賈怡丹 韓佳芮 李季膚 王桂花 劉攀道 劉國(guó)道 羅麗娟 陳志堅(jiān)

摘? 要：以熱研二號(hào)（RY2）柱花草為材料，分析過(guò)量錳處理（100～600 ?mol/L）對(duì)柱花草生長(zhǎng)、次級(jí)代謝物、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）及SgPALs基因表達(dá)的影響，探討金屬錳毒害對(duì)柱花草次級(jí)代謝途徑的影響。結(jié)果表明：相對(duì)對(duì)照錳（5 ?mol/L）處理，400、600 ?mol/L錳處理顯著抑制柱花草葉片葉綠素濃度、最大光化合速率（Fv/Fm）、地上部和根部生物量。隨著外源錳處理濃度（100～600 ?mol/L）的增加，葉片原花青素、總酚和單寧含量呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，而葉片類(lèi)黃酮含量逐漸降低。此外，400、600 ?mol/L錳處理顯著增加葉片PAL酶活性，但對(duì)PPO活性影響不明顯。定量PCR結(jié)果表明，過(guò)量錳處理對(duì)SgPAL1和SgPAL2基因表達(dá)影響不明顯，但過(guò)量錳處理增強(qiáng)了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草葉片中的表達(dá)。以上結(jié)果說(shuō)明，柱花草可能通過(guò)苯丙氨酸途徑調(diào)控次級(jí)代謝響應(yīng)金屬錳毒脅迫，且SgPAL3和SgPAL4基因可能參與該響應(yīng)過(guò)程。研究結(jié)果為探索柱花草響應(yīng)金屬錳毒脅迫機(jī)理提供重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：柱花草;錳毒害;次級(jí)代謝;苯丙氨酸解氨酶

中圖分類(lèi)號(hào)：Q945.78? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Effects of Excess Manganese on Secondary Metabolites， Enzyme Activity and SgPALs Gene Expression in Stylosanthes

JIA Yidan1， HAN Jiarui1， LI Jifu1， WANG Guihua3， LIU Pandao2， LIU Guodao2， LUO Lijuan1*， CHEN Zhijian1，2*

1. College of Tropical Crops， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China; 2. Tropical Crop Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences / Key Laboratory of Crop Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Haikou， Hainan 571101， China; 3. Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agriculture Sciences， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： In this study， the effects of different manganese （Mn） levels on the growth， chlorophyll content， secondary metabolites and activities of polyphenol oxidase （PPO） and phenylalnine ammonialyase （PAL） as well as SgPALs expressions were investigated using Stylosanthes （stylo） genotype RY2. Results showed that the chlorophyll concentration， maximum photochemical rate （Fv/Fm）， shoot and root dry weight of stylo significantly decreased by 400 ?mol/L and 600 ?mol/L Mn treatments. The contents of proanthocyanidin， total phenol and tannin increased but the flavonoid content decreased in the leaves ranged from 100 ?mol/L to 600 ?mol/L. Furthermore， the activities of PAL， except PPO， increased under 400 ?mol/L and 600 ?mol/L Mn treatments compared to that in the 5 ?mol/L Mn treatment. qRT-PCR analysis showed that the expressions of SgPAL3 and SgPAL4 in the leaves were significantly enhanced by excess Mn treatments， in despite of the expressions of SgPAL1 and SgPAL2 were not regulated by Mn. The results suggested that the regulation of the secondary metabolites through SgPALs mediated phenylalanine pathway might be involved in the response to Mn toxicity in stylo. The study would provide an important basis for exploring the mechanisms of stylo in response to Mn toxicity.

