王曉陽 王麗媛 潘兆娥 何守樸 王 驍 龔文芳,3,* 杜雄明,2,*

亞洲棉短絨突變體纖維發(fā)育及其差異基因表達(dá)分析

王曉陽1王麗媛1潘兆娥1何守樸1王 驍1龔文芳1,3,*杜雄明1,2,*

1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所/ 棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南安陽 455000;2棉花生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鄭州研究基地 / 鄭州大學(xué), 河南鄭州 450001;3中南林業(yè)科技大學(xué) / 經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 湖南長沙 410004

棉花纖維是重要的天然紡織材料, 是最長的單細(xì)胞, 是研究纖維發(fā)育的良好材料。本研究以亞洲棉短絨突變體(FZ)及其野生型()為材料, 結(jié)合掃描電鏡、石蠟切片、RNA-seq技術(shù), 解析棉花短絨起始的可能機(jī)制。與野生型()的0DPA時(shí)期胚珠相比, 突變體的胚珠在該時(shí)期僅有少量的纖維起始。在+3DPA時(shí), 突變體沒有短絨細(xì)胞起始, 僅有長纖維細(xì)胞, 而野生型有大量的短纖維細(xì)胞和長纖維細(xì)胞。對(duì)這2個(gè)材料的0DPA、+3DPA、+5DPA和+8DPA胚珠差異基因分析結(jié)果顯示, 在短絨突變體(FZ)和野生型()的4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期共挖掘出3780個(gè)差異表達(dá)基因, 其中0DPA時(shí)差異基因數(shù)目最少, 隨著胚珠發(fā)育時(shí)間的延長, 差異基因的數(shù)目逐漸增加。KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些基因主要參與蠟質(zhì)、角質(zhì)生物合成, 以及苯丙烷代謝和植物信號(hào)傳導(dǎo)過程。共表達(dá)趨勢(shì)分析顯示, 在突變體+3DPA上調(diào)的差異基因中, 參與離子結(jié)合、MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)、氧化還原活性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的基因表達(dá)受到正影響(表達(dá)水平提高), 造成突變體短絨纖維不能正常起始。這些結(jié)果描述了二倍體亞洲棉短絨起始的動(dòng)態(tài)變化, 可為進(jìn)一步研究棉纖維發(fā)育提供參考。

亞洲棉; 短絨突變體; 差異表達(dá)基因; 共表達(dá)趨勢(shì)

棉花是一種重要的經(jīng)濟(jì)作物, 種子是棉籽油的主要原料, 纖維更是一種重要的天然紡織資源。棉花纖維是高等植物中最長的單細(xì)胞突起, 由棉花胚珠表皮細(xì)胞產(chǎn)生。棉纖維的長度一般為30~40 mm[1]。棉花纖維根據(jù)形態(tài)可以分為長纖維和短絨2種不同的類型。具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的長纖維在開花前0DPA (day post anthesis)發(fā)育, 經(jīng)過快速伸長, 纖維素生物合成和成熟, 最終形成成熟的長纖維, 通過軋花從種皮上收獲并用于紡織產(chǎn)品[2-3]。短絨纖維起始于+3 ~ +5DPA, 長度不到5 mm, 軋花后不能從種皮上分離下來, 緊緊附著于種皮上, 對(duì)種子傳播起重要作用[4]。胚珠上短纖維細(xì)胞和長纖維細(xì)胞的共存現(xiàn)象長期以來一直受到研究者的關(guān)注, 為研究植物細(xì)胞的分化提供了獨(dú)特的模式體系。

棉纖維的發(fā)育受一系列基因調(diào)控, 這些基因與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞能量代謝、脂肪酸代謝、次生代謝等途徑有關(guān)。目前關(guān)于調(diào)控纖維發(fā)育的基因和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的信息還不太清楚。在棉花基因組測(cè)序之前, 許多研究者主要通過基因芯片技術(shù)篩選與棉花纖維發(fā)育有關(guān)的基因, 在分子水平上了解纖維發(fā)育的機(jī)制。如Shi等[5]通過cDNAs芯片分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)了778個(gè)cDNAs優(yōu)先在發(fā)育的纖維中表達(dá)。同年, Yang等[6]通過分析陸地棉及其光子突變體轉(zhuǎn)錄組, 鑒定出了受激素誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子、、在纖維起始過程中高表達(dá)。隨著棉花基因組測(cè)序的完成, 逐步完善了大量的棉花轉(zhuǎn)基因技術(shù), 使得通過轉(zhuǎn)錄組分析與纖維發(fā)育相關(guān)的基因與代謝通路成為可能[7-9]。鑒定出一些與纖維發(fā)育及調(diào)控細(xì)胞壁沉積與強(qiáng)度的候選基因[10]。通過分析0DPA和+10DPA的二倍體亞洲棉近等基因系有短絨無長纖維材料()和既有短絨又有長纖維材料(FL)的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn), 一些參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞能量代謝, 脂肪酸代謝、刺激代謝的轉(zhuǎn)錄因子如、、、、、、、、、和在長纖維突變體+ 10DPA纖維中明顯下調(diào), 植物受體樣激酶(plant receptor-like kinases, RLKs)、富含亮氨酸(Leucine Rich Repeats)的LRR家族蛋白和參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的編碼絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)在突變體中也下調(diào), 導(dǎo)致纖維生長減慢[11]。

