對(duì)馬鈴薯類受體激酶CRK基因家族的鑒定及響應(yīng)病原真菌信號(hào)的表達(dá)分析

張衛(wèi)娜 范艷玲 康益晨 楊昕宇 石銘福 要 凱 趙章平 張俊蓮 秦舒浩

對(duì)馬鈴薯類受體激酶CRK基因家族的鑒定及響應(yīng)病原真菌信號(hào)的表達(dá)分析

張衛(wèi)娜 范艷玲 康益晨 楊昕宇 石銘福 要 凱 趙章平 張俊蓮 秦舒浩*

甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院, 甘肅蘭州 730070

富含半胱氨酸的類受體激酶(cysteine-rich receptor-like kinase, CRK)在植物生長發(fā)育和環(huán)境適應(yīng)過程中發(fā)揮重要的作用。本研究鑒定了馬鈴薯()家族成員, 并對(duì)其理化性狀、進(jìn)化特征、亞細(xì)胞定位、染色體位置和表達(dá)模式進(jìn)行分析。鑒定獲得8個(gè)s, 其氨基酸序列大小為459~686 aa, 分子量介于50.75~77.50 kD, 等電點(diǎn)介于5.84~8.75, 主要位于質(zhì)膜。進(jìn)化分析將來自馬鈴薯、擬南芥、香蕉、蘋果、水稻、番茄和棉花的CRKs分為9個(gè)亞組, 2號(hào)、3號(hào)和5號(hào)染色體上的CRKs分布于亞組I (6個(gè)成員)和VI (2個(gè)成員); 存在2個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇, 包含4個(gè)成員。s啟動(dòng)子區(qū)域存在多種順式調(diào)控元件, 主要響應(yīng)激素、低溫、防衛(wèi)和逆境等信號(hào)。接種晚疫病菌(,)和干腐病菌(,)后, 分別發(fā)現(xiàn)8個(gè)和6個(gè)s為差異表達(dá)。其中,4和8響應(yīng)和信號(hào), 在接種以上2種病原菌后, 表達(dá)量上調(diào)8倍以上, 推測(cè)其響應(yīng)多個(gè)真菌信號(hào), 可能在馬鈴薯對(duì)真菌病害的廣譜抗性中起重要作用, 可作為進(jìn)一步抗病研究和功能分析的候選基因。

CRK; 順式表達(dá)元件; 生物信息學(xué)分析; 硫色鐮刀菌; 馬鈴薯晚疫病菌

植物類受體激酶(receptor-like kinase,RLK)是一類定位在細(xì)胞膜上的單次跨膜蛋白,由數(shù)量龐大的不同種類的蛋白質(zhì)組成[1]。RLKs的分子結(jié)構(gòu)和功能與動(dòng)物的受體蛋白激酶相似,在幾乎所有的生命活動(dòng)中起重要的調(diào)控作用。植物中的第1個(gè)RLK基因是1990年由開拓者John C Walker和Ren Zhang教授在玉米中發(fā)現(xiàn)的[2]。此后,在植物中陸續(xù)鑒定到越來越多的RLKs,在模式植物擬南芥中約有600多個(gè)[3],而在水稻中約有1130多個(gè),被認(rèn)為是植物體中最大的一類受體基因[4]。一個(gè)典型的RLK由N端信號(hào)肽序列、胞外受體結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)激酶區(qū)構(gòu)成[5]。N端信號(hào)肽具有疏水的功能,蛋白質(zhì)合成的過程中起識(shí)別胞外信號(hào)的作用。植物RLK的胞外結(jié)構(gòu)域能識(shí)別細(xì)胞外生長、發(fā)育和各種環(huán)境因子,進(jìn)而將信息傳遞至胞內(nèi)激酶區(qū),使之發(fā)生磷酸化或去磷酸化等反應(yīng),開啟或關(guān)閉下游靶蛋白,從而調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育和逆境響應(yīng)[6-7]。根據(jù)RLKs胞外結(jié)構(gòu)域氨基酸序列的差異,可將其分為:富含亮氨酸重復(fù)序列型(leucine-rich repeats,LRR)、Malectin、類凝集素型(lectin-like)、Lysin motif (LysM)、DUF26等,進(jìn)而其分為40余個(gè)亞家族[4]。其中,富含半胱氨酸的類受體激酶(cysteine-rich receptor-like kinase,CRK)是一類廣泛存在于動(dòng)物和植物中的膜受體蛋白,具有1個(gè)N端信號(hào)肽、1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域、1個(gè)C端的胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域(Ser/Thr protein kinase domain)以及1個(gè)通常由1~4個(gè)拷貝的strss-antifung結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的胞外結(jié)構(gòu)域(extracellular domain)[8]。研究發(fā)現(xiàn),擬南芥有44個(gè)CRKs,陸地棉中有70個(gè)[9-10]。