Keywords： Stylosanthes; Mn toxicity; secondary metabolism; phenylalnine ammonialyase

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.013

錳是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的微量元素之一，在植物生命活動(dòng)過(guò)程中起重要作用。錳與光合作用密切相關(guān)，能夠維持葉綠體膜的正常結(jié)構(gòu)，參與光合電子傳遞系統(tǒng)的氧化還原和光系統(tǒng)Ⅱ中水的光解過(guò)程[1-2]。錳也是超氧化物歧化酶（SOD）的組成成分，可催化超氧化自由基轉(zhuǎn)變?yōu)檫^(guò)氧化氫和氧氣，從而防止膜脂過(guò)氧化[3]。一般認(rèn)為，20～40 mg/kg植株錳濃度足以滿足植物生長(zhǎng)發(fā)育所需，當(dāng)?shù)陀谶@個(gè)錳濃度范圍時(shí)，葉綠素合成、酶活性以及光合作用會(huì)受到抑制，葉片出現(xiàn)變黃失綠的缺錳性狀，最終降低植株的生物量[1，4]。另一方面，錳是地殼中第2豐富的過(guò)渡金屬元素，也被認(rèn)為是重金屬元素之一，其廣泛分布于土壤、沉積物和生物材料中。在地殼中，錳的平均含量為1000 mg/kg。在我國(guó)可耕作土壤中，錳的平均含量可達(dá)574 mg/kg[5-6]。當(dāng)植株體內(nèi)的錳濃度超過(guò)150 mg/kg時(shí)，葉片會(huì)出現(xiàn)褐色錳氧化斑點(diǎn)、厚度減小、卷縮乃至植株萎蔫壞死等錳毒害現(xiàn)象，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[1， 7-8]。

過(guò)量錳毒害會(huì)對(duì)植物造成產(chǎn)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，如產(chǎn)生過(guò)氧化脅迫、改變酶活性、抑制光合作用、影響植株對(duì)其他營(yíng)養(yǎng)元素（如磷、鈣、鎂和鐵等）的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配[9]。例如，在過(guò)量錳處理下，波蘭小麥（Triticum polonioum）葉片會(huì)出現(xiàn)黃化和壞死斑點(diǎn)，葉綠素含量降低[10]。隨著外源錳濃度的增加，油菜幼苗葉片過(guò)氧化氫酶（CAT）活性顯著降低，而過(guò)氧化物酶（POD）活性則表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)[11]。研究表明，過(guò)量錳會(huì)導(dǎo)致豇豆（Vigna unguiculata）葉片形成肉眼可見(jiàn)的褐色斑點(diǎn)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其褐色斑點(diǎn)主要由氧化態(tài)錳和酚類(lèi)物質(zhì)組成[12]。另外，在過(guò)量錳脅迫下，豇豆葉片愈創(chuàng)木酚POD和NADH-POD酶活性以及酚類(lèi)物質(zhì)含量的變化，被認(rèn)為是豇豆對(duì)錳毒脅迫的應(yīng)激響應(yīng)[12]。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，形成一系列適應(yīng)錳毒害的機(jī)制。例如，在過(guò)量錳脅迫下，植物可通過(guò)根系分泌有機(jī)酸或其他化合物螯合錳離子，減少錳的吸收緩解錳毒脅迫。另外，進(jìn)入植物細(xì)胞中的過(guò)量錳，可被轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡和細(xì)胞壁等非活性部位。并且，通過(guò)增強(qiáng)抗氧化系統(tǒng)，可降低金屬錳對(duì)植物的毒害[13]。此外，在錳毒脅迫中，植物可以通過(guò)調(diào)控次級(jí)代謝途徑（如苯丙烷類(lèi)代謝）及其相關(guān)蛋白（如苯丙氨酸解氨酶）表達(dá)應(yīng)對(duì)錳毒脅迫[14]。