雖然上述轉(zhuǎn)錄組分析的研究為棉纖維的起始過程提供了一些研究基礎(chǔ), 但纖維發(fā)育的關(guān)鍵基因的研究仍處于初級(jí)階段, 長纖維和短絨纖維發(fā)育及生理過程仍然不清楚, 并且目前這些轉(zhuǎn)錄組研究主要集中在纖維伸長階段, 關(guān)于短絨纖維起始的動(dòng)態(tài)過程研究較少。

突變體特有的性狀是研究基因表達(dá)的有利資源, 分析植物突變體加速了特定基因功能的發(fā)現(xiàn)。本研究所用的材料為二倍體亞洲棉短絨突變體GA0149有長纖維沒有短絨(其光籽性狀受單基因顯性控制, 基因型為FZ)及其野生型GA0146既有長纖維又有短絨(基因型為), 經(jīng)過連續(xù)十代的自花授粉, 突變體植株光籽性狀穩(wěn)定, 突變體和野生型材料在形態(tài)和發(fā)育上區(qū)別微乎其微, 除了光籽突變體種皮上沒有短絨[8]。利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析突變體和野生型0DPA、+3DPA、+5DPA和+8DPA 4個(gè)時(shí)期的差異基因表達(dá)情況, 旨在探究棉花短絨起始的動(dòng)態(tài)過程及其關(guān)鍵基因, 為棉花短絨起始的分子機(jī)制提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

亞洲棉野生型毛子材料為中美棉D(zhuǎn)PL971 (), 短絨突變體材料為中美棉D(zhuǎn)PL972 (FZ), 均來自棉花種質(zhì)資源中期庫近10年的自交材料。2017年在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所實(shí)驗(yàn)基地, 用標(biāo)準(zhǔn)的田間管理措施, 按3個(gè)重復(fù)種植每個(gè)材料。

1.2 掃描電鏡

將2個(gè)材料(和FZ) 0DPA、+3DPA的胚珠固定于含有2.5%戊二醛的0.1 mol L–1磷酸緩沖液中, 用真空泵抽真空15 min, 使胚珠完全浸沒于固定液中, 4℃過夜后用0.1 mol L–1pH 7.2磷酸緩沖液洗3次, 每次10 min;接著, 用ddH2O清洗2次, 每次30 min; 用30% (v/v)、50% (v/v)、70% (v/v)、80% (v/v)、95% (v/v)乙醇對(duì)樣品梯度脫水, 每個(gè)梯度脫水20 min; 用無水乙醇對(duì)樣品進(jìn)行3次脫水; 再用等體積的乙醇: 乙酸異戊酯置換15 min; 最后用100% 的乙酸異戊酯置換15 min; 將樣品放于樣品籠中用CO2干燥, 然后噴金, 用JSM-6390/LV掃描電鏡觀察。

1.3 石蠟切片

將新鮮的0DPA、+3DPA的胚珠固定于含有4%的FAA (甲醛-冰乙酸-無水乙醇)固定液中, 抽真空, 保存于4℃冰箱中過夜, 用系列梯度濃度的乙醇(50%、70%、85%、95%和100%)對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理, 每梯度30 min; 將脫水處理過的胚珠包埋于處理過的石蠟(Sigma-Aldrich)中, 60℃透蠟2 h; 然后將胚珠放于預(yù)熱的包埋框中, 迅速倒入融化的石蠟, 過夜使石蠟?zāi)獭Ｓ檬炃衅瑱C(jī), 切成8 μm 厚的連續(xù)切片, 移至42℃的水浴中, 使樣品展平, 將切片放在載玻片上, 37℃干燥過夜。用番紅固綠染色, 用帶有數(shù)碼相機(jī)的顯微鏡照相。

1.4 文庫構(gòu)建與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

用北京天根公司的多糖多酚植物總RNA試劑盒提取FZ和0DPA、+3DPA和+5DPA 的胚珠及+8DPA的纖維的RNA。將檢測(cè)質(zhì)量合格的RNA送至北京百邁客生物公司進(jìn)行cDNA文庫的構(gòu)建, 借助 Illumina HiSeq 2000測(cè)序儀進(jìn)行雙末端測(cè)序, 獲得原始數(shù)據(jù)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)的評(píng)估以及分析

將得到的原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為FASTQ形式進(jìn)行保存, 通過fastp軟件過濾掉低質(zhì)量數(shù)據(jù)和接頭序列, 得到高質(zhì)量的reads, 即clean data.利用TopHat2/Bowtie2軟件將 clean reads 比對(duì)到亞洲棉三代基因組上[8,12-13]。同時(shí)對(duì)比對(duì)到參考基因組的序列進(jìn)行注釋, 在比對(duì)過程中, 每個(gè)錯(cuò)配最多允許2個(gè)堿基。采用FPKM值(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)來衡量基因表達(dá)[13]。根據(jù)FPKM值, 以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率FDR<0.01, |log2fold change| ≥ 1,-value<0.01作為篩選突變體和野生型差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)。將獲得的差異基因進(jìn)行GO功能富集分析(WEGO: http://wego.genomics.org.cn/cgi-bin/wego/ index.pl)和KEGG生物通路分析[14-15]。

1.6 熒光定量Q-PCR驗(yàn)證

通過分析RNA-seq數(shù)據(jù), 驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性, 隨機(jī)挑選22個(gè)差異表達(dá)的基因, 利用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證。利用在線軟件NCBI-Primer (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設(shè)計(jì)引物(表1)。分別取不同組織樣品的總RNA 1mg, 利用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit (Perfect real time TaKaRa生物)合成cDNA。利用北京全世金生物公司熒光定量試劑盒(TransStart Top Green qPCR SuperMix), 以UBQ作為內(nèi)參基因, 利用ABI7500fast Real-time PCR System (美國, ABI公司)開展熒光定量PCR驗(yàn)證。每個(gè)基因設(shè)計(jì)3次技術(shù)重復(fù)和3次生物學(xué)重復(fù)。以材料0DPA樣品的基因表達(dá)量作為1, 分析突變體和野生型各個(gè)時(shí)期的基因相對(duì)表達(dá)量, 按2–ΔΔCT法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 二倍體亞洲棉短絨纖維起始的動(dòng)態(tài)學(xué)觀察

