郭延兵，姚慶和，王新軍

·論著·

miR-495-3p通過調(diào)控HDAC9表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應的影響

郭延兵，姚慶和，王新軍

471009 洛陽，鄭州大學附屬洛陽中心醫(yī)院神經(jīng)外科（郭延兵、姚慶和）；470000，鄭州大學第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科（王新軍）

探討微小 RNA-495-3p（miR-495-3p）對缺氧/復氧（H/R）誘導的神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應的影響及機制。

體外培養(yǎng)神經(jīng)母細胞瘤細胞 SK-N-SH，建立 H/R 損傷細胞模型。實驗分組：Con 組、H/R 組、H/R + miR-NC 組、H/R + miR-495-3p 組、H/R + si-NC 組、H/R + si-HDAC9 組、H/R + miR-495-3p + pcDNA 組、H/R + miR-495-3p + pcDNA-HDAC9 組。采用qRT-PCR與Western blot分別檢測細胞中 miR-495-3p、組蛋白去乙?；?9（HDAC9）的表達；采用膜聯(lián)蛋白 V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）雙染法檢測細胞凋亡情況；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素 6（IL-6）水平；雙熒光素酶報告基因檢測 miR-495-3p 與 HDAC9 的靶向關(guān)系；Western blot 檢測 B 淋巴細胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bax）、B 淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達水平。

與 Con 組比較，H/R 組神經(jīng)細胞中 miR-495-3p 的表達水平顯著降低（< 0.05），HDAC9 的表達水平顯著升高（< 0.05）；H/R 處理后細胞凋亡率升高（< 0.05），細胞中 Bax 蛋白表達水平升高（< 0.05），TNF-α、IL-1β、IL-6 水平升高（< 0.05），而 Bcl-2 蛋白表達水平降低（< 0.05）；miR-495-3p 過表達或抑制 HDAC9 表達后細胞凋亡率降低（< 0.05），Bax 蛋白表達水平降低（< 0.05），TNF-α、IL-1β、IL-6 水平降低（< 0.05），而 Bcl-2 蛋白表達水平升高（< 0.05）；miR-495-3p 可靶向結(jié)合到 HDAC9 的 3′UTR 區(qū)，并下調(diào) HDAC9 的表達；HDAC9 過表達可逆轉(zhuǎn) miR-495-3p 過表達對 H/R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡及炎癥因子表達水平的抑制作用。

miR-495-3p 可通過靶向下調(diào) HDAC9 的表達抑制 H/R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡及抑制炎性因子的產(chǎn)生進而對神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。

miR-495-3p； HDAC9； 缺氧/復氧； 神經(jīng)細胞； 凋亡； 炎癥

缺氧缺血引起的腦組織功能損傷是常見病理過程，腦組織缺氧缺血可促使神經(jīng)功能障礙，研究表明神經(jīng)細胞凋亡、炎癥反應是引起神經(jīng)功能障礙的重要原因[1]。微小 RNA（microRNA，miRNA）是一種內(nèi)源性非編碼小 RNA，miRNA 可參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡等多種生理過程，還可參與多種疾病發(fā)生及發(fā)展過程[2]。既往研究顯示部分 miRNA 在腦組織中異常表達，并可參與神經(jīng)細胞凋亡等過程[3-4]。但關(guān)于其具體作用機制尚未完全闡明。研究表明微小 RNA-495-3p（microRNA-495-3p，miR-495-3p）在脂多糖刺激的人牙周膜細胞（hPDLC）中表達下調(diào)，miR-495-3p 過表達可抑制炎癥因子的產(chǎn)生進而減緩疾病進展[5]。但 miR-495-3p 對神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應的影響尚未可知。TargetScan 預測顯示組蛋白去乙?；?9（histone deacetylases 9，HDAC9）可能是 miR-495-3p 的靶基因，研究表明 HDAC9 在 ox-LDL 誘導的內(nèi)皮細胞凋亡中表達上調(diào)[6]。相關(guān)報道指出 HDAC9 在神經(jīng)元細胞損傷中高表達，下調(diào) HDAC9 的表達可減少神經(jīng)細胞凋亡[7]。但 miR-495-3p 是否可通過調(diào)控 HDAC9 的表達從而影響神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應尚未可知。本研究通過體外建立缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）神經(jīng)細胞損傷模型，探討 miR-495-3p 對神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應的影響及其機制，為明確腦缺氧神經(jīng)損傷發(fā)生機制及 miR-495-3p 在神經(jīng)細胞損傷中的作用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

