。研究[3-4]指出，舌鱗狀細(xì)胞癌近些年來的患病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢且年齡呈年輕化趨勢，其患病率不僅與年齡、性別和種族有關(guān)系，還與個人口腔衛(wèi)生、吸煙、酗酒等生活習(xí)慣息息相關(guān)。目前，舌鱗狀細(xì)胞癌臨床治療采用的仍是以手術(shù)治療為主，放化療為輔的治療方法。盡管近幾十年來治療水平有所提高，但是患者5年存活率卻沒有大幅度提升[5]。舌是人體行使語言、進(jìn)食等生理功能必不可缺少的器官，舌鱗狀細(xì)胞癌嚴(yán)重影響著患者的生理和心理健康，改進(jìn)治療手段、盡可能地保留舌體健康結(jié)構(gòu)、提高生存率是目前面臨最大的技術(shù)挑戰(zhàn)。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一種廣泛存在于真核生物的長度為22 nt左右的小分子非編碼RNA，它們能特異性識別下游靶基因mRNA的3’端非翻譯區(qū)（3’-untranslated region，3’UTR），并通過與之結(jié)合促進(jìn)mRNA發(fā)生降解進(jìn)而抑制靶基因的翻譯過程[6]。大量的研究[7-8]表明，miRNA與腫瘤密切相關(guān)，可作為腫瘤抑癌或致癌因子參與腫瘤細(xì)胞生長、增殖、分化和凋亡等生物功能。據(jù)報道[9]，有多種miRNA參與了口腔鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生進(jìn)程，其中miR-146a、miR-155、miR-21等發(fā)揮促癌作用，而miR-218、miR-29a等則具有抑癌作用。此外，miR-204-5p被證實對癌細(xì)胞具有抑制作用，在多種癌癥均下調(diào)表達(dá)[10-11]，然后關(guān)于其在舌鱗狀細(xì)胞癌中的作用機制卻鮮有報道。因此，本研究將通過實驗探討miR-204-5p在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)模式和可能的作用機制，為舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病機制以及治療研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

舌鱗狀細(xì)胞癌組織和癌旁組織標(biāo)本來自2016年10月至2018年5月在河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院行根治性手術(shù)切除的42例舌鱗狀細(xì)胞癌患者，人口腔上皮HOEC細(xì)胞系和舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SCC9、SCC25購于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain-containing protein 4，BRD4）、甘油醛3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）小鼠一抗（Sigma公司，美國），HRP兔抗鼠二抗（Abcam公司，英國），DMEM/F12培養(yǎng)基和胰蛋白酶（Gibco公司，美國），實時熒光定量PCR（real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）分子試劑（大連寶生物工程有限公司），Lipofectamine?2000（Invitrogen公司，美國），細(xì)胞計數(shù)試劑盒（cell counting kit，CCK）8和二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），Transwell小室（Corning公司，美國）。

miR-204-5p模擬物和pcDNA-BRD4質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，引物由北京華大基因研究中心合成，主要儀器為Applied Biosystems ABI 7500 qPCR儀（ABI公司，美國）和SpectraMax i3x多功能酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

本研究中RT-qPCR分析采用正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOEC細(xì)胞系、舌鱗狀細(xì)胞癌SCC9細(xì)胞系和SCC25細(xì)胞系為研究對象。細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及雙熒光素酶報告實驗采用SCC25細(xì)胞為實驗細(xì)胞。培養(yǎng)基選擇DMEM/F12于37 ℃、5% CO2條件下進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至65%～75%融合度時，使用0.25%胰蛋白酶消化后傳代。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組

取對數(shù)生長期的SCC25細(xì)胞，使用胰酶消化處理后，參照Lipofectamine?2000說明書，將miR-204-5p陽性對照質(zhì)粒、miR-204-5p模擬物、miR-204-5p陰性對照質(zhì)粒、miR-204-5p抑制表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SCC25細(xì)胞中，分別記為miR-NC組、miR-204-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-204-5p組；將miR-204-5p模擬物分別與BRD4對照質(zhì)粒、BRD4過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SCC25細(xì)胞中，分別記為miR-204-5p+pcDNA組、miR-204-5p+BRD4組。