前人研究結(jié)果表明, 長纖維細(xì)胞起始于開花當(dāng)天(0DPA), 在纖維發(fā)育早期階段如在+3DPA時(shí), 長纖維已經(jīng)突破表皮細(xì)胞, 長度約為2 mm, 而短纖維細(xì)胞還未突破表皮, 但是胚珠表皮細(xì)胞開始出現(xiàn)排列不規(guī)則現(xiàn)象。為了鑒定野生型毛子和突變體FZ短絨纖維起始的差異, 取這2個(gè)材料的0和+3DPA的胚珠, 用掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 在0DPA時(shí)野生型和突變體都有明顯的纖維突起, 但是野生型纖維明顯長于突變體, 而且纖維數(shù)目多于突變體; 當(dāng)胚珠發(fā)育到+3DPA時(shí),和FZ長纖維長度基本一致, 但纖維數(shù)目多于FZ, 由于胚珠表面長纖維的干擾, 無法觀察到胚珠表面的短纖維(圖1-A)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證短絨在細(xì)胞水平上的突起, 在電子顯微鏡下觀察和FZ 0DPA和+3DPA的胚珠的石蠟切片, 如圖1-B所示,在野生型胚珠表面能觀察到長纖維和短纖維細(xì)胞, 其中紅色箭頭所指位置為長纖維, 而黑色箭頭所指位置為短纖維細(xì)胞。在0DPA時(shí)野生型纖維細(xì)胞開始隆起, 而突變體只有少量突起; 隨著胚珠的發(fā)育和 FZ 突起細(xì)胞數(shù)目都有所增加, 但是在+3DPA時(shí), 短絨纖維開始在胚珠表面出現(xiàn), 而 FZ 胚珠在相同的發(fā)育階段沒有短絨細(xì)胞突起, 表明短纖維細(xì)胞在FZ中起始失敗。

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估

為了進(jìn)一步理解短絨發(fā)育的動(dòng)態(tài)過程和鑒定與短絨發(fā)育相關(guān)的基因, 選取突變體FZ和野生型材料4個(gè)發(fā)育時(shí)期的胚珠和纖維(0DPA、+3DPA、+5 DPA、+8DPA)的RNA, 每個(gè)材料3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 構(gòu)建了24個(gè)RNA文庫。

24個(gè)測(cè)序文庫獲得的約3.2億條原始數(shù)據(jù)經(jīng)去接頭和過濾后, 產(chǎn)生出約1.6億條clean reads。每個(gè)文庫平均得到65,841,318個(gè)高質(zhì)量的reads (表2)。大約有88%的clean reads可成功比對(duì)到已發(fā)表的亞洲棉三代基因組上。比對(duì)到參考基因組上唯一位置和多個(gè)位置的比例分別約為76%~85%、3.53%~6.00%。比對(duì)到基因組正鏈的數(shù)目與比對(duì)到負(fù)鏈的數(shù)目幾乎相當(dāng)。另外每個(gè)樣本的Q30比例均大于86%, GC含量在35%~65%衡量指標(biāo)之間。

圖1 野生型fz和短絨突變體FZ材料中短纖維發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)觀察

Fig. 1 Morphology analysis of fuzz-fiber development in normal wilt-type fz (upper) and fuzz mutant FZ (lower)

A: 野生型、短絨突變體的種子以及掃描電鏡下看到的短絨纖維起始; B: 石蠟切片所示短絨纖維起始。紅色箭頭所示長纖維, 黑色箭頭所示短纖維細(xì)胞。

A: the seeds of wild type, natural fuzz mutant and fuzz fiber initiation under scanning electron microscope; B: paraffin section showing fuzz fiber initiation. Red arrow indicates lint fiber, and black arrow indicates fuzz fiber cells.

圖2 所有樣本間皮爾遜相關(guān)系數(shù)分析

A和B分別代表和FZ。A and B indicateand FZ, respectively.

為了鑒定24個(gè)樣品間的生物學(xué)重復(fù)關(guān)系, 對(duì)各樣本間生物學(xué)重復(fù)數(shù)據(jù)進(jìn)行皮爾遜相關(guān)系數(shù)(Pearson Correlation Coefficient, PCC)分析(圖2), 結(jié)果發(fā)現(xiàn),材料3個(gè)生物學(xué)重復(fù)間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)均大于0.98 (圖2-A), FZ 材料3個(gè)生物學(xué)重復(fù)間的皮爾遜相關(guān)系數(shù)均大于0.94 (圖2-B), 說明這2個(gè)材料不同樣本的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)較好, 可進(jìn)行差異基因表達(dá)分析。

