趙巧雅　劉娜　潘華　田雪　史玉穎　劉玉山　胡峰　黃兵

摘? 要：為探究引起山東兩個(gè)規(guī)?；B(yǎng)鴿場(chǎng)種鴿死亡病原，本研究成功從兩鴿場(chǎng)中各分離到一株革蘭氏陰性菌，并進(jìn)行純化、PCR鑒定、藥敏試驗(yàn)及血清型鑒定試驗(yàn)。結(jié)果顯示，成功分離出的2株分離菌的16S rRNA片段測(cè)序確定均為沙門氏菌，兩株沙門氏菌的藥敏結(jié)果存在一定差異，但均對(duì)頭孢類、氨基糖苷類及四環(huán)素類等敏感;分子血清分型試驗(yàn)結(jié)果表明2株分離菌均為鼠傷寒沙門氏菌。經(jīng)治療后死亡情況得到控制，該研究結(jié)果為鴿沙門氏菌病的流行及防治提供思路和參考。

關(guān)鍵詞：鴿;沙門氏菌;分離鑒定;血清型

中圖分類號(hào)：S858.395.1? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2020）2-0017-05

鴿沙門氏菌病又稱鴿副傷寒，能夠引起下痢、關(guān)節(jié)炎、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)障礙等癥狀。病原菌的血清型多數(shù)為鼠傷寒沙門氏菌哥本哈根變種，該菌極少感染人類[1]，部分為阿貢納沙門氏菌及科瓦利斯沙門氏菌等[2]。本病廣泛存在于世界各地，既能夠水平傳播也能垂直傳播，絕大多數(shù)發(fā)生于1歲以下的鴿子，并能導(dǎo)致死亡，成年鴿子感染此病死亡率較低，但經(jīng)過一段時(shí)間后會(huì)成為傳染源。

2019年11月份，山東兩個(gè)規(guī)?；B(yǎng)鴿場(chǎng)出現(xiàn)了種鴿每天死亡5～6羽的情況。病鴿精神呆滯，縮頭閉眼，食欲差或不食，有的呼吸困難，部分下痢，排白色、淡綠色或深綠色稀便，便中常帶小氣泡，中心為未消化的飼料，肛周羽毛被糞便沾污。部分患鴿逐步脫水、消瘦，最后衰竭而死。通過臨床觀察及實(shí)驗(yàn)室分析，診斷為沙門氏菌感染。本研究通過細(xì)菌分離、血清型鑒定及耐藥分析等，為預(yù)防鴿沙門氏菌病的發(fā)生及抗生素的使用策略提供參考。

1? 材料與方法

1.1? 材料? 病料為18～24月齡發(fā)病鴿。PCR擴(kuò)增試劑盒購自Axygen公司;藥敏紙片購自北京艾博利德商貿(mào)有限公司;細(xì)菌培養(yǎng)基及其他試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2? 細(xì)菌分離鑒定

1.2.1? 細(xì)菌分離? 無菌條件下分別取病鴿肝臟，接種于5%胎牛血清培養(yǎng)基，于厭氧環(huán)境中培養(yǎng)18～24h，觀察記錄細(xì)菌生長(zhǎng)狀況及形態(tài)。挑取培養(yǎng)或純化后的單菌落，涂片進(jìn)行革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)及染色特性。

1.2.2? PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建? 鑒定細(xì)菌16S rRNA通用引物：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。取單個(gè)細(xì)菌菌落懸浮于50μL生理鹽水作為模板， 按照如下比例配制反應(yīng)體系：模板1μL，上下游引物（20pmol/μL）各0.5μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，補(bǔ)充去離子水至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，55℃ 1min，72℃ 1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST比對(duì)分析，選取GenBank中已登錄的基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，采用MEGA7.0軟件中Neighbor-joining方法構(gòu)建其進(jìn)化樹。

1.3? 藥物敏感試驗(yàn)? 按照WHO推薦的瓊脂紙片擴(kuò)散法（K-B）對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏檢驗(yàn)，最后測(cè)量藥敏試驗(yàn)抑菌環(huán)直徑，結(jié)果按NCCLS標(biāo)準(zhǔn)做出判定。