CRKs在植物生長發(fā)育、激素信號(hào)傳導(dǎo)、非生物脅迫和病原體防御以及細(xì)胞過敏性死亡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[11-12]。擬南芥中,過表達(dá)、、或均可增強(qiáng)植物防御病原菌早期和中期的免疫反應(yīng)[13-14]。當(dāng)擬南芥受丁香假單胞菌DC3000侵染后,或過表達(dá)的植株細(xì)胞迅速發(fā)生過敏性死亡,誘導(dǎo)病原菌相關(guān)防御基因上調(diào)表達(dá)[15-17];而突變體則通過加速胞外活性氧的爆發(fā)誘導(dǎo)細(xì)胞過敏性死亡,從而抑制病原菌的生長[18]。水稻中也有相似的研究,和與互作可以介導(dǎo)水稻對(duì)多種病原菌的廣譜性免疫反應(yīng)[19]。但是,在大麥中,瞬時(shí)沉默能夠增強(qiáng)表皮細(xì)胞對(duì)白粉病菌f. sp.的抗性而不影響R基因介導(dǎo)的抗病途徑[20],這些研究表明CRKs在植物免疫抗病中起重要調(diào)控作用,但是不同CRKs的功能和作用方式不同。

CRKs作為對(duì)植物生長發(fā)育和抗逆性具有重要功能的植物類受體激酶中的一大類,其在馬鈴薯基因組中的分布、表達(dá)及功能尚未見報(bào)道。本研究采用生物信息學(xué)的分析方法,分析馬鈴薯CRK基因家族的成員數(shù)量、染色體定位、進(jìn)化及其分類;預(yù)測(cè)編碼蛋白質(zhì)的生理生化特性和順式表達(dá)元件; 分析對(duì)干腐病和晚疫病病菌侵染時(shí)的響應(yīng)模式,以期為進(jìn)一步研究馬的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)搜索和CRKs鑒定

馬鈴薯基因組、CDS和蛋白序列及染色體位置等信息均下載自馬鈴薯基因組在線數(shù)據(jù)資源(http:// potato.plantbiology.msu.edu/integrated_searches.shtml)。擬南芥、香蕉、蘋果、水稻、番茄和棉花蛋白序列分別下載自擬南芥在線信息資源(Arabidopsis information resource, TAIR: http://www. arabidopsis.org/)、香蕉基因組數(shù)據(jù)庫(https://banana-genome-hub.southgreen. fr/)、蘋果基因組數(shù)據(jù)庫(Genome Database of Rosaceae species, GDR: https://www.rosaceae.org/)、水稻基因組數(shù)據(jù)庫(Rice Genome Annotation Project, http://rice. plantbiologymsu.edu/)、茄科植物基因組數(shù)據(jù)庫(Solanaceae Genomics Resource: http://solanaceae. plantbiology.msu.edu/index.shtml)和棉花基因組數(shù)據(jù)庫(http://www.cottongen.org/)。利用HMMER3.0軟件(HMMER 3.0, http://hmmer.janelia.org/)鑒定馬鈴薯基因。利用保守域預(yù)測(cè)軟件Pfam (http://pfam. janelia.org/)和SMART (http://smart.emblheidelberg. de/)初步鑒定獲得的候選基因, 確保其N-末端含有一個(gè)或多個(gè)Stress-antifung結(jié)構(gòu)域、C-末端Pkinase結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2 馬鈴薯CRKs的生物信息學(xué)分析