2.3 差異基因表達(dá)分析

計(jì)算FPKM值后, 選擇-value<0.05和|log2(ratio)| ≥1作為篩選差異表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)。通過比較突變體 FZ和野生型材料0、+3、+5、+8DPA的FPKM值, 共鑒定出3784個(gè)差異基因(圖3-A)。其中在vs. FZ 0DPA時(shí)期特異表達(dá)的基因有201個(gè),vs. FZ +3DPA時(shí)期特異表達(dá)的基因有313個(gè),vs. FZ +5DPA特異表達(dá)的基因有1108個(gè),vs. FZ +8DPA時(shí)期特異表達(dá)的基因有1303個(gè)。突變體和野生型4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期發(fā)現(xiàn)91個(gè)共有的差異基因, 這些基因的差異表達(dá)情況見圖3-B和表3, 52個(gè)基因明顯上調(diào), 39個(gè)基因明顯的下調(diào),對(duì)差異基因功能分析發(fā)現(xiàn)一些未知蛋白、轉(zhuǎn)錄因子、乙烯受體和抗病基因都參與了短絨纖維的發(fā)育。

通過比較同一材料不同纖維發(fā)育時(shí)期的差異基因發(fā)現(xiàn)(圖4-A)在材料中, 開花當(dāng)天至+3DPA時(shí)共有2227個(gè)基因上調(diào), 1113個(gè)基因下調(diào); +3DPA至+5DPA時(shí)期, 601個(gè)基因上調(diào), 194個(gè)基因下調(diào); +5DPA至+8DPA時(shí)期2993個(gè)基因上調(diào), 3703個(gè)基因下調(diào)。+3DPA至+5DPA時(shí)期差異基因數(shù)目較少。在FZ材料中, 0到+3DPA時(shí)期, 2420個(gè)基因發(fā)生了上調(diào), 下調(diào)基因的數(shù)目是1201; +3DPA到+5DPA時(shí)期, 611個(gè)基因上調(diào), 753個(gè)基因下調(diào); +5DPA到+8DPA時(shí)期, 5465個(gè)基因上調(diào), 6686個(gè)基因下調(diào)。

比較突變體FZ和野生型同一纖維時(shí)期的差異基因(圖4-A, B)表明, 在開花當(dāng)天與野生型材料相比,突變體中341個(gè)基因上調(diào), 174個(gè)基因下調(diào); 在+3DPA時(shí), 突變體中612個(gè)基因上調(diào), 下調(diào)基因數(shù)目170; 在+5DPA時(shí)期, 突變體中發(fā)生了1018個(gè)基因上調(diào), 下調(diào)基因數(shù)目為802個(gè); 在+8DPA時(shí)期, 1230個(gè)基因下調(diào), 641個(gè)基因上調(diào); 突變體中在短絨起始期上調(diào)基因的數(shù)目多于下調(diào)基因的數(shù)目, 這些結(jié)果證明大部分基因負(fù)調(diào)控短絨纖維的起始。

2.4 與短絨起始相關(guān)的差異基因KEGG通路分析

通過對(duì)2個(gè)材料4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期的差異基因KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析(圖4-C)發(fā)現(xiàn), 40個(gè)基因參與到植物-病原菌互作過程; 20個(gè)基因參與到精氨酸和脯氨酸代謝過程; 52個(gè)基因參與到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上蛋白加工過程; 30個(gè)基因涉及到苯丙烷代謝過程; 17個(gè)基因涉及到角質(zhì)、木質(zhì)素和蠟質(zhì)生物合成過程; 44個(gè)基因參與到苯丙烷生物合成過程; 92個(gè)基因匯集到植物激素信號(hào)傳導(dǎo)過程。對(duì)KEGG途徑富集因子較高的植物激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的苯丙烷生物合成途徑和角質(zhì)木質(zhì)素以及蠟質(zhì)生物合成途徑的差異基因進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)(表4和表5), 26個(gè)差異基因與生長素響應(yīng)以及生物合成有關(guān), 與野生型()相比, 突變體(FZ)大部分基因在+5DPA時(shí)上調(diào), 在+8DPA時(shí)下調(diào), 在+3DPA時(shí)基因表達(dá)差異不明顯, 表明生長素(IAA)對(duì)短絨的起始沒有影響, 對(duì)短絨纖維的伸長起正調(diào)控作用; 12個(gè)基因參與脫落酸(ABA)和乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程, 如乙烯響應(yīng)因子和脫落酸受體, 這些基因在短絨纖維起始時(shí)期+5DPA突變體中顯著上調(diào),基因差異倍數(shù)達(dá)到15以上, 而這些基因在纖維伸長時(shí)期+8DPA突變體中下調(diào), 這些結(jié)果說明棉花體內(nèi)過量的ABA和乙烯抑制纖維的發(fā)育, 而少量的乙烯能促進(jìn)纖維伸長。參與角質(zhì)、軟木質(zhì)、蠟質(zhì)生物合成途徑的基因有8個(gè), 主要是細(xì)胞色素氧化酶P450和脂肪酸羥化酶(表4); 參與苯丙烷代謝和生物合成途徑有關(guān)的基因有23個(gè), 大部分為過氧化物酶以及2個(gè)苯丙氨酸裂合酶、3個(gè)甲基轉(zhuǎn)移酶和1個(gè)花青素葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶, 說明這些基因與短絨纖維的起始和發(fā)育有關(guān)。

圖3 fz及其短絨突變體FZ不同纖維發(fā)育時(shí)期共有的差異基因

A: 在和FZ材料中不同纖維發(fā)育時(shí)期差異基因韋恩圖; B: 在和FZ兩個(gè)材料中4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期91個(gè)共有的差異基因熱圖。

: Venn diagram of significant DEGs found inand FZ across various fiber development stages; B: Heatmap showing 91 common significant DEGs inand FZ across fiber development stages.