神經(jīng)母細胞瘤細胞 SK-N-SH 購自美國 ATCC公司；RPMI1640 培養(yǎng)基購自上海康朗生物科技有限公司；miR-495-3p 模擬物（mimics）及陰性對照（miR-NC）、HDAC9 小干擾 RNA（si-HDAC9）、亂序無意義陰性對照序列（si-NC）、miR-495-3p 特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-495-3p）及其陰性對照（anti-miR-NC）均購自廣州銳博生物科技有限公司；pcDNA3.1 購自上海索寶生物科技有限公司；Lipofectamine2000 購自上海陽光生物科技有限公司；膜聯(lián)蛋白 V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細胞凋亡試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄及熒光定量 PCR 試劑均購自美國 Thermo Fisher 公司；TNF-α、IL-1β、IL-6 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；RIPA 裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒、增強型化學發(fā)光試劑（electrochemiluminescence，ECL）均購自美國 Sigma 公司；兔抗鼠 HDAC9 抗體購自北京百奧萊博科技有限公司；兔抗鼠 B 淋巴細胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、B 淋巴細胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體購自美國 Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 缺氧/復氧（H/R）模型建立 SK-N-SH 細胞培養(yǎng)于含有 10% 胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基，置于 37 ℃、體積分數(shù) 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，待細胞穩(wěn)定傳代 3 ~ 5 代后收集對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。采用 95% N2-5% CO2混合氣體飽和 15 min 培養(yǎng)基，置于缺氧盒內(nèi)并充入 95% N2-5% CO2混合氣體（1 L/min 流速），出口氧氣濃度達到 1% 時停止通氣，閉緊進氣管與出氣管，缺氧環(huán)境培養(yǎng) 4 h，棄缺氧液后加入新鮮培養(yǎng)基，置于 37 ℃、體積分數(shù) 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)2 h 復氧，建立 H/R 損傷細胞模型[8]。

1.2.2 實驗分組 取對數(shù)生長期 SK-N-SH 細胞，按照隨機數(shù)字表法隨機分為 Con 組（正常培養(yǎng)的 SK-N-SH 細胞）、H/R 組（缺氧/復氧處理的 SK-N-SH 細胞）、H/R + miR-NC 組（miR-NC 轉(zhuǎn)染至SK-N-SH 細胞 48 h 后進行缺氧/復氧處理）、H/R + miR-495-3p 組（miR-495-3p mimics 轉(zhuǎn)染至 SK-N-SH 細胞 48 h 后進行缺氧/復氧處理）、H/R + si-NC 組（si-NC 轉(zhuǎn)染至 SK-N-SH 細胞 48 h 后進行缺氧/復氧處理）、H/R + si-HDAC9 組（si-HDAC9 轉(zhuǎn)染至 SK-N-SH 細胞 48 h 后進行缺氧/復氧處理）、H/R + miR-495-3p + pcDNA組（miR-495-3p mimics 與 pcDNA 共轉(zhuǎn)染至 SK-N-SH 細胞 48 h后進行缺氧/復氧處理）、H/R + miR-495-3p + pcDNA-HDAC9 組（miR-495-3p mimics 與 pcDNA-HDAC9 共轉(zhuǎn)染至 SK-N-SH 細胞 48 h 后進行缺氧/復氧處理），嚴格按照 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑說明書進行操作。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測細胞miR-495-3p、HDAC9 mRNA 表達水平 各組對數(shù)生長期細胞，RNA 提?。杭尤?Trizol 裂解細胞提取細胞總 RNA，冰上孵育 5 min，加入 200 μl 氯仿，室溫放置 5 min，經(jīng) 12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 15 min，吸取水相層，加入 500 μl 異丙醇，室溫放置 20 min，12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 15 min，棄上清，加入 75% 乙醇混合，12 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 5 min，棄上清，RNA 沉積于管底，置于超凈工作臺晾干，加入適量無 RNA 酶水，利用紫外分光光度計檢測 RNA 濃度，置于–80 ℃超低溫冰箱保存。反轉(zhuǎn)錄：按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒將總 RNA 合成 cDNA。miR-495-3p 正向引物5' ACACTCCAGCTGGGAA ACAAACATGGTGCA 3'，反向引物5' TGGTGTCG TGGAGTCG 3'；U6 正向引物 5' CTCGCTTCGGC AGCACA 3'，反向引物5' AACGCTTCACGAATT TGCGT 3'；HDAC9 正向引物5' GCAACTCCGAC ATCGGTAAG 3'，反向引物 5' GCCCAAGGACATC GAGTTT 3'；GAPDH 正向引物 5' AACGGATTTG GTCGTATTG 3'，反向引物5' GGAAGATGGTGAT GGGATT 3'，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。qRT-PCR 反應：根據(jù)試劑盒說明書配置反應體系，置于實時熒光定量 PCR 儀檢測各基因 Ct 值，反應條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循環(huán) 40 次。miR-495-3p 以 U6 為內(nèi)參，HDAC9 以 GAPDH 為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt法計算 miR-495-3p、HDAC9 mRNA 相對表達量。