分別使用在線分析工具ExPASyProtParam (https:// web.expasy.org/protparam/)、CELLO v.2.5 (http://cello. life.nctu.edu.tw/)、WoLF PSORT (https://www.genscript. com/wolf-psort.html)和MapDraw確認(rèn)分析[21]理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位和染色體位置可視化。利用ClustalX1.83軟件[22]進(jìn)行多序列比對(duì), 并用進(jìn)化分析軟件MEGA5.0 (http://www.megasoftware.net/), 以鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建進(jìn)化樹, 執(zhí)行參數(shù)為Poission模式(Poission Model)、部分刪除(Partial deletion)和1000次重復(fù)有根樹(Bootstrap replicated 1000)。

1.3 馬鈴薯CRKs結(jié)構(gòu)分析

從馬鈴薯基因組數(shù)據(jù)庫中下載馬鈴薯外顯子和內(nèi)含子分布數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)文件, 利用GSDS 2.0網(wǎng)站(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)繪制基因結(jié)構(gòu)分布圖。

1.4 馬鈴薯CRKs啟動(dòng)子順式元件(cis-element)分析

從馬鈴薯基因組中提取基因轉(zhuǎn)錄起始位置上游1500 bp序列查找啟動(dòng)子順式作用元件, 在PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/ html/)預(yù)測(cè)分析。

1.5 馬鈴薯CRKs響應(yīng)干腐病和晚疫病菌侵染的表達(dá)模式分析

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR)法檢測(cè)馬鈴薯s響應(yīng)干腐病和晚疫病病菌侵染的表達(dá)模式。用于響應(yīng)干腐病和晚疫病病菌侵染表達(dá)模式分析的材料分別是馬鈴薯‘隴薯7號(hào)’塊莖和‘荷蘭15號(hào)’葉片?！]薯7號(hào)’塊莖由甘肅省定西市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供, 硫色鐮刀菌()由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院李永才教授課題組提供。在馬鈴薯的赤道部位均勻地打3個(gè)3 mm深、直徑3 mm的小孔, 于每個(gè)小孔中接種提前備好的20 μL的孢子懸浮液(濃度1.0×106孢子 mL-1)。用聚乙烯袋包裝后裝入紙箱, 在室溫25℃條件下貯藏。每個(gè)處理包括5個(gè)馬鈴薯塊莖, 重復(fù)3次。接種不同時(shí)間(1 d、2 d、3 d和4 d)后, 取接種點(diǎn)向外0.5 cm的塊莖組織, 以打孔后不接種塊莖為對(duì)照。3次生物學(xué)試驗(yàn)重復(fù)?！半]薯7號(hào)”塊莖種植后, 取葉片用2.5 mmol L-1水楊酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)處理1 h和3 h用于驗(yàn)證試驗(yàn)?！昂商m15號(hào)”葉片為本實(shí)驗(yàn)室自己種植, 晚疫病菌(HB 09-16-2)由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)田振東教授課題組惠贈(zèng), 接種方法和培養(yǎng)條件參照蔣銳(2017)博士論文[23]。分別于接種1 d、4 d、6 d和8 d等不同時(shí)間點(diǎn)采樣。每個(gè)處理重復(fù)３次, 錫箔紙包裹標(biāo)記, 液氮速凍后保存于-80℃超低溫冰箱備用。

利用RNAout試劑盒(160906-50, Tiandz, 北京)提取組織總RNA, 經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后分別采用試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (RR047, TaKaRa, 大連)和SYBR Premix ExII (TliRNaseH Plus)(RR820, TaKaRa, 大連)進(jìn)行cDNA合成和qRT-PCR擴(kuò)增。采用在線軟件Primer 3.0 (http:// primer3.ut.ee/)設(shè)計(jì)引物, 以elongation factor 1-α(GenBank登錄號(hào)為AB061263)作為內(nèi)參基因[24], 引物序列如表1所示。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線及熔解曲線, 并采用2–??CT計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量[25]。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2010軟件處理原始數(shù)據(jù), 利用-test (< 0.05)法分析差異顯著性, 采用軟件OriginPro 8.0進(jìn)行圖形可視化, 所有數(shù)值均表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”。