圖4 fz及其短絨突變體FZ不同纖維發(fā)育時(shí)期差異基因概況

A: 在和FZ材料中不同纖維發(fā)育時(shí)期差異基因數(shù)目; 紅色代表上調(diào)的基因, 綠色代表下調(diào)基因。B: 1783個(gè)差異基因在和FZ材料4個(gè)短絨纖維發(fā)育時(shí)期的表達(dá)趨勢(shì)。C:和FZ材料4個(gè)短絨纖維發(fā)育時(shí)期差異基因KEGG 富集通路。

A: number of genes differentially expressed during fiber development within and betweenand FZ; Red represent up-regulated, green represent down-regulated gene. B: the expression trends of 1783 DEGs inand FZ across fiber development stages; C: the DEGs KEGG pathway inand FZ across fiber development stages.

表3 在fz和FZ兩個(gè)材料中4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期91個(gè)共有的差異基因及其表達(dá)情況

(續(xù)表3)

(續(xù)表3)

2.5 差異基因共表達(dá)趨勢(shì)分析

為了研究野生型()和短絨突變體(FZ)的差異基因在胚珠和纖維中的表達(dá)情況, 對(duì)2個(gè)材料4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期的3784個(gè)差異基因繪制時(shí)空表達(dá)模式圖(圖5-A), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)3784個(gè)基因在2個(gè)材料4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期可以劃分為9組(cluster), 同一組的基因有相同的表達(dá)趨勢(shì)。clusters 1和2的基因在突變體(FZ)的開花當(dāng)天表達(dá)高, 主要參與應(yīng)答脅迫反應(yīng)以及能量傳遞過程; clusters 4、5和7的基因在突變體的+3DPA表達(dá)高, 主要參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控和鈣離子, 鐵離子, 銅離子的結(jié)合; clusters 6 和8的基因在突變體材料開花后5 d表達(dá)高, 也主要涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控, 鈣離子, 鐵離子和銅離子的結(jié)合過程; clusters 3和9的基因主要在突變體+8DPA表達(dá)高, 主要參與水解酶活性, 轉(zhuǎn)運(yùn)活性, 核酸激活, 脂肪酸生物合成途徑和ATP結(jié)合過程(圖5-B)。

表4 角質(zhì)、軟木質(zhì)、蠟質(zhì)生物合成途徑以及苯丙烷代謝途徑的差異基因及其表達(dá)情況

表5 植物激素轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的差異基因及其表達(dá)情況

圖5 差異基因共表達(dá)趨勢(shì)

A: 在和FZ兩個(gè)材料中4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期所有差異表達(dá)基因的熱圖分析。B: 差異基因功能注釋; 黑色代表0DPA時(shí)期高表達(dá)的基因, 藍(lán)色代表+3DPA時(shí)期高表達(dá)的基因, 橙色代表+5DPA時(shí)期高表達(dá)的基因, 綠色代表+8DPA時(shí)期高表達(dá)的基因。

A: heatmap analysis of the expression of all significant DEGs betweenand FZ at four time points. B: functional annotations of significant DEGs; Black bars indicate genes highly expressed at 0DPA, blue bars indicate genes highly expressed at +3DPA, orange bars indicate genes highly expressed at +5DPA, and green bars indicate genes highly expressed at +8DPA.

2.6 陸地棉控制短絨基因在亞洲棉短絨突變體FZ及其野生型fz的表達(dá)分析

前人通過圖位克隆, 在四倍體陸地棉中分別定位出了一個(gè)控制短絨發(fā)育和長纖維發(fā)育的基因, 即MYBMIXTA-like轉(zhuǎn)錄因子和;在TM-1短絨起始期表達(dá)量明顯高于其在短絨突變體中的表達(dá)量;在僅有長纖維的短絨突變體纖維起始期的表達(dá)量明顯高于其在陸無絮中的表達(dá)量[17-18]。為了驗(yàn)證和在亞洲棉短絨突變體FZ和其野生型中的表達(dá)量, 將這2個(gè)基因的蛋白序列在亞洲棉中進(jìn)行同源性比對(duì)(圖6)表明,和在亞洲棉中為同一個(gè)基因, 基因功能注釋顯示該基因?qū)儆贛YB類轉(zhuǎn)錄因子, 其相似性達(dá)到97%。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析表明,在FZ材料短絨起始期表達(dá)量高于其在材料中的表達(dá)量(圖7), 說明可能負(fù)調(diào)控短絨發(fā)育。

2.7 差異基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性, 隨機(jī)選擇22個(gè)差異基因在2個(gè)材料+3DPA胚珠中進(jìn)行熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示, RNA-seq結(jié)果與熒光定量PCR中的基因表達(dá)變化一致。通過單樣本檢驗(yàn), 野生型+3DPA胚珠中22個(gè)差異基因表達(dá)量與突變體FZ胚珠中表達(dá)量有顯著差異。將qRT-PCR和RNA-seq中差異基因表達(dá)量經(jīng) log2轉(zhuǎn)化后做相關(guān)性分析, 所得的皮爾遜相關(guān)系數(shù)為0.89 (圖8), 證明RNA-Seq結(jié)果可信。

圖6 MYBMIXTA-like基因在亞洲棉中的同源序列比對(duì)

圖7 Ga12G1199在FZ和fz材料中的表達(dá)差異

*< 0.05, **< 0.01, ****< 0.0001.