1.4? 分子血清分型? 參照文獻(xiàn)[3]中合成引物，引物序列見表1。

取單個(gè)細(xì)菌菌落懸浮于50μL生理鹽水作為模板， 按照如下比例配制反應(yīng)體系：模板1μL，上下游引物（20pmol/μL）各0.5μL，2×Taq PCR Mix 12.5μL，補(bǔ)充去離子水至25μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5min，95℃ 30s，退火1min（退火溫度見表1），72℃ 1min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。取5μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 剖檢結(jié)果? 部分急性死亡者，多無明顯病變，僅見肝、腎腫大，個(gè)別輸卵管內(nèi)見有1枚鴿蛋。病程稍長(zhǎng)的可見肝腫大，有的呈古銅色心，有針頭至粟粒大小的灰白色壞死灶。腎腫大、輸尿管有白色尿酸鹽沉積;腸壁增厚，腸粘膜充血、出血，腸道內(nèi)有充滿黃綠色或綠色帶有泡沫樣的糊狀物。雌鴿卵泡充血、出血、變形。有的卵黃墜入腹腔發(fā)生腹膜炎。雄鴿睪丸腫大或縮小，有點(diǎn)狀壞死。病例未曾見到關(guān)節(jié)型和神經(jīng)型的病變。

2.2? 細(xì)菌分離與純化? 無菌采集肝臟接種于血清培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h后，培養(yǎng)基上長(zhǎng)出直徑大約1mm的細(xì)小、光滑、表面濕潤(rùn)的灰白色菌落，染色鏡檢可見分離菌呈兩端橢圓或卵圓形，不形成芽孢和莢膜的革蘭氏陰性小桿菌，大?。?.6～0.9）×（1～3）μm，兩株菌分別命名為SM-JQ30-2019、SM-JQ31-2019。

2.3? 16S rRNA PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建? 將分離株進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增，在約1500bp處各有一特異性條帶。將測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行比對(duì)、分析，結(jié)果顯示兩株菌與Salmonella enterica（CP032490.1）的相似度分別為99.93%、99.65%，選擇沙門氏菌幾個(gè)亞種構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖1），結(jié)果顯示兩株菌均與Salmonella enterica（MH548459.1）位于同一分支，結(jié)合培養(yǎng)特性及細(xì)菌形態(tài)，鑒定2株菌均為沙門氏菌。16S rRNA核苷酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹見圖1。

2.4? 分子血清型鑒定? 對(duì)分離株進(jìn)行血清型鑒定發(fā)現(xiàn)，只有SB及S. Typhimurium兩對(duì)引物有陽性條帶，其余均為陰性，結(jié)果表明2株分離菌的血清型均為鼠傷寒沙門氏菌。血清型堅(jiān)定PCR電泳圖見圖2。

2.5? 藥敏試驗(yàn)分析? 采用12種常規(guī)抗生素藥敏紙片進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示，2株分離菌對(duì)林可霉素類抗生素完全耐藥，對(duì)頭孢類、氨基糖苷類及四環(huán)素類等均敏感，2株菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類及喹諾酮類的敏感性存在一定差異。藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2。

3? 防治措施

目前，第3代頭孢菌素和第3代喹諾酮類藥物是治療沙門氏菌感染的常用藥物，根據(jù)本試驗(yàn)藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行耐藥分析，結(jié)合養(yǎng)殖場(chǎng)的用藥情況，選擇頭孢類抗生素頭孢他啶進(jìn)行治療。全群狀況好轉(zhuǎn)，發(fā)病率和死亡率降低，整體情況得到控制;另一方面，要做好養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全、衛(wèi)生消毒制度等。

4? 總結(jié)

鴿沙門氏菌病是一種常見病和多發(fā)病，該病的發(fā)生是由多方面因素造成的，因此，本病從防治角度進(jìn)行，預(yù)防大于治療，從源頭切斷該病的傳播，可以大大減少生產(chǎn)損失。沙門氏菌血清型眾多，目前根據(jù)免疫血清學(xué)的方法可將其分出46個(gè)血清組，2523種血清型[4]，傳統(tǒng)平板凝集可能需要幾天時(shí)間，現(xiàn)在PCR技術(shù)等分子方法已開始廣泛應(yīng)用于沙門氏菌血清分型研究中[5]。