表1 馬鈴薯CRKs引物

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯CRKs鑒定

以馬鈴薯基因組序列為參考序列, 經(jīng)分析和過濾, 共獲得14個(gè)蛋白序列, 通過與基因編號(hào)對(duì)應(yīng), 發(fā)現(xiàn)部分基因?qū)?yīng)1個(gè)以上的蛋白序列, 所對(duì)應(yīng)蛋白序列完全相同。最終獲得對(duì)應(yīng)的8個(gè)s, 其對(duì)應(yīng)蛋白的氨基酸序列大小介于459~686, 分子量和等電點(diǎn)分別介于50.75~77.50 kD和5.84~8.75 (表1)。利用在線軟件CELLO v.2.5和WoLF PSORT對(duì)8個(gè)基因的亞細(xì)胞定位進(jìn)行預(yù)測(cè), 發(fā)現(xiàn)DMG400013524和DMG400015171位于質(zhì)膜, 其他基因利用2種軟件預(yù)測(cè)的結(jié)果有所區(qū)別, 其中4個(gè)基因位于質(zhì)膜或者葉綠體, DMG400015170位于質(zhì)膜或者細(xì)胞質(zhì), 而DMG400006912位于質(zhì)膜或者液泡。

表2 馬鈴薯CRKs

亞細(xì)胞定位, “a”和“b”表示通過網(wǎng)絡(luò)軟件CELLO v.2.5和WoLF PSORT預(yù)測(cè)蛋白的定位; PM: 質(zhì)膜; Vacu: 液泡; Chlo: 葉綠體; Cyto: 細(xì)胞質(zhì);#以“PGSC...”開始的基因編號(hào)是來自馬鈴薯基因組測(cè)序聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫(http://potatogenomics.plantbiology.msu.edu/)。

For subcellular localization, “a” and “b” indicate the localization of protein predicted by using online software CELLO v.2.5 and WoLF PSORT; PM: plasma membrane; Vacu: vacuole; Chlo: chloroplast; Cyto: cytoplasm;#: Gene ID beginning with “PGSC...” is from Database of Potato Genome Sequencing Consortium (http://potatogenomics.plantbiology.msu.edu/).

2.2 馬鈴薯、擬南芥、香蕉、蘋果、水稻、番茄和棉花CRK家族進(jìn)化樹分析

從圖1看出, CRKs可以分為9個(gè)亞組(圖1), 其亞組Ⅲ和亞組Ⅳ中, 除Gh-A01G2043和MD09G1104200外, 其余成員均來自水稻和香蕉2種單子葉植物, 而亞組VI-Ⅸ的家族成員都來自棉花、馬鈴薯、蘋果、擬南芥、番茄等雙子葉植物。馬鈴薯8個(gè)CRKs分布于亞組I和VI, 其中6個(gè)分布于亞組I, 2個(gè)分布于亞組VI。其亞組I中, 基因PGSC0003DMP400037082和PGSC0003DMP400001023同源性較高, 馬鈴薯基因PGSC0003DMP400031539、PGSC0003DMP400023928和PGSC0003DMP400012234分別與番茄基因Solyc03g112730.3.1、Solyc05g1005070.2.1和Solyc02g067780.3.1同源性較高, 均達(dá)99%以上。

2.3 馬鈴薯CRKs的染色體定位

通過下載馬鈴薯s相關(guān)染色體定位信息, 利用軟件MapDraw進(jìn)行染色體定位并進(jìn)行可視化分析。結(jié)果顯示, 馬鈴薯的8個(gè)s中, 3號(hào)和5號(hào)染色體上均分布3個(gè)s, 2號(hào)染色體上分布2個(gè)s。其中, PGSC0003DMG400013524和PGSC0003DMG400013525、PGSC0003DMG400015170和PGSC0003DMG400015171在染色體上的相對(duì)位置小于100 kb, 推斷為串聯(lián)重復(fù)基因簇。