經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證, 細(xì)胞色素氧化酶P450 ()、甲基轉(zhuǎn)移酶()、轉(zhuǎn)錄因子WD40()、蛋白受體激酶()、二氫黃酮醇-4-還原酶()和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶()在突變體FZ中上調(diào); 分子伴侶()、鈣聯(lián)蛋白()、轉(zhuǎn)錄因子MYB108()、網(wǎng)狀蛋白()和NADH脫氫酶()在突變體材料中下調(diào)。

3 討論

棉纖維起始是決定纖維產(chǎn)量的關(guān)鍵過程。在過去的10年中, 許多參與棉纖維發(fā)育的基因已經(jīng)被鑒定出來。相比之下, 對(duì)于野生型種皮上的短絨發(fā)育了解比較少。長纖維在生產(chǎn)上主要用于紡織, 短纖維在生產(chǎn)上主要用于火藥、造紙和醫(yī)藥用品, 由于短纖維一些特有性質(zhì)和價(jià)值, 吸引了一些科學(xué)家研究其發(fā)育機(jī)制[19]。

圖8 RT-QPCR (X-軸)結(jié)果與RNA-seq (Y-軸)差異基因相關(guān)性分析

散點(diǎn)圖代表RT-QPCR與RNA-seq的差異基因相對(duì)表達(dá)量的log2值。

Scatter plots represent log2expression ratios calculated from RT- QPCR and RNA-seq.

植物激素例如赤霉素(GA)、生長素、細(xì)胞分裂素、油菜素內(nèi)酯(BR)、脫落酸(ABA)、乙烯、茉莉酸甲酯(JA)和水楊酸是植物內(nèi)源小信號(hào)分子[20]。許多研究證明生長素在纖維發(fā)育過程中起重要作用。外源補(bǔ)充吲哚乙酸(IAA)能彌補(bǔ)纖維伸長的缺陷性, 并且能顯著增加纖維的總體積[21]。生長素響應(yīng)蛋白GhARF2和GhARF18, 在纖維起始的細(xì)胞中表達(dá)高, 當(dāng)把這2個(gè)生長素響應(yīng)蛋白在擬南芥中超表達(dá)后, 能顯著促進(jìn)擬南芥表皮毛起始, 說明GhARF2和GhARF18正調(diào)控棉花纖維細(xì)胞起始[22]。與和作用相反, INDOLEACETIC()負(fù)調(diào)控纖維的起始和伸長。在野生型胚珠中表達(dá)非常低, 然而在無短絨無長纖維突變體中轉(zhuǎn)錄水平在開花后急劇升高[23], 這與本研究結(jié)果一致。在短絨突變體+5DPA的表達(dá)量比野生型的高4倍。前人研究顯示向體外離體培養(yǎng)的胚珠中加入ABA, 纖維細(xì)胞的起始受到抑制, 而且突變體0DPA的胚珠中積累ABA的量比野生型的高[24]。這些結(jié)果說明ABA負(fù)調(diào)控棉花纖維起始。本研究結(jié)果顯示, 與ABA信號(hào)傳遞相關(guān)的基因表達(dá)量在突變體中明顯升高, 與纖維起始呈負(fù)相關(guān)的植物激素ABA響應(yīng)因子(、)在突變體短絨起始期也顯著的上調(diào), 進(jìn)而抑制了短絨纖維的起始。這些轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

最近研究顯示, 植物體內(nèi)信號(hào)分子, 如鈣離子(Ca2+)和活性氧(ROS), 特別是超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)參與棉花纖維發(fā)育。當(dāng)用H2O2處理光子突變體()和短絨突變體()時(shí), 突變體纖維在0DPA時(shí)開始起始, 說明ROS對(duì)纖維起始具有促進(jìn)作用[25]。本研究顯示參與活性氧清除的谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)基因在突變體FZ短絨起始期明顯升高。Ca2+也參與棉纖維細(xì)胞的起始, 與–1DPA的胚珠相比, 0DPA的胚珠中鈣離子的積累明顯升高, 基因芯片分析結(jié)果顯示, 參與鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因鈣結(jié)合蛋白在+1DPA胚珠中表達(dá)量明顯上調(diào)[26]。鈣調(diào)蛋白(CBL)在Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起重要作用, 其表達(dá)量在短絨突變體胚珠中下調(diào)了2倍, 與前人結(jié)果一致。Ca2+正調(diào)控纖維起始[27-28]。

前人研究結(jié)果顯示,()基因正調(diào)控陸地棉短絨纖維起始, 而基因正調(diào)控陸地棉長纖維起始[17-18]。而這2個(gè)基因在亞洲棉中的同源基因在短絨突變體中的表達(dá)量明顯高于其在野生型中的表達(dá)量, 該基因可能負(fù)調(diào)控短絨的發(fā)育。造成這種現(xiàn)象的原因可能是陸地棉和亞洲棉短絨發(fā)育機(jī)制不一樣。

本文通過短絨突變體及其野生型4個(gè)纖維發(fā)育時(shí)期的RNA-Seq測(cè)序數(shù)據(jù)分析篩選到4988個(gè)差異表達(dá)的基因, 其中上調(diào)表達(dá)的2612個(gè), 下調(diào)表達(dá)的2376個(gè), 但僅21.5%的基因在棉花基因組數(shù)據(jù)庫中找到注釋信息, 有大量未知基因信息存在。參與KEGG排名前5富集通路的基因, 如參與角質(zhì)、木質(zhì)素和蠟質(zhì)合成過程的基因(, 細(xì)胞色素氧化酶)在突變體(FZ)中下調(diào), 說明這些基因可能正調(diào)控短絨的發(fā)育; 參與苯丙烷代謝和生物合成過程的基因(、, 過氧化物酶)在FZ中明顯上調(diào), 說明這些基因可能負(fù)調(diào)控短絨發(fā)育; 參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的乙烯響應(yīng)因子相關(guān)基因(、、和)以及ABA合成和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(、、、和)在FZ短絨起始期+5DPA明顯上調(diào), 說明這些基因可能負(fù)調(diào)控短絨發(fā)育。在91個(gè)共有的差異基因中,與轉(zhuǎn)座現(xiàn)象相關(guān)的基因copia型多蛋白, 轉(zhuǎn)錄因子NAC1(), 以及氧化還原相關(guān)基因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶()在FZ中明顯上調(diào), 說明這些基因可能負(fù)調(diào)控短絨發(fā)育; 而NADPH脫氫酶()基因, 與鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因()在FZ中下調(diào), 說明這些基因正調(diào)控短絨發(fā)育。