1.2.4 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組細胞，PBS 洗滌，胰蛋白酶消化，1000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 5 min，加入 PBS 洗滌，加入 1 ml 結(jié)合緩沖液，1000 r/min 轉(zhuǎn)速離心 5 min，加入 200 μl 結(jié)合緩沖液，加入 5 μl Annexin V-FIT 與 5 μl PI，室溫避光孵育 20 min，加入 400 μl 結(jié)合緩沖液置于流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.5 酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測炎癥因子表達水平 采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測各組細胞培養(yǎng)液中炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 的水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測 TargetScan 預測顯示 miR-495-3p 與 HDAC9 的 3'UTR 存在結(jié)合位點，將含有結(jié)合位點與突變位點的 HDAC9-3'UTR片段分別插入熒光素酶報告基因載體構(gòu)建野生型載體 WT-HDAC9 與突變型載體 MUT-HDAC9，取生長狀態(tài)良好的 SK-N-SH 細胞，分別將WT-HDAC9、MUT-HDAC9 與 miR-NC、miR-495-3p mimics 共轉(zhuǎn)染至 SK-N-SH 細胞，置于 37 ℃、體積分數(shù) 5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，檢測各組細胞熒光素酶活性。

1.2.7 蛋白免疫印跡檢測HDAC9、Bax、Bcl-2 蛋白表達 取各組對數(shù)生長期細胞，加入RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，采用 BCA 法測定蛋白濃度，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離蛋白，反應結(jié)束后將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜，封閉后分別加入各蛋白一抗稀釋液，TBST 洗膜，加入二抗稀釋液，TBST 洗膜，滴加 ECL 顯影，應用凝膠成像系統(tǒng)及 Quantity one 軟件檢測條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 miR-495-3p 和 HDAC9 在缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷中的表達

與 Con 組比較，H/R 組神經(jīng)細胞中 miR-495-3p的表達水平顯著降低（< 0.05），HDAC9 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高（< 0.05），見圖 1、表 1。

圖 1 HDAC9 蛋白表達

Figure 1 Expression of HDAC9

2.2 miR-495-3p 過表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響

實驗結(jié)果顯示，與 Con 組比較，H/R 組神經(jīng)細胞凋亡率顯著升高（< 0.05），Bax蛋白相對表達量顯著升高（< 0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量顯著降低（< 0.05）；與 H/R + miR-NC 組相比，H/R + miR-495-3p 組神經(jīng)細胞凋亡率顯著降低（< 0.05），Bax 蛋白相對表達量顯著降低（< 0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量顯著升高（< 0.05），見圖 2、表 2。

2.3 miR-495-3p 過表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞炎癥因子表達的影響

相對于 Con 組，H/R 組神經(jīng)細胞炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均顯著升高（< 0.05）；與 H/R + miR-NC 組比較，H/R + miR-495-3p 組神經(jīng)細胞炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（< 0.05），見表 3。

2.4 抑制 HDAC9 表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡和炎癥因子表達的影響

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與 H/R + si-NC 組相比，H/R + si-HDAC9 組神經(jīng)細胞中HDAC9 蛋白相對表達量顯著降低（< 0.05），提示成功降低神經(jīng)細胞中 HDAC9 的高表達水平。與 H/R + si-NC 組比較，H/R + si-HDAC9 組神經(jīng)細胞凋亡率顯著降低（< 0.05），Bax 蛋白相對表達量顯著降低（< 0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量顯著升高（< 0.05），炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均顯著降低（< 0.05），見圖 3、表 4。

表 1 miR-495-3p 和 HDAC9 在缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞損傷中的表達（，n = 9）

注：與Con 組比較，*< 0.05。

Note: Compared with Con group,*< 0.05.