1.4 RT-qPCR分析miR-204-5p和BRD4 mRNA表達(dá) 水平

所用器皿使用0.1%焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）水滅菌處理，收集癌組織、癌旁組織和培養(yǎng)48 h的正常口腔上皮細(xì)胞HOEC、舌鱗狀細(xì)胞癌SCC9、SCC25、miR-NC組、miR-204-5p組細(xì)胞，分別加入相應(yīng)體積的RNAiso的氯仿，室溫靜置后離心收集上清液，異丙醇沉淀，去除上清液，加入DEPC水溶液后檢測質(zhì)量備用，具體細(xì)節(jié)參考說明書。cDNA合成使用一步法cDNA合成試劑盒，操作參考說明書。定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含STBR Taq 10 μL、50×ROX 0.4 μL、上下游引物（濃度單位為μmol·L-1）各0.4 μL、cDNA 2 μL、雙蒸水補足至20 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40個循環(huán)。BRD4上游引物為5’-GCACAAT- C AAGTCTAAACTGGAG-3’，下游引物為5’-TCAT- GGTCAGGAGGGTTGTAC-3’；GAPDH上游引物為5’-GGCTGAGAACGGGAAGCTTGTCAT-3’，下游引物為5’-CAGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3’。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算BRD4相對表達(dá)水平。

1.5 CCK8實驗檢測細(xì)胞增殖能力

取對數(shù)生長期的miR-NC組、miR-204-5p組、miR-204-5p+pcDNA組、miR-204-5p+BRD4組細(xì)胞，去上清培養(yǎng)液后加入胰酶消化處理并計數(shù)，按照每孔6×104個密度吸取100 μL接種于96孔板中，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，加入10 μL CCK8溶液至反應(yīng)孔中，37 ℃孵育2 h后使用酶標(biāo)儀檢測OD490處的吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力

前期將基質(zhì)膠于4 ℃條件下低溫融化，與無血清培養(yǎng)基按照1∶9的比例混勻，取50 μL注入Transwell小室，在37 ℃培養(yǎng)箱中凝固備用。分別在miR-NC組、miR-204-5p組、miR-204-5p+pcDNA組、miR-204-5p+BRD4組細(xì)胞中，取200 μL SCC25細(xì)胞懸液至上室中至終密度為每孔6×104個，下室中添加600 μL含有20%血清的培養(yǎng)基，之后將小室置于37 ℃條件下孵育24 h。結(jié)束后，使用預(yù)冷磷酸緩沖鹽（phosphate buffer saline，PBS）溶液洗滌，加入1 mL甲醇溶液固定10 min；棄甲醇溶液，預(yù)冷PBS溶液洗滌，加入1 mL結(jié)晶紫染色5 min；使用棉簽去掉小室內(nèi)側(cè)濾膜細(xì)胞，干燥后制片顯微鏡下觀察計數(shù)，即為細(xì)胞侵襲數(shù)。細(xì)胞遷移實驗除Transwell小室未經(jīng)基質(zhì)膠包被，其余與侵襲實驗步驟相同。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測BRD4蛋白表達(dá)

收集miR-NC組、miR-204-5p組、anti-miR-NC組、anti-miR-204-5p組6孔板中細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌2次后離心去除上清液，加入50 μL RIPA裂解液與細(xì)胞充分混勻，冰上裂解60 min后離心收集細(xì)胞上清液，BCA法對上清蛋白進(jìn)行定量。配置12%濃度的分離膠，每孔加入50 μg的蛋白樣品，80 V電泳30 min后調(diào)整電壓為120 V至結(jié)束。將剪裁好的聚偏氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜平鋪于轉(zhuǎn)膜儀陽極，蛋白膠放于陰極，兩側(cè)平鋪濾紙和海綿，恒流轉(zhuǎn)膜30 min。取下PVDF膜于5%封閉液中浸泡 2 h，加入1∶1 000稀釋濃度的BRD4一抗溶液，4 ℃震蕩孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次5 min；加入1∶2 000稀釋比的二抗溶液，室溫震蕩孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次5 min?；瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，并對條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8 雙熒光素酶報告實驗

TargetScan軟件在線分析發(fā)現(xiàn)BRD4和miR-204-5p存在結(jié)合位點，構(gòu)建包含miR-204-5p結(jié)合位點的BRD4 3’UTR野生型和突變型序列片段，并構(gòu)建至熒光素酶表達(dá)載體中，獲得BRD4野生型載體（BRD4-WT）和BRD4突變型載體（BRD4-MUT），將BRD4-WT、BRD4-MUT分別與miR-NC組、miR-204-5p組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至SCC25細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后用試劑盒檢測熒光素酶的相對活性。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究所有數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0分析處理，數(shù)據(jù)結(jié)果使用平均數(shù)±方差的形式來表示，兩組數(shù)據(jù)間比較使用t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較使用單因素方差分析，組間多重比較使用SNK-q檢驗，當(dāng)P＜0.05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 舌鱗狀細(xì)胞癌組織、癌旁組織、舌鱗狀細(xì)胞系及HOEC細(xì)胞系中miR-204-5p和BRD4 mRNA的表達(dá)水平