4 結(jié)論

短絨突變體(FZ)及其野生型()的表型差異為闡明調(diào)控棉纖維發(fā)育的機(jī)制和品系間的形態(tài)差異提供了信息。短絨的起始在+3DPA。造成短絨纖維細(xì)胞在突變體中未起始的原因是, 一些促進(jìn)纖維伸長的基因下調(diào), 而另外一些抑制纖維起始的基因上調(diào)。例如參與蠟質(zhì)合成的基因以及Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在突變體中都下調(diào); 清除活性氧的基因以及參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因在突變體中上調(diào)。該研究對(duì)于理解亞洲棉短絨纖維起始的機(jī)制具有一定的理論意義, 對(duì)于提高棉纖維產(chǎn)量和品質(zhì)具有重要的實(shí)踐意義。

[1] Lee J J, Woodward A W, Chen Z J. Gene expression changes and early events in cotton fibre development.,2007, 100: 1391–1401.

[2] Kim H J, Triplett B A. Cotton fiber growth in planta and. Models for plant cell elongation and cell wall biogenesis., 2001, 127: 1361–1366.

[3] Turley R B, Kloth R H. Identification of a third fuzzless seed locus in upland cotton (L.).,2002, 93: 359–364.

[4] Arpat A B, Waugh M, Sullivan J P, Gonzales M, Frisch D, Main D, Wood T, Leslie A, Wing R A, Wilkins T A. Functional genomics of cell elongation in developing cotton fibers.,2004, 54: 911–929.

[5] Shi Y H, Zhu S W, Mao X Z, Feng J X, Qin Y M, Zhang L, Cheng J, Wei L P. Transcriptome profiling, molecular biological, and physiological studies reveal a major role for ethylene in cotton fiber cell elongation., 2006, 18: 651–664.

[6] Yang S S, Cheung F, Lee J J, Ha M, Wei N E, Sze S H, Stelly D M, Thaxton P, Triplett B, Town C DAccumulation of genome-specific transcripts, transcription factors and phytohormonal regulators during early stages of fiber cell development in allotetraploid cotton.,2006, 47: 761–775.

[7] Wang M J, Tu L L, Yuan D J, Zhu D, Shen C, Li J Y, Liu F Y, Pei L L, Wang P C, Zhao G N,Ye Z X, Huang H, Yan F L, Ma Y Z, Zhang L, Liu M, You J Q, Yang Y C, Liu Z P, Huang F, Li B Q, Qiu P, Zhang Q H, Zhu L F, Jin S X, Yang X Y, Min L, Li G L, Chen L L, Zheng H K, Lindsey K, Lin Z X, Udall J A, Zhang X L. Reference genome sequences of two cultivated allotetraploid cottons,and.,2018, 51: 224–229.

[8] Du X, Huang G, He S, Yang Z, Sun G, Ma X, Li N, Zhang X, Sun J, Liu M, Jia Y, Pan Z, Gong W, Liu Z, Zhu H, Ma L, Liu F, Yang D, Wang F, Fan W, Gong Q, Peng Z, Wang L, Wang X, Xu S, Shang H, Lu C, Zheng H, Huang S, Lin T, Zhu Y, Li F. Resequencing of 243 diploid cotton accessions based on an updated a genome identifies the genetic basis of key agronomic traits.,2018, 50: 796–802.

[9] Zhang T, Hu Y, Jiang W, Fang L, Guan X, Chen J, Zhang J, Saski C A, Scheffler B E, Stelly D M, Hulse-Kemp A M, Wan Q, Liu B, Liu C, Wang S, Pan M, Wang Y, Wang D, Ye W, Chang L, Zhang W, Song Q, Kirkbride R C, Chen X, Dennis E, Llewellyn D J, Peterson D G, Thaxton P, Jones D C, Wang Q, Xu X, Zhang H, Wu H, Zhou L, Mei G, Chen S, Tian Y, Xiang D, Li X, Ding J, Zuo Q, Tao L, Liu Y, Li J, Lin Y, Hui Y, Cao Z, Cai C, Zhu X, Jiang Z, Zhou B, Guo W, Li R, Chen Z J. Sequencing of allotetraploid cotton (L. acc. TM-1) provides a resource for fiber improvement.,2015, 33: 531–537.

[10] Islam M S, Fang D D, Thyssen G N, Delhom C D, Liu Y L, Kim H J. Comparative fiber property and transcriptome analyses reveal key genes potentially related to high fiber strength in cotton (L.) line MD52ne.,2016, 16: 1–19.

[11] Hande A S, Katageri I S, Jadhav M P, Adiger S, Gamanagatti S, Padmalatha K V, Dhandapani G, Kanakachari M, Kumar P A, Reddy V S. Transcript profiling of genes expressed during fibre development in diploid cotton (L.).,2017, 18: 675.