2.4 馬鈴薯CRKs的結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域分析

利用CRKs家族成員單獨(dú)構(gòu)建的進(jìn)化樹和外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)如圖3所示。CRKs家族成員單獨(dú)構(gòu)建的進(jìn)化樹和圖1所示結(jié)果一致。CRKs具有相對(duì)保守的基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域(圖3)。馬鈴薯s長度介于3.2~5.1 kb, 外顯子數(shù)目為6~8個(gè), 較為接近。保守結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示, 馬鈴薯CRK家族中7個(gè)蛋白質(zhì)具有2個(gè)stress-antifung結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Pkinase_Tyr結(jié)構(gòu)域, 而PGSC0003DMP400026615(CRK7)只含有1個(gè)stress-antifung結(jié)構(gòu)域和1個(gè)Pkinase_Tyr 結(jié)構(gòu)域, 此外, PGSC0003DMP400026615 (CRK7)和PGSC0003DMP400026620 (CRK8)除了具有stress-antifung和Pkinase_Tyr結(jié)構(gòu)域外, 還含有1個(gè)功能未知的DUF3403 (PF11883)結(jié)構(gòu)域。結(jié)合CRK蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果, 位于進(jìn)化樹同一分支的同源基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)和功能結(jié)構(gòu)域, 推測(cè)它們具有相似的生物學(xué)功能。

圖1 馬鈴薯、擬南芥、香蕉、蘋果、水稻、番茄和棉花CRK家族進(jìn)化樹分析

圖2 馬鈴薯CRKs染色體定位

*代表串聯(lián)重復(fù)基因簇。* indicates tandem duplication genes.

2.5 馬鈴薯CRKs家族cis-element分析

為進(jìn)一步理解基因的調(diào)控功能, 本研究對(duì)啟動(dòng)子序列中順式元件進(jìn)行了分析。通過馬鈴薯基因組提取s起始密碼子上游1500 bp啟動(dòng)子序列, 利用在線工具PlantCARE進(jìn)行順式元件分析, 并提取了響應(yīng)激素和逆境相關(guān)的15類順式元件。由圖4可知,s啟動(dòng)子區(qū)域富含響應(yīng)植物激素和逆境脅迫的順式作用元件(圖4)。如圖所示, 與植物激素響應(yīng)相關(guān)的順式元件有5類, 分別為脫落酸響應(yīng)元件(A和B)、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(H)、水楊酸響應(yīng)元件(I)、赤霉素響應(yīng)元件(C、D和E)和生長素響應(yīng)元件(F和G); 與生長發(fā)育相關(guān)的順式元件有兩類: 玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件(J)和黃酮類代謝元件(N); 而脅迫響應(yīng)相關(guān)的順式元件主要包括: 厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件(K)、缺氧響應(yīng)元件(L)、低溫響應(yīng)元件(O)和防御和壓力響應(yīng)元件(M)。這暗示了馬鈴薯CRK基因家族在馬鈴薯生長發(fā)育及多種激素和脅迫中的潛在作用。

圖3 馬鈴薯CRKs的基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析

A: 馬鈴薯CRKs進(jìn)化樹; B: 馬鈴薯s基因結(jié)構(gòu); C: 馬鈴薯CRK蛋白的功能結(jié)構(gòu)域。

A: phylogenetic tree ofCRKs; B: gene structure ofs; C: functional domains ofCRKs.

圖4 預(yù)測(cè)馬鈴薯CRKs啟動(dòng)子中順式調(diào)控元件

A和B: 脫落酸響應(yīng)元件; C: GARE-motif; D和E: 赤霉素響應(yīng)元件; F和G: 生長素響應(yīng)元件; H: 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件; I: 水楊酸響應(yīng)元件; J: 玉米醇溶蛋白代謝調(diào)控元件; K: 厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件; L: 缺氧響應(yīng)元件; M: 防御和壓力響應(yīng)元件; N: 黃酮類代謝響應(yīng)元件; O:低溫響應(yīng)元件。

A and B: are the abscisic acid responsive elements; C: GARE-motif; D and E: the Gibberellin responsive elements; F and G: the auxin responsive elements; H: the Methyl jasmonate responsive element; I: the Salicylic acid responsive elements; J: the regulatory element for Zein metabolism; K: the Anaerobic responsive elements; L: the anoxic responsive elements; M: the defense and stress responsive elements; N: the flavonoid responsive elements; O: the low-temperature responsive elements.