柱花草（Stylosanthes spp.）是豆科蝶形花亞科的1個(gè)屬。柱花草不僅可作為飼料牧草喂養(yǎng)牲畜，且可作為豆科綠肥覆蓋果園、改良以及修復(fù)土壤，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益[15]。相對(duì)苜蓿（Medicago sativa）、豇豆和菜豆（Phaseolus vulgaris）等豆科植物，柱花草具有忍耐錳毒害的優(yōu)良特性，是探索植物響應(yīng)金屬錳毒脅迫機(jī)理的良好研究材料[13， 16-17]。葉片失綠、最大光化合效率（Fv/Fm）和植株生物量降低被認(rèn)為是柱花草主要的錳毒害癥狀[13-14， 17-18]。雖然錳毒害對(duì)柱花草生長(zhǎng)和柱花草適應(yīng)錳毒脅迫機(jī)理已有文獻(xiàn)報(bào)道，但錳毒害對(duì)柱花草次級(jí)代謝物及其相關(guān)酶活性和基因表達(dá)的影響仍不清楚。因此，本研究以熱研二號(hào)（RY2）柱花草為材料，分析不同錳濃度處理對(duì)柱花草生長(zhǎng)、4種次級(jí)代謝產(chǎn)物、多酚氧化酶（PPO）、如苯丙氨酸解氨酶（PAL）及SgPAL1-4基因表達(dá)的影響，以期為探究錳毒害對(duì)柱花草次級(jí)代謝途徑的影響提供理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

所用供試材料為熱研二號(hào)（RY2）柱花草（Stylosanthes guianensis）。柱花草種子由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2? 方法

1.2.1? 處理方法? 參考劉攀道等[19]方法，將柱花草種子去種皮并于80 ℃加熱2 min后，將種子置于在黑暗條件下萌發(fā)2～3 d。將萌發(fā)后的柱花草幼苗移至1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中，在溫室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。幼苗正常培養(yǎng)1個(gè)月后，進(jìn)行4個(gè)錳濃度處理，分別為5、200、400、600 ?mol/L MnSO4。用KOH或H2SO4調(diào)pH至5.0。每個(gè)處理設(shè)置4個(gè)重復(fù)，處理10 d后，分別收獲地上部和根部樣品。一部分樣品用于干重測(cè)定，另一部分樣品用液氮速凍后，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 葉綠素含量測(cè)定? 稱(chēng)取0.1 g葉片，放入10 mL 80% 丙酮中避光提取過(guò)夜。于分光光度計(jì)中分別測(cè)定663、645 nm處吸光度，計(jì)算葉綠素含量，采用鮮重。

1.2.3? 錳含量的測(cè)定? 柱花草樣品于105 ℃下殺青30 min，75 ℃烘干至恒重后，稱(chēng)取0.07 g樣品于灰化瓶中，加入適量濃硫酸乙醇（5∶95）混合液浸濕樣品，于馬弗爐中600 ℃灰化10 h。待樣品冷卻后，加入8 mL 100 mmol/L HCl充分溶解樣品。采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜（ICP- AES）測(cè)定樣品中的錳含量。

1.2.4? 柱花草次級(jí)代謝含量的測(cè)定? 總酚提取與測(cè)定：稱(chēng)取約0.1 g烘干后的葉片，加入2.5 mL試劑盒（南京建成生物工程研究所，下同）中的提取液，并充分研磨樣品，于60 ℃提取30 min。12 000 r/min，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)加入反應(yīng)液，于分光光度計(jì)中測(cè)定760 nm處吸光度，并計(jì)算總酚含量，采用干重。

類(lèi)黃酮提取與測(cè)定：稱(chēng)取約0.02 g烘干后的葉片，加入2 mL提取液并充分研磨樣品，于60 ℃提取2 h。12 000 r/min，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)加入反應(yīng)液，于分光光度計(jì)中測(cè)定502 nm處吸光度，并計(jì)算類(lèi)黃酮含量，采用干重。

原花青素提取與測(cè)定：稱(chēng)取約0.1 g烘干后的葉片，加入2 mL提取液并充分研磨樣品。30 min，10 000 r/min，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)加入反應(yīng)液，于分光光度計(jì)中測(cè)定500 nm處吸光度，并計(jì)算原花青素含量，采用干重。