與癌旁組織（0.998±0.205）相比，舌鱗狀細(xì)胞癌組織中的miR-204-5p（0.545±0.208）顯著下調(diào)表達(dá)（t=6.205，P=0.000），BRD4 mRNA（2.259±0.468）顯著上調(diào)表達(dá)（t=7.218，P=0.000），見圖1A、B。此外，結(jié)果顯示，與正?？谇簧掀ぜ?xì)胞HOEC細(xì)胞相比，舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞SCC9和SCC25細(xì)胞的miR-204-5p表達(dá)顯著下調(diào)（F=84.933，P= 0.000），BRD4 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（F=44.370，P=0.000），見圖1C、D。并且SCC25細(xì)胞中的miR-204-5p和BRD4 mRNA表達(dá)水平與HOEC細(xì)胞中的差異更顯著，所有差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 miR-204-5p對細(xì)胞增殖的影響

與miR-NC組（1.00±0.05）相比，miR-204-5p組miR-204-5p的相對表達(dá)水平為（3.04±0.31），顯著上調(diào)表達(dá)（t=11.253，P＜0.05），細(xì)胞增殖活性顯著降低，見圖2。

2.3 轉(zhuǎn)染miR-204-5p模擬物對細(xì)胞遷移侵襲的影響

與miR-NC組（109.56±10.25）相比，miR-204-5p組細(xì)胞遷移數(shù)（87.42±8.44）顯著降低（t=4.640，P=0.010）；與miR-NC組（75.68±7.41）相比，miR-204-5p組細(xì)胞侵襲數(shù)（51.47±5.99）顯著降低（t= 6.016，P=0.004），見圖3。

圖 1 RT-qPCR檢測miR-204-5p和BRD4表達(dá)水平的變化Fig 1 The expression levels of miR-204-5p and BRD4 were detected by RT-qPCR

圖 2 miR-204-5p過表達(dá)后miR-204-5p表達(dá)水平和細(xì)胞增殖活性Fig 2 miR-204-5p expression and cell proliferation activity after miR-204-5p overexpression

2.4 熒光素酶實驗檢測結(jié)果

TargetScan軟件在線分析發(fā)現(xiàn)BRD4和miR-204-5p存在結(jié)合位點，見圖4A。與共轉(zhuǎn)染miR-NC和BRD4-WT組（0.85±0.06）相比，共轉(zhuǎn)染miR-204-5p和BRD4-WT組的細(xì)胞相對熒光活性（0.39±0.08）顯著降低（t=7.967，P=0.001），見圖4B。miR-NC、miR-204-5p、anti-miR-NC、anti-miR-204-5p組的BRD4 mRNA相對表達(dá)水平（圖4C）分別為1.00±0.05、0.34±0.04、0.94±0.07、1.66±0.11；蛋白相對表達(dá)水平（圖4D、E）分別為1.00±0.09、0.46±0.07、0.91±0.03、1.87±0.16。miR-204-5p模擬物促使BRD4的mRNA和蛋白均顯著下調(diào)表達(dá)，miR-204-5p抑制劑促使BRD4的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（FmRNA=165.668，PmRNA=0.000；F蛋白=105.539，P蛋白=0.000）。

2.5 BRD4過表達(dá)和miR-204-5p對SCC25增殖、遷移 和侵襲的影響

miR-204-5p、miR-204-5p+pcDNA、miR-204-5p+BRD4組發(fā)生遷移的SCC25細(xì)胞數(shù)量分別為70.24±7.18、68.25±6.81、99.36±11.04（F=12.418，P= 0.007）；發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)量分別為50.17±5.14、48.95±4.92、81.39±8.56（F=24.559，P=0.001）。與miR-204-5p和miR-204-5p+pcDNA組相比，miR-204-5p+BRD4組的SCC25細(xì)胞增殖能力顯著提升（P＜ 0.05），見圖5。

圖 3 過表達(dá)miR-204-5p后SCC25細(xì)胞遷移及侵襲數(shù)Fig 3 Number of migration and invasion of SCC25 cells after miR-204-5p overexpression

圖 4 熒光素酶報告實驗Fig 4 Luciferase reporting experiment

圖 5 過表達(dá)BRD4后SCC25增殖活性和遷移、侵襲數(shù)Fig 5 Proliferation activity, migration and invasion number of SCC25 after overexpression of BRD4