為驗(yàn)證所預(yù)測(cè)-element的準(zhǔn)確性, 經(jīng)SA和JA分別處理馬鈴薯葉片后檢測(cè)了6個(gè)s的表達(dá)情況(圖5)。4、5和8啟動(dòng)子區(qū)域均存在響應(yīng)SA信號(hào)的-element。SA處理后, 以上3個(gè)s均為差異表達(dá)。其中,8上調(diào)最高, SA處理1 h和3 h后, 其表達(dá)量分別上調(diào)至對(duì)照的5.71倍和11.22倍。此外,7啟動(dòng)子存在響應(yīng)MeJA信號(hào)的-element, JA處理1 h和3 h后其表達(dá)量也發(fā)生顯著上調(diào), 分別上調(diào)至對(duì)照的5.95倍和4.73倍。2和6啟動(dòng)子區(qū)域不存在響應(yīng)SA和MeJA中任何一種激素的-element。盡管SA和JA處理后以上2個(gè)s也發(fā)生不同程度的變化, 但變化幅度較小。以上結(jié)果表明, 對(duì)s啟動(dòng)子區(qū)域-element預(yù)測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確性較高。

圖5 SA和JA處理后6個(gè)馬鈴薯CRKs的表達(dá)情況

2.6 CRKs在晚疫病菌侵染馬鈴薯葉片中的表達(dá)分析

植物CRKs蛋白參與調(diào)節(jié)植物對(duì)生物脅迫和非生物脅迫的應(yīng)答。生產(chǎn)中, 馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉[(Mont.) de Bary]引起的, 晚疫病能夠?qū)е埋R鈴薯莖葉死亡和塊莖腐爛。為進(jìn)一步分析Sts響應(yīng)病原真菌的表達(dá)模式, 我們通過對(duì)馬鈴薯葉片接種晚疫病菌, 利用Realtime PCR技術(shù)檢測(cè)了葉片中s的表達(dá)特征(圖6)。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), 8個(gè)s對(duì)晚疫病菌都有響應(yīng)。其中,1、4和8隨著侵染時(shí)間的延長, 其相對(duì)表達(dá)量呈逐漸上調(diào)表達(dá)的趨勢(shì), 8 d時(shí)分別上調(diào)到對(duì)照的13.02±4.40、24.72±5.40和21.38±2.10倍。3、5、7和8與對(duì)照組相比, 不同時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異。

2.7 CRKs基因家族在干腐病菌侵染馬鈴薯塊莖中的表達(dá)分析

馬鈴薯塊莖在貯藏期間極易發(fā)生腐爛, 其中由硫色鐮刀菌()引起的干腐病是造成甘肅馬鈴薯腐爛的最主要病害, 本實(shí)驗(yàn)通過接種硫色鐮刀菌, 檢測(cè)塊莖在受到病菌侵染時(shí)s的表達(dá)特征(圖7)。馬鈴薯塊莖在貯藏期受病菌侵染后, 未檢測(cè)到1和7基因的表達(dá), 而4、5和8隨著病菌侵染時(shí)間的延長, 其相對(duì)表達(dá)量呈逐漸上升的趨勢(shì), 且在處理4 d時(shí), 分別上升至對(duì)照的8.43±0.60、1.72±0.20和36.52±7.80倍;和與對(duì)照相比,不同時(shí)間點(diǎn)均有顯著差異。據(jù)此推斷, 馬鈴薯基因家族成員在進(jìn)化過程中發(fā)生了功能分化, 分工協(xié)作參與馬鈴薯對(duì)病原菌的響應(yīng)。