圖 2 miR-495-3p 過表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響（A：凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

Figure 2 Effect of miR-495-3p overexpression on neuronal apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation (A: Apoptosis-related protein expression; B: Apoptosis flow cytometry)

表 2 miR-495-3p 過表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響（，n = 9）

注：與Con 組比較，*< 0.05；與H/R + miR-NC 組比較，#< 0.05。

Notes: Compared with Con group,*< 0.05; compared with H/R + miR-NC group,#< 0.05.

分組 GroupsTNF-αIL-1βIL-6 Con53.47 ± 6.8531.48 ± 5.3267.48 ± 7.32 H/R874.32 ± 56.17*551.23 ± 39.47*1247.56 ± 84.28* H/R + miR-NC895.47 ± 67.32564.87 ± 41.651286.87 ± 89.48 H/R + miR-495-3p198.36 ± 18.44#157.32 ± 14.22#397.54 ± 37.65# F872.088759.540814.810 P 0.000 0.000 0.000

注：與Con 組比較，*< 0.05；與H/R + miR-NC 組比較，#< 0.05。

Notes: Compared with Con group,*< 0.05; compared with H/R + miR-NC group,#< 0.05.

2.5 miR-495-3p 靶向調(diào)控 HDAC9 的表達

TargetScan 預測顯示 HDAC9 的 3'UTR 中含有與 miR-495-3p 互補的核苷酸序列，見圖 4A。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染突變型載體 MUT-HDAC9 實驗中，miR-495-3p 組與 miR-NC 組比較，熒光素酶活性差異無顯著性（>0.05）；轉(zhuǎn)染野生型載體 WT-HDAC9 實驗中，miR-495-3p 組與 miR-NC 組比較，熒光素酶活性明顯受到抑制（< 0.05），見表 5。Western blot 檢測結(jié)果顯示，與 miR-NC 組比較，miR-495-3p 組神經(jīng)細胞中HDAC9 蛋白相對表達量顯著降低（< 0.05）；與 anti-miR-NC 組比較，anti-miR-495-3p 組神經(jīng)細胞中 HDAC9 蛋白相對表達量顯著升高（< 0.05），見圖 4B、表 6。

圖 3 抑制 HDAC9 表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡的影響（A：HDAC9 和凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

Figure 3 Effect of inhibition of HDAC9 expression on hypoxia/reoxygenation-induced neuronal apoptosis(A: HDAC9 and apoptosis-related protein expression; B: Apoptosis flow cytometry)

分組GroupsHDAC9 蛋白HDAC9 protein凋亡率（%）Apoptosis rate (%)Bcl-2 蛋白Bcl-2 proteinBax 蛋白Bax proteinTNF-α（μg/ml）IL-1β（μg/ml）IL-6（μg/ml） Con0.39 ± 0.046.87 ± 0.690.73 ± 0.070.24 ± 0.0361.32 ± 6.4739.78 ± 5.2169.48 ± 7.36 H/R0.88 ± 0.07*22.48 ± 2.27*0.31 ± 0.03*0.66 ± 0.06*863.98 ± 49.57*574.32 ± 44.74*1226.54 ± 88.45* H/R + si-NC0.89 ± 0.0824.18 ± 2.630.28 ± 0.030.69 ± 0.06873.54 ± 51.44583.14 ± 49.761238.47 ± 79.32 H/R + si-HDAC90.51 ± 0.05#13.54 ± 1.37#0.55 ± 0.05#0.39 ± 0.04#234.87 ± 31.12#198.45 ± 19.66#487.68 ± 41.22# F153.097163.037176.967174.8041049.069549.225754.325 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

注：與Con 組比較，*< 0.05；與H/R+si-NC 組比較，#< 0.05。

Notes: Compared with Con group,*< 0.05; compared with H/R + si-NC group,#< 0.05.