單寧提取與測(cè)定：稱(chēng)取約0.1 g新鮮葉片，加入1 mL蒸餾水，充分研磨勻漿后轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中，于80 ℃水浴提取30 min，8000 g，25 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)加入反應(yīng)液，于分光光度計(jì)中測(cè)定760 nm處吸光度，并計(jì)算單寧含量，采用鮮重。

1.2.5? 苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性測(cè)定? PAL提取與測(cè)定：稱(chēng)取約0.1 g葉片樣品，加入0.9 mL 提取液，在冰上并充分研磨樣品。10 000 g，4 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)（南京建成生物工程研究所）加入反應(yīng)液，于分光光度計(jì)中測(cè)定290 nm處吸光度，并計(jì)算PAL酶活性。

PPO提取與測(cè)定：稱(chēng)取約0.1 g葉片樣品，加入1 ml提取液，在冰上并充分研磨樣品。8000 g，4 ℃離心10 min，取上清。參考試劑盒說(shuō)明書(shū)加入反應(yīng)液，于分光光度計(jì)中測(cè)定410 nm處吸光度，并計(jì)算PPO酶活性。

1.2.6? 柱花草葉片總RNA提取、cDNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR? 參照 TRIzol（Invitrogen inc，美國(guó)）方法提取柱花草葉片總RNA。參照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Invitrogen inc，美國(guó)）方法合成cDNA第一鏈。實(shí)時(shí)熒光定量PCR參照ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix定量試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行，用Applied Biosystems QuantStudio 6 Flex運(yùn)行QuantStudioTM Real-Time PCR Software及計(jì)算分析每個(gè)樣品的表達(dá)量。基因表達(dá)分析包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。相對(duì)表達(dá)量為目的基因的表達(dá)量與看家基因（SgEF-1α）表達(dá)量的比值。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物如表 1 所示。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，用SPS S20.0（SPSS Institute，美國(guó)）軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同錳濃度處理對(duì)柱花草生長(zhǎng)的影響

葉片失綠、最大光化學(xué)效率（Fv/Fm）和植株生物量降低是柱花草主要的錳毒害癥狀。如圖1所示，過(guò)量錳處理顯著抑制柱花草的生長(zhǎng)。隨著外源錳濃度的增加，葉片葉綠素含量和Fv/Fm逐漸降低，在600 ?mol/L錳處理下葉綠素含量和Fv/Fm達(dá)到最低值。與對(duì)照（5 ?mol/L）錳處理相比，柱花草在400、600 ?mol/L錳處理下的葉綠素濃度分別降低37.9%和38.0%，F(xiàn)v/Fm分別降低22.2%和27.8%，差異顯著（圖1A、圖1B）。

類(lèi)似的，過(guò)量錳處理（400、600 ?mol/L）顯著降低柱花草地上部和根部生物量。與對(duì)照（5 ?mol/L）錳處理相比，在400、600 ?mol/L錳處理下，柱花草地上部干重分別降低26.5%和32.4%，而根部干重分別顯著降低17.4%和21.7%（圖1C、圖1D）。

2.2? 不同錳濃度處理對(duì)柱花草組織錳含量的影響

從圖2可以看出，過(guò)量錳處理顯著增加了柱花草地上部和根部的錳含量。與對(duì)照（5 ?mol/L）處理相比，400～600 ?mol/L錳含量處理的柱花草地上部錳含量增加2.8～4.1倍，根部錳含量增加1.5～ 1.8倍（圖2）。此外，根部積累的錳含量顯著高于地上部錳含量。在400、600 ?mol/L錳處理下，根部錳含量分別是地上部錳含量1.9和1.6倍（圖2）。