3 討論

不同物種中CRKs的數(shù)目不盡相同, 水稻中有39個(gè)CRKs, 而擬南芥中有44個(gè)[9], 不同遺傳背景的棉花中CRKs數(shù)量不同,中有70個(gè)而中有54個(gè)[10]。擬南芥44個(gè)s中19個(gè)成員是以串聯(lián)成簇的形式排列于4號(hào)染色體上,而且序列之間高度相似[26]。本研究首次基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)域保守序列, 對(duì)馬鈴薯CRKs成員進(jìn)行鑒定及生物信息學(xué)分析, 共獲得8個(gè)家族成員, 無規(guī)律地分布于2號(hào)、3號(hào)和5號(hào)染色體上, 進(jìn)化分析將其分為2個(gè)進(jìn)化分支。熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析表明s對(duì)干腐病菌和晚疫病菌侵染的響應(yīng)情況說明s可能在調(diào)控馬鈴薯對(duì)病原真菌的抗性反應(yīng)中發(fā)揮作用。

圖6 馬鈴薯CRKs響應(yīng)晚疫病菌侵染的表達(dá)分析

圖7 馬鈴薯CRKs響應(yīng)干腐病菌侵染的表達(dá)分析

部分馬鈴薯CRKs基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域特征與其他基因有顯著差異。其中, PGSC0003DMP400026615 (CRK7)和PGSC0003DMP400026620 (CRK8)除含有典型的stress-antifung結(jié)構(gòu)域和Pkinase_Tyr結(jié)構(gòu)域外還含有1個(gè)功能未知的DUF3403結(jié)構(gòu)域(PF11883);s在進(jìn)化過程中基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域的差異, 為成員之間的功能分化提供遺傳變異的基礎(chǔ)。通過對(duì)外顯子和內(nèi)含子的研究, 有助于我們分析了解基因結(jié)構(gòu)和功能上的差異[27]。馬鈴薯s的外顯子為6個(gè)至8個(gè), 而且位于進(jìn)化樹同一亞族內(nèi)的s具有類似的內(nèi)含子/外顯子數(shù)目和排列模式, 同時(shí)它們的保守結(jié)構(gòu)域也具有類似的數(shù)量和位置順序, 說明亞族內(nèi)成員間在進(jìn)化過程中較為保守。

植物啟動(dòng)子要正確調(diào)控基因的表達(dá)水平和表達(dá)模式, 需要核心啟動(dòng)子以及上下游的順式作用元件協(xié)同作用。Xu等[28]對(duì)中國華東野生葡萄中受白粉病和赤星病誘導(dǎo)表達(dá)的VpSTS誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的序列分析發(fā)現(xiàn), 該啟動(dòng)子含有Box-W1、TC-rich repeat element、ABRE、MBS和LTR等順式作用元件。其中, Box-W1 (TTGACC)與歐芹中真菌激發(fā)子響應(yīng)元件的保守核心序列相似, 特異性地被SA誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子WRKY結(jié)合蛋白識(shí)別[29]。TC-rich repeat element最早是從煙草中識(shí)別出來的與防御和脅迫相關(guān)的順式作用元件[30]。MBS是MYB轉(zhuǎn)錄因子同源物的結(jié)合位點(diǎn)[31], ABRE是ABA響應(yīng)的元件[32], 而LTR是低溫響應(yīng)順式元件[33]。本研究發(fā)現(xiàn), 馬鈴薯的8個(gè)s中, 有4個(gè)s (1、2、3、4)含有TC-rich repeat element順式元件, 7個(gè)s (1、2、3、4、5、7和8)具有ABRE元件, 1個(gè)(1)具有MBS元件, 2個(gè)s (4和6)含有LTR元件。研究表明, 植物激素包括IAA、ET、SA、ABA、GA、JA等, 在植物對(duì)多種病原菌和真菌的抗性反應(yīng)中起至關(guān)重要的作用[34]。馬鈴薯s中含有與SA、MeJA、IAA、GA等逆境激素響應(yīng)元件的基因分別為3、1、1和4個(gè), 推測(cè)馬鈴薯s可能通過響應(yīng)不同的激素信號(hào)參與對(duì)病原菌的防衛(wèi)反應(yīng)。而SA和JA在植物抗病中的重要作用已被證實(shí), 為進(jìn)一步驗(yàn)證所預(yù)測(cè)-elements的準(zhǔn)確性和s對(duì)生物脅迫的響應(yīng)情況, 本研究用激素SA和JA對(duì)葉片進(jìn)行了處理, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)s啟動(dòng)子區(qū)域element預(yù)測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確性較高。而當(dāng)塊莖和葉片分別受到干腐病菌和晚疫病菌侵染后,4和8基因的表達(dá)隨著侵染時(shí)間的延長而逐漸增強(qiáng), 推斷這2個(gè)基因在馬鈴薯響應(yīng)病原真菌的過程中起重要的作用, 可作為后續(xù)功能分析的候選基因。