[12] Trapnell C, Pachter L, Salzberg S L. TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.,2009, 25: 1105–1111.

[13] Cole T, Adam R, Loyal G, Geo P, Daehwan K, Kelley D R, Harold P, Salzberg S L, Rinn J L, Lior P. Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.,2012, 7: 562–578.

[14] Ogata H, Goto S, Sato K, Fujibuchi W, Bono H, Kanehisa M. KEGG: Kyoto encyclopedia of genes and genomes.,1999, 27: 29–34.

[15] Minoru K, Susumu G, Yoko S, Masayuki K, Miho F, Mao T. Data, information, knowledge and principle: back to metabolism in KEGG.,2014, 42: 199–205.

[16] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.,2001, 25: 402–408.

[17] Wan Q, Guan X Y, Yang N N, Wu H T, Pan M Q. Small interfering RNAs from bidirectional transcripts ofregulate cotton fiber development., 2016, 210: 1298–1310.

[18] Wu H T, Tian Y, Wan Q, Fang L, Guan X Y, Chen J D. Genetics and evolution of MIXTA genes regulating cotton lint fiber development., 2018, 217: 883–895.

[19] Du S J, Dong C J, Zhang B, Lai T F, Du X M, Liu J Y. Comparative proteomic analysis reveals differentially expressed proteins correlated with fuzz fiber initiation in diploid cotton (L.).,2013, 82: 113–129.

[20] Daviere J M, Achard P. A pivotal role of DELLAs in regulating multiple hormone signals.,2016, 9: 10–20.

[21] Chen Z J, Guan X Y. Auxin boost for cotton.2011, 29.

[22] Xiao G H, He P, Zhao P, Liu H, Zhang L, Pang C, Yu J. Genome-wide identification of thegene family reveals thatandare involved in cotton fibre cell initiation.,2018, 69: 4323–4337.

[23] Han, X Cloning and expression analysis of novel Aux/IAA fa-mily genes in.,2012, 503: 83–91.

[24] Gilbert M K, Bland J M, Shockey J M, Cao H, Hinchliffe D J, Fang D D, Naoumkina M. A transcript profiling approach reveals an abscisic acid-specific glycosyltransferase (UGT73C14) induced in developing fiber of ligon lintless-2 mutant of cotton (L.).,2013, 8.

[25] Zhang D Y, Zhang T Z, Guo W Z. Effect of H2O2on fiber initiation using fiber retardation initiation mutants in cotton ().,2010, 167: 393–399.

[26] Taliercio E W, Boykin D. Analysis of gene expression in cotton fiber initials.,2007, 7: 22.

[27] Kudla J, Batistic O, Hashimoto K. Calcium signals: the lead currency of plant information processing.,2010, 22: 541–563.

[28] Steinhorst L, M?hs A, Ischebeck T, Zhang C X, Zhang X X, Arendt S, Schültke S, Heilmann I, Kudla J. Vacuolar CBL- CIPK12 Ca2+-sensor-kinase complexes are required for polarized pollen tube growth.,2015, 25: 1475–1482.

Analysis of differentially expressed genes and fiber development infuzzless mutant

WANG Xiao-Yang1, WANG Li-Yuan1, PAN Zhao-E1, HE Shou-Pu1, WANG Xiao1, GONG Wen-Fang1,3,*, and DU Xiong-Ming1,2,*

1Institute of Cotton Research, Chinese Academy of Agricultural Sciences / State Key Laboratory of Cotton Biology, Anyang 455000, Henan, China;2Zhengzhou Research Base, State Key Laboratory of Cotton Biology / Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan, China;3Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-wood Forest, Ministry of Education / Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China

Cotton fiber, one of main nature textile and longest single cell, is a good material for researching the cotton fiber development. In this study, fuzz mutant (FZ) and wild-type () which belong to diploidspecies were used for unraveling molecular mechanism of fuzz fiber initiation by scanning electron microscopy (SEM), paraffin section and RNA sequencing technology. It was found that any fibers scarcely initiated on the ovule surface of the mutant at 0DPA, compared with that of the wild-type. Only lint fiber cells emerged on the ovule surface of fuzz mutant, while abundant fuzz and lint fiber cells appeared in wild-type at +3DPA stage. The transcriptome analysis of FZ andacross the four fiber development stages (0DPA, +3DPA, +5DPA, and +8DPA) indicated that the number of differentially expressed gene was 3780. There were litter differentially expressed genes at 0DPA in FZ and. In the proceed of ovule development, the number of differentially expressed genes was increased gradually. The KEGG enriched pathway analysis illustrated that these differentially expressed genes were involved in cutin, suberine and wax biosynthesis, phenylalanine metabolism pathways and plant hormone signal transduction pathways. The analysis of co-expressed gene trend lines indicated that the up-regulated genes in mutant at +3DPA were all involved in metal ion binding, MAPK cascade, oxidoreductase activity and transcription regulation, resulting in failed fuzz fiber cells initiation in mutant. These findings elaborated a dynamic variation about fuzz fiber initiation in diploid, which provides a reference for further research in the cotton fiber development.

;fuzzless mutant; differentially expressed gene; co-expressed trend

10.3724/SP.J.1006.2020.94133

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31601353)和國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0101601-03)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31601353) and the National Key Technology R&D Program (2017YFD0101601-03).

杜雄明, E-mail: dxm630723@163.com; 龔文芳, E-mail: gwf018@126.com

E-mail: wangxiaoyang198806@126.com

2019-09-02;

2019-12-26;

2020-01-15.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20200115.1132.018.html