2.3? 不同錳濃度處理對(duì)柱花草葉片次級(jí)代謝物的影響

進(jìn)一步分析不同錳濃度處理對(duì)柱花草葉片4種次級(jí)代謝物（原花青素、總酚、類(lèi)黃酮和單寧）濃度的影響。從圖3可看出，隨著外源錳處理濃度的增加，葉片原花青素、總酚和單寧濃度呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，而類(lèi)黃酮濃度則逐漸降低。與對(duì)照（5 ?mol/L）處理相比，600 ?mol/L錳處理的柱花草葉片原花青素、總酚和單寧濃度分別增加85.9%、47.2%和27.4%（圖3A、圖3C、圖3D），而類(lèi)黃酮濃度則降低27.1%（圖3B），差異顯著。

2.4? 不同錳濃度處理對(duì)柱花草苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）活性的影響

從圖4可看出，不同錳濃度處理對(duì)柱花草葉片PAL和PPO活性的影響不一樣，過(guò)量錳處理（400、600 ?mol/L）顯著增加葉片PAL酶活性，但對(duì)PPO活性影響不明顯。與對(duì)照（5 ?mol/L）處理相比，400、600 ?mol/L錳處理的柱花草葉片PAL酶活性分別增加13.3%和60.2%（圖4）。

2.5? 不同錳濃度處理對(duì)SgPALs基因表達(dá)的影響

本研究進(jìn)一步分析了不同錳濃度處理對(duì)Sg PAL1-4基因表達(dá)的影響。從圖5可以看出，不同錳濃度處理對(duì)SgPALs基因表達(dá)的影響不一樣，與

基因表達(dá)分析包含3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。不同小寫(xiě)字母表示錳處理間差異顯著（P<0.05）。

對(duì)照（5 ?mol/L）相比，過(guò)量錳處理對(duì)SgPAL1基因表達(dá)影響不明顯，而200 ?mol/L過(guò)量錳處理顯著抑制了Sg P AL2基因的表達(dá)（圖5A，圖5B）。另外，200、400 ?mol/L錳處理分別增強(qiáng)了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草葉片中的表達(dá)。在200 ?mol/L錳處理下，Sg P AL3基因的表達(dá)量是對(duì)照（5 ?mol/L）處理下的6.89倍，而在400 ?mol/L錳處理下，SgPAL4基因的表達(dá)量是對(duì)照（5 ?mol/L）處理下的1.88倍（圖5C、圖5D），差異顯著。

3? 討論

錳是植物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一，但錳也是重金屬元素，植物細(xì)胞內(nèi)過(guò)量積累的錳離子會(huì)對(duì)植物造成毒害，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[20]。研究表明，在較低的錳濃度（50 ?mol/L）處理下，其可導(dǎo)致豇豆、大麥（Hordeum vulgare）和大豆（Glycine max）葉片形成錳氧化斑的毒害癥狀[12， 21-22]。在本研究中，雖然200 ?mol/L錳處理降低柱花草葉綠素含量和Fv/Fm，但對(duì)柱花草地上部干重并沒(méi)有顯著影響，而只有400和600 ?mol/L錳濃度處理才顯著降低柱花草葉綠素濃度、Fv/Fm、地上部和根部生物量（圖1）。這與已有研究結(jié)果類(lèi)似，柱花草在低于200 ?mol/L錳處理下并沒(méi)有明顯的錳毒害癥狀，只有在400 ?mol/L錳濃度處理下才顯著降低了柱花草葉綠素含量和植株干重[18]。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明柱花草具有較強(qiáng)的耐錳毒能力。在過(guò)量錳處理下，雖然柱花草根部的錳含量和地上部錳含量均逐漸增加，但根部的錳含量顯著高于地上部（圖2）。根部積累錳，減少錳向地上部運(yùn)輸被報(bào)認(rèn)為是柱花草適應(yīng)錳毒害的機(jī)制之一[18]。