本研究中，已證實(shí)從山東兩個(gè)有下痢等癥狀的種鴿場(chǎng)中分離得到的2株細(xì)菌均為鼠傷寒沙門氏菌，說明鼠傷寒沙門氏菌為優(yōu)勢(shì)血清型，這與我國(guó)華東[2]、華南[6]等報(bào)道一致。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示2株分離菌存在一定差異，但對(duì)林可霉素類抗生素均完全耐藥，對(duì)頭孢類、氨基糖苷類及四環(huán)素類等均敏感。這與已有報(bào)道中鴿源鼠傷寒沙門氏菌的藥敏結(jié)果存在很大不同[7-9]，這是由于各地區(qū)、養(yǎng)殖場(chǎng)等用藥背景不同，使得不同菌株的耐藥譜存在較大差異。根據(jù)藥敏結(jié)果，選用頭孢他啶治療后，病情得到有效控制。因此，臨床防控及治療細(xì)菌性疾病時(shí)，不應(yīng)盲目用藥，應(yīng)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析其耐藥情況，進(jìn)行選擇用藥，以減少耐藥菌的產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]? 郭予強(qiáng)， 凌育燊，楊連楷. 鴿沙門氏菌病病原特性的研究[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)， 1986， （02）： 123-128.

[2]? 梁德媚， 許學(xué)斌， 王偉芳， 等. 上海市肉鴿沙門氏菌的分離鑒定及流行血清型和耐藥性分析[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2016， 43（12）： 3322-3328.

[3]? 劉斌. 沙門氏菌血清分型分子靶點(diǎn)的發(fā)掘及鑒定體系的建立[D]. 上海：上海交通大學(xué)， 2012.

[4]? Lei W， Kanella A， Dan L， et al. Extensive variation in the O-antigen gene cluster within one Salmonella enterica serogroup reveals an unexpected complex history[J]. Journal of Bacteriology， 2002， 184（6）.

[5]? Herrera-León S， Ramiro R， Arroyo M，et al. Blind comparison of traditional serotyping with three multiplex PCRs for the identification of Salmonella serotypes[J]， 158（2）： 0-127.

[6]? 李雪雁， 付濤， 紀(jì)桂云，等.華南地區(qū)肉鴿源沙門氏菌的鑒定及遺傳進(jìn)化分析[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)， 2014， 41（07）： 207-211.

[7]? 劉洋， 嚴(yán)專強(qiáng)， 王占新，等.兩株肉鴿源鼠傷寒沙門氏菌的分離鑒定[J].廣東畜牧獸醫(yī)科技， 2018， （06）： 42-44.

[8]? 程旭， 沈欣悅， 劉梅，等.鴿源鼠傷寒沙門菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志， 2016， 52（08）： 99-100.

[9]? 姜文欣， 劉陽， 王彥紅，等.1例鴿感染鼠傷寒沙門氏菌的診斷及藥敏試驗(yàn)[J].養(yǎng)禽與禽病防治，2014， （03）： 2-3.

Isolation， identification， diagnosis and treatment of

two Salmonella strains isolated from pigeon

ZHAO Qiaoya，LIU Na，PAN Hua，TIAN Xue，SHI Yuying，LIU Yushan，HU Feng，HUANG Bing

（Institute of Poultry Sciences，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250023，China）

Abstract： In order to study the pathogenic conditions of pigeons in two large-scale pigeon farms in Shandong Province， one isolate was successfully isolated from each pigeon farm by liver isolation， purification， PCR identification， drug sensitivity test and serotype identification test. The 16S rRNA fragments of two isolates were sequenced and determined to be Salmonella. There were some differences in drug sensitivity results of two isolates， but they were all for cephalosporins and ammonia The results of molecular serotyping showed that the two strains were Salmonella typhimurium. After treatment， the death situation was controlled. The results of this study provide reference for the epidemic and prevention of pigeon salmonellosis.

Key words： Pigeon; Salmonella; isolation and identification; serotype