圖 4 miR-495-3p 靶向調(diào)控 HDAC9 的表達（A：HDAC9 的 3'UTR 中含有與 miR-495-3p 互補的核苷酸序列；B：HDAC9 蛋白表達）

Figure 4 miR-495-3p targets HDAC9 expression (A: The 3'UTR of HDAC9 contains a nucleotide sequence complementary to miR-495-3p; B: The expression of HDAC9)

表 5 雙熒光素酶報告實驗（，n = 9）

注：與 miR-NC 組比較，*< 0.05。

Note: Compared with miR-NC group,*< 0.05.

2.6 HDAC9 過表達逆轉(zhuǎn)了 miR-495-3p 過表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡和炎癥因子表達的作用

與 H/R + miR-495-3p + pcDNA 組相比，H/R + miR-495-3p + pcDNA-HDAC9 組神經(jīng)細胞凋亡率顯著升高（< 0.05），Bax 蛋白相對表達量顯著升高（< 0.05），Bcl-2 蛋白相對表達量顯著降低（< 0.05），炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均顯著升高（< 0.05），見圖 5、表 7。

表 6 miR-495-3p 調(diào)控 HDAC9 蛋白的表達（，n = 9）

注：與miR-NC 組比較，*< 0.05；與anti-miR-NC 組比較，#< 0.05。

Notes: Compared with miR-NC group,*< 0.05; compared with anti-miR-NC group,#< 0.05.

3 討論

缺血性腦疾病已嚴重威脅人類生命安全，腦部缺氧缺血性損傷是誘發(fā)中樞神經(jīng)元細胞凋亡的主要原因，其中腦動脈硬化及腦出血等均可導致腦神經(jīng)細胞缺氧缺血[9]。研究表明，部分miRNA 可參與血管生成及細胞生長等過程[10-11]。因而深入研究 miRNA 與神經(jīng)細胞凋亡的相關(guān)性可為缺血性腦疾病治療提供潛在靶點。

miR-495-3p 在心肌缺血再灌注大鼠中的表達顯著降低，LncRNA NEAT1 通過抑制miR-495-3p的表達加重心肌缺血再灌注損傷[12]。研究表明，LPS誘導的牙周膜細胞中miR-495-3p 的表達水平明顯降低，并可參與疾病發(fā)生發(fā)展過程[13]。相關(guān)報道指出，miR-495-3p 可能通過靶向抑制 S1PR3 的表達而負調(diào)控 EMT 進程從而減輕肺纖維化[14]。但 miR-495-3p 在缺氧缺血性腦部疾病中的表達尚未可知。本研究通過缺氧/復氧誘導神經(jīng)細胞建立神經(jīng)細胞損傷模型，結(jié)果顯示 H/R 誘導的神經(jīng)細胞中 miR-495-3p 的表達水平顯著降低，與上述研究報道結(jié)果相似。進一步研究發(fā)現(xiàn)，H/R 可提高神經(jīng)細胞凋亡率，提示 H/R 可能通過抑制 miR-495-3p 的表達從而促進神經(jīng)細胞凋亡，進而參與神經(jīng)細胞損傷過程。研究表明 Bax 表達水平升高可促進細胞凋亡，Bcl-2 表達水平升高可抑制細胞凋亡，Bax、Bcl-2 可共同調(diào)控細胞凋亡過程[15]。本研究結(jié)果顯示 H/R 誘導的神經(jīng)細胞中 Bax 的表達水平顯著升高，Bcl-2 的表達水平顯著降低，而 miR-495-3p 過表達后神經(jīng)細胞凋亡率顯著降低，Bax 的表達水平顯著降低，Bcl-2 的表達水平顯著升高，說明 miR-495-3p 過表達可逆轉(zhuǎn) H/R 對神經(jīng)細胞凋亡的促進作用。提示 miR-495-3p 可能通過上調(diào) Bcl-2 的表達及下調(diào) Bax 的表達從而抑制 H/R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡。有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應是引發(fā)腦組織相關(guān)疾病的重要原因之一，炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用，降低炎癥因子水平可保護神經(jīng)細胞[16-17]。本研究結(jié)果顯示，H/R 誘導的神經(jīng)細胞中炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平顯著升高，而 miR-495-3p 過表達后可明顯降低 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平，提示 miR-495-3p 可能通過降低炎癥因子水平從而抵抗 H/R 誘導的神經(jīng)細胞炎癥反應。