3 討論

轉(zhuǎn)移是腫瘤的一個基本屬性，也是造成患者復(fù)發(fā)和死亡的最主要原因[12-13]。其中，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的發(fā)生伴隨著促癌基因和抑癌基因功能的紊亂失調(diào)表達(dá)，包括能夠通過與基因3’UTR結(jié)合參與靶基因表達(dá)調(diào)控的小分子物質(zhì)miRNA[6-8,14]。本研究通過RTqPCR分析發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p在舌鱗狀細(xì)胞癌中顯著下調(diào)表達(dá)，這種趨勢與其他結(jié)腸癌、肝癌、胃癌等多種癌癥中的表現(xiàn)是一致的[15-17]。除此之外，Yin等[18]提出miR-204-5p可通過下調(diào)表達(dá)RAB22A抑制大腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，并增加其化療敏感性；Wang等[19]發(fā)現(xiàn)miR-204-5p可通過靶向RGFG抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移能力；Liu等[20]指出miR-204-5p可下調(diào)IGFBP5抑制甲狀腺乳頭狀癌的增殖能力；Dhalluin等[21]研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p通過靶向調(diào)控CXCR4的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。為進(jìn)一步探究miR-204-5p在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的功能機制，本研究以SCC25為研究對象，RT-qPCR檢測了細(xì)胞內(nèi)miR-204-5p的表達(dá)水平，結(jié)果顯示其在舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中同樣顯著下調(diào)表達(dá)。當(dāng)在SCC25過表達(dá)miR-204-5p時，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力顯著受到抑制，表明miR-204-5p對SCC25細(xì)胞具有顯著的抑制作用，由此可見miR-204-5p在舌鱗狀細(xì)胞癌中同樣扮演著重要角色。

BRD4含有在BET家族高度保守的4個左手α螺旋構(gòu)成的溴結(jié)構(gòu)功能域，是一種哺乳動物廣泛存在的核調(diào)節(jié)因子，可在細(xì)胞有絲分裂過程中通過與染色體結(jié)合來募集相關(guān)的染色體修飾蛋白調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而參與細(xì)胞周期進(jìn)程的調(diào)控、炎癥代謝等生物活動[22-23]。近些年的研究[24]表明，BRD4表達(dá)紊亂失調(diào)與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，尤其是與腫瘤的發(fā)生更是密切相關(guān)。有報道指出，BRD4可通過對c-MYC轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳的調(diào)控促進(jìn)胃癌的發(fā)展進(jìn)程[25]，靶向抑制表觀遺傳信號分子BRD4可以有效地抑制癌癥惡病質(zhì)并且延長生存期[26]；同時，體外實驗[27]中，加入BRD4抑制劑對結(jié)腸癌的生長和轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用。另外，BRD4在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長增殖[28]；當(dāng)降低BRD4表達(dá)量時，口腔癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移受到抑制[29]。本研究通過RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)BRD4在舌鱗狀細(xì)胞癌中同樣上調(diào)表達(dá)，并且使用TargetScan軟件分析發(fā)現(xiàn)BRD4的3’UTR與miR-204-5p種子序列互補，是miR-204-5p的潛在靶標(biāo)。為探究BRD4和miR-204-5p在舌鱗狀細(xì)胞癌中的作用關(guān)系及其機制，使用熒光素酶實驗驗證了兩者的靶向關(guān)系。當(dāng)在SCC25細(xì)胞中過表達(dá)miR-204-5p時，BRD4表達(dá)顯著下調(diào)；當(dāng)敲低miR-204-5p表達(dá)量時，BRD4表達(dá)水平顯著上調(diào)。此外，與單獨轉(zhuǎn)染miR-204-5p模擬物組相比，miR-204-5p模擬物和BRD4表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染SCC25后，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯得到提高，說明BRD4基因能夠回補miR-204-5p對SCC25的抑制作用。

綜上所述，本研究證實了miR-204-5p可通過靶向負(fù)調(diào)控BRD4抑制舌鱗狀細(xì)胞癌SCC25細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，為腫瘤新型療法提供了途徑。然而關(guān)于BRD4作為細(xì)胞內(nèi)一種重要的表觀遺傳分子，參與了多種基因特異性表達(dá)的調(diào)控過程，然而關(guān)于其與miR-204-5p調(diào)控機制之外的其他靶向網(wǎng)絡(luò)以及潛在的脫靶效應(yīng)尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。