4 結(jié)論

鑒定出8個(gè)馬鈴薯s, 并對(duì)其理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和蛋白功能結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析, 預(yù)測(cè)了s啟動(dòng)子區(qū)域響應(yīng)多種激素和脅迫的調(diào)控元件, 并檢測(cè)了s響應(yīng)馬鈴薯干腐病菌和晚疫病菌侵染的表達(dá)模式, 為后續(xù)研究CRKs感受并傳遞內(nèi)外環(huán)境刺激, 調(diào)控其生理機(jī)能的分子機(jī)制提供了理論基礎(chǔ), 為研究CRKs的功能及其作用機(jī)制提供了參考。

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Genome wide identification and expression analysis of CRK gene family in response to fungal pathogen signals in potato

ZHANG Wei-Na, FAN Yan-Ling, KANG Yi-Chen, YANG Xin-Yu, SHI Ming-Fu, YAO Kai, ZHAO Zhang-Ping, ZHANG Jun-Lian, and QIN Shu-Hao*

College of Horticulture, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, Gansu, China

Cysteine-rich receptor-like kinase (CRK) plays an important role in plant growth and environmental adaptation. In this study, potato CRK () family members were identified, and their physical and chemical characteristics, evolutionary characteristics, subcellular location, chromosome location and expression patterns were analyzed. Eightmembers were identified, with amino acid size from 459 to 686 aa, molecular weight of 50.75–77.50 kD, and isoelectric point of 5.84–8.75.s were mainly located on plasma membrane. CRKs from potato (), apple (Mill), Thale Cress (), rice (), cotton (), banana (), and tomato ()could be divided into nine subgroups, andCRKs were belonged to subgroups I (6 members) and VI (2 members). Moreover,s distributed on chromosomes 2, 3, and 5, contained two tandem repeat gene clusters, including four members. There were many cis-regulated elements in thes promoter region, which mainly respond to hormones, low temperature, defense and stress signals. After inoculating() and(), eight and sixs gene differentially expressed, among them,4and8 had the expression levels by more than eight times. It is speculated that they may respond to multiple fungal signals, and play an important role in potato's broad-spectrum resistance to fungal diseases, and can be used as candidate genes for further needed on disease resistance and functional analysis.

CRK;-elements; bioinformatic analysis;();()

10.3724/SP.J.1006.2020.94096

本研究由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)科建設(shè)基金項(xiàng)目(GAU-XKJS-2018-225), 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31260311), 甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1606RJZA034), 中國博士后科學(xué)基金項(xiàng)目(2012M512042, 2014T70942)和國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(馬鈴薯)建設(shè)專項(xiàng)(CARS-09-P14)資助。

This study was supported by the Discipline Construction Fund Project of Gansu Agricultural University (GAU-XKJS-2018-225), the National Natural Science Foundation of China (31260311), the Natural Science Foundation of Gansu Province (1606RJZA034), the China Postdoctoral Science Foundation (2012M512042, 2014T70942), and the China Agriculture Research System (Potato, CARS-09-P14).

秦舒浩, E-mail: qinsh@gsau.edu.cn

E-mail: 844741204@qq.com

2019-06-28;

2019-12-26;

2020-01-19.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200119.1526.002.html