圖 5 HDAC9 過表達逆轉(zhuǎn)了 miR-495-3p 過表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡的作用（A：HDAC9 和凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖）

Figure 5 HDAC9 overexpression reverses miR-495-3p overexpression on hypoxia/reoxygenation-induced neuronal apoptosis (A: HDAC9 and apoptosis-related protein expression; B: Apoptosis flow cytometry)

表 7 HDAC9 過表達逆轉(zhuǎn)了 miR-495-3p 過表達對缺氧/復氧誘導的神經(jīng)細胞凋亡和炎癥因子表達的作用（，n = 9）

注：H/R + miR-NC 組比較，*< 0.05；與H/R + miR-495-3p + pcDNA 組比較，#< 0.05。

Notes: Compared with H/R + miR-NC group,*< 0.05; compared with H/R + miR-495-3p + pcDNA group,#< 0.05.

HDAC9 在腦組織中廣泛分布，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育具有重要調(diào)控作用[18]。研究表明缺血再灌注損傷小鼠腦組織中 HDAC9 的表達水平明顯升高，并可參與缺血再灌注損傷發(fā)生發(fā)展過程[19]。沉默 HDAC9 表達后可明顯減輕腦組織缺血再灌注損傷后內(nèi)皮損傷及神經(jīng)功能障礙[20]。但關(guān)于 HDAC9 在缺血再灌注后神經(jīng)損傷中的作用機制尚未闡明。與上述研究報道相似，本研究結(jié)果顯示 H/R 誘導的神經(jīng)細胞中HDAC9 的表達水平顯著升高，抑制 HDAC9 的表達可使神經(jīng)細胞凋亡率顯著降低，Bax 的表達水平降低，Bcl-2 的表達水平升高，炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均明顯降低，提示抑制 HDAC9 的表達可抑制 H/R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡及減輕炎癥損傷。本研究通過雙熒光素酶報告實驗與 Western blot 實驗證實 miR-495-3p 可靶向結(jié)合HDAC9，并可負向調(diào)控 HDAC9 的表達。進一步研究顯示，HDAC9 過表達聯(lián)合 miR-495-3p 過表達處理后，H/R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡率明顯升高，Bax 的表達水平升高，Bcl-2 的表達水平降低，炎癥因子 TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均明顯升高，說明 HDAC9 過表達可逆轉(zhuǎn)miR-495-3p 過表達對 H/R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡及炎癥因子表達的作用。提示 miR-495-3p 可通過靶向抑制 HDAC9 的表達從而抑制 H/R 誘導的神經(jīng)細胞凋亡及炎癥反應，對神經(jīng)細胞發(fā)揮保護作用。

綜上所述，miR-495-3p 過表達可通過靶向抑制 HDAC9 的表達從而在 H/R 誘導的神經(jīng)細胞損傷中發(fā)揮保護作用，其可能通過抑制細胞炎癥反應、下調(diào) Bax 表達及上調(diào) Bcl-2 表達而發(fā)揮抗神經(jīng)細胞凋亡的作用，可為進一步探究 H/R 誘導的神經(jīng)細胞損傷提供參考依據(jù)，可為缺血性腦疾病的治療提供新思路。

[1] Liu B, Li F, Shi J, et al. Gastrodin ameliorates subacute phase cerebral ischemia?reperfusion injury by inhibiting inflammation and apoptosis in rats. Mol Med Rep, 2016, 14(5):4144-4152.

[2] Dong P, Zhang X, Zhao J, et al. Anti-microRNA-132 causes sevoflurane?induced neuronal apoptosis via the PI3K/AKT/FOXO3a pathway. Int J Mol Med, 2018, 42(6):3238-3246.

[3] Nan A, Chen L, Zhang N, et al. A novel regulatory network among LncRpa, CircRar1, MiR-671 and apoptotic genes promotes lead-induced neuronal cell apoptosis. Arch Toxicol, 2017, 91(4):1671-1684.

[4] Qiu J, Zhou XY, Zhou XG, et al. Neuroprotective effects of microRNA-210 against oxygen-glucose deprivation through inhibition of apoptosis in PC12 cells. Mol Med Rep, 2013, 7(6):1955-1959.

[5] Zhang F, Yu GX, Wang LF. Effect of miR-495-3p on the proliferation of hPDLC and the production of inflammatory cytokines induced by LPS. Oral Biomed, 2017, 8(2):86-89. (in Chinese)

張帆, 余國璽, 王力鋒. miR-495-3p對LPS刺激人牙周膜細胞增殖及炎性因子表達的影響. 口腔生物醫(yī)學, 2017, 8(2):86-89.

[6] Han X, Han X, Wang Z, et al. HDAC9 regulates ox-LDL-induced endothelial cell apoptosis by participating in inflammatory reactions. Front Biosci (Landmark Ed), 2016, 21:907-917.

[7] Zhou HQ, Zhu DN, Zhao J, et al. HDAC9 silence inhibits oxygen-glucose deprivation/reperfusion injury of hippocampal neurons in neonatal rats. Chin J Neuroanatomy, 2018, 34(4):519-526. (in Chinese)

周厚勤, 朱登納, 趙晶, 等. HDAC9沉默抑制新生大鼠海馬神經(jīng)元氧糖剝奪/再灌注損傷. 神經(jīng)解剖學雜志, 2018, 34(4):519-526.

[8] Yuan R, Zhang YH, Cheng BL, et al. Effect of Ginkgo biloba extract (EGb50) on mitochondrial function in SH-SY5Y cells after hypoxia/reoxygenation injury. China J Chin Mater Med, 2018, 43(22): 4486-4490. (in Chinese)

袁蓉, 張業(yè)昊, 程冰麗, 等. 銀杏酮酯EGb50對缺氧/復氧損傷后SH-SY5Y細胞線粒體功能的影響. 中國中藥雜志, 2018, 43(22): 4486-4490.

[9] Radak D, Katsiki N, Resanovic I, et al. Apoptosis and acute brain ischemia in ischemic stroke. Curr Vasc Pharmacol, 2017, 15(2):115- 122.

[10] Ding N, Huang Y, Tian L. Effects of miRNA-210-3p on hypoxia induced apoptosis in hippocampal neuron HT22 cells. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2019, 54(2):275-279. (in Chinese)

丁娜, 黃月, 田龍. miRNA-210-3p對缺氧誘導海馬神經(jīng)細胞HT22凋亡的影響. 鄭州大學學報(醫(yī)學版), 2019, 54(2):275-279.

[11] Zhang JK, Wang XX, Chen X, et al. Research progress of circulating miRNA in acute ischemic stroke. Stroke Nervous Dis, 2016, 23(3): 213-215. (in Chinese)

張家康, 王梟雄, 陳鑫, 等. 急性缺血性腦卒中中循環(huán)miRNA的相關(guān)研究進展. 卒中與神經(jīng)疾病, 2016, 23(3):213-215.

[12] Luo M, Sun Q, Zhao H, et al. Long noncoding RNA NEAT1 sponges miR-495-3p to enhance myocardial ischemia-reperfusion injury via MAPK6 activation. J Cell Physiol, 2020, 235(1):105-113.

[13] Du A, Zhao S, Wan L, et al. MicroRNA expression profile of human periodontal ligament cells under the influence of Porphyromonas gingivalis LPS. J Cell Mol Med, 2016, 20(7):1329-1338.

[14] Gong L, Wu X, Li X, et al. S1PR3 deficiency alleviates radiation-induced pulmonary fibrosis through the regulation of epithelial-mesenchymal transition by targeting miR-495-3p. J Cell Physiol, 2020, 235(3):2310-2324.

[15] Zhao YD, Liu PH, Wang XT, et al. Preliminary study on the mechanism of Tau protein in PC12 cell apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation. Chin J Pathophysiology, 2015, 20(10):1918. (in Chinese)

趙嚴冬, 劉潘虹, 王曉彤, 等. Tau蛋白在缺氧/復氧誘導的PC12細胞凋亡中的機制初探. 中國病理生理雜志, 2015, 20(10):1918.

[16] Kong Y, Yang Y, Han CY, et al. Antrodia camphorata polysaccharide inhibited the inflammatory response in PC12 cell induced by LPS. Chin J Mod Appl Pharm, 2018, 35(11):1689-1693. (in Chinese)

孔云, 楊毅, 韓晨陽, 等. 樟芝多糖抵抗脂多糖誘導的神經(jīng)細胞PC12炎癥反應. 中國現(xiàn)代應用藥學, 2018, 35(11):1689-1693.

[17] Wu YH, Hu WB. Resveratrol inhibits PC12 cell injury and apoptosis induced by OGD/R via activating mTOR/autophagy. Clin J Traditional Chin Med, 2019, 31(2):298-303. (in Chinese)

吳印華, 胡萬保. 白藜蘆醇通過激活mTOR/自噬抑制缺氧缺糖/復氧復糖誘導的PC12細胞損傷及凋亡. 中醫(yī)藥臨床雜志, 2019, 31(2):298-303.

[18] Sugo N, Yamamoto N. Visualization of HDAC9 spatiotemporal subcellular localization in primary neuron cultures. Methods Mol Biol, 2016, 1436(1):119-127.

[19] Mai HT, Jiang T, Zhang AW, et al. Expression of HDAC9 in different brain regions in mice with cerebral ischemic stroke. J South Med Univ, 2017, 37(6):812-816. (in Chinese)

麥漢滔, 姜濤, 張愛武, 等. 小鼠腦梗死后腦組織HDAC9的表達及其意義. 南方醫(yī)科大學學報, 2017, 37(6):812-816.

[20] Shi W, Wei X, Wang Z, et al. HDAC9 exacerbates endothelial injury in cerebral ischaemia/reperfusion injury. J Cell Mol Med, 2016, 20(6): 1139-1149.

Effect of miR-495-3p on apoptosis and inflammatory response of neurons induced by hypoxia/reoxygenation through the regulation of HDAC9 expression

GUO Yan-bing, YAO Qing-he, WANG Xin-jun

Department of Neurosurgery, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Luoyang 471009, China (GUO Yan-bing, YAO Qing-he); Department of Neurosurgery, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 470000, China (WANG Xin-jun)

To investigate the effect and mechanism of microRNA-495-3p (miR-495-3p) on hypoxia/reoxygenation (H/R)-induced apoptosis and inflammatory response of neurons.

The neuroblastoma cells SK-N-SH were culturedto establish a H/R injury cell model. There were 8 experimental groups as following; Con group, H/R group, H/R + miR-NC group, H/R + miR-495-3p group, H/R + si-NC group, H/R + si-HDAC9 group, H/R + miR-495-3p + pcDNA group, H/R + miR-495-3p + pcDNA-HDAC9 group. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot were used to detect the expression of miR-495-3p and histone deacetylase 9 (HDAC9), respectively. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining. The levels of inflammatory factors TNF-α, IL-1β and IL-6 were detected by ELISA. Dual luciferase reporter assay was used to verify the targeting relationship of miR-495-3p to HDAC9. Western blot was used to detect the expression levels of Bax and Bcl-2 proteins.

As compared with the Con group, the expression level of miR-495-3p was significantly decreased in the H/R group (< 0.05) and the expression level of HDAC9 was significantly increased (< 0.05). The apoptosis rate (< 0.05), the expression of Bax protein (< 0.05), and the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 (< 0.05) were increased after H/R treatment, but the expression level of Bcl-2 protein was decreased (< 0.05). The apoptosis rate (< 0.05), Bax protein expression level (< 0.05) and TNF-α, IL-1β, IL-6 levels (< 0.05) were decreased after over-expression of miR-495-3p or the inhibition of HDAC9 expression, while Bcl-2 protein expression level was increased (< 0.05). miR-495-3p bound to the 3'UTR region of HDAC9 and down-regulated HDAC9 expression. Overexpression of HDAC9 reversed the inhibitory effect of miR-495-3p overexpression on H/R-induced apoptosis and inflammatory factor expression levels of neurons.

miR-495-3p can protect neurons by inhibiting H/R-induced apoptosis and the production of inflammatory factors through down-regulating HDAC9 expression.

miR-495-3p; HDAC9; Hypoxia/reoxygenation; Nerve cells; Apoptosis; Inflammation

WANG Xin-jun, Email: wangxj@zzu.edu.cn

王新軍，Email：wangxj@zzu.edu.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.017

2019-10-18