次級(jí)代謝物，如原花青素、總酚、單寧和類(lèi)黃酮等酚類(lèi)物質(zhì)，是植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫的關(guān)鍵化合物。這些酚類(lèi)化合物與植物戊糖磷酸酯、莽草酸和苯丙酸代謝途徑密切相關(guān)[23-24]。酚類(lèi)化合物能夠清除自由基、螯合金屬陽(yáng)離子，從而參與植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫[25]。研究發(fā)現(xiàn)，重金屬脅迫會(huì)影響植物次級(jí)代謝途徑，改變次級(jí)代謝物含量。例如，在過(guò)量錳脅迫下，豇豆葉片酚類(lèi)物質(zhì)和胼胝質(zhì)含量、水稻葉片木質(zhì)素和黃酮類(lèi)化合物以及楊樹(shù)（Populus cathayana）葉片中苯丙氨酸的含量均有所增加，進(jìn)而響應(yīng)金屬錳脅迫[26-27]。此外，金屬鎘脅處理也增加秋茄（Kandelia candel）幼苗葉片中的單寧和總酚含量[28]。桐花樹(shù)（Aegiceras corniculatum）根和葉中的單寧能與一些金屬離子（如鐵、鎘等）絡(luò)合形成難溶性化合物，從而緩解重金屬毒性[29]。因此，調(diào)控次級(jí)代謝物含量可能是植物響應(yīng)重金屬脅迫的適應(yīng)性變化之一[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著外源錳濃度的增加，柱花草葉片原花青素、總酚和單寧含量呈現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)，而葉片類(lèi)黃酮含量逐漸降低（圖3）。以上結(jié)果暗示，在過(guò)量錳脅迫下，柱花草可能通過(guò)調(diào)控次級(jí)代謝物含量從而響應(yīng)錳毒害。

進(jìn)一步對(duì)PPO和PAL酶活性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，400、600 ?mol/L過(guò)量錳處理顯著增加柱花草葉片PAL酶活性，但對(duì)PPO活性影響不明顯（圖4）。且定量PCR結(jié)果表明，在4個(gè)SgPALs基因中，200、400 ?mol/L錳處理分別增強(qiáng)了SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草葉片中的表達(dá)（圖5）。PAL是連接初級(jí)代謝和苯丙烷類(lèi)代謝、調(diào)控苯丙烷類(lèi)合成代謝途徑的關(guān)鍵酶和限速酶[29]。研究發(fā)現(xiàn)，重金屬處理調(diào)控了PAL基因和蛋白表達(dá)以及酶活性。例如，在大豆和羽扇豆（Lupinus luteus）中，金屬鉛處理顯著增加了根系PAL酶活性以及PAL基因表達(dá)[31]。在山苔草（Carex putuoshan）中，金屬鉛和鋅處理提高了PAL蛋白表達(dá)量[32]。最近，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)研究方法，發(fā)現(xiàn)錳毒害處理增強(qiáng)了PAL蛋白在柱花草根系中的表達(dá)[14]。因此，在本研究中，SgPAL3和SgPAL4基因可能參與了柱花草響應(yīng)錳毒害的過(guò)程。另一方面，PAL參與的苯丙烷類(lèi)代謝途徑可生成反式肉桂酸等中間產(chǎn)物，這些中間產(chǎn)物可進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸等，再通過(guò)多條途徑進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成類(lèi)黃酮、木質(zhì)素、生物堿、原花青素等級(jí)次代謝產(chǎn)物，這些次級(jí)代謝物在植物響應(yīng)逆境脅迫中起重要作用[33-35]。因此，在本研究中，柱花草可能通過(guò)提高PAL酶活性以及增強(qiáng)SgPAL3和SgPAL4基因表達(dá)，從而通過(guò)苯丙氨酸途徑調(diào)控了次級(jí)代謝物含量，進(jìn)而響應(yīng)金屬錳毒脅迫。然而，SgPAL3和SgPAL4基因在柱花草響應(yīng)錳毒害過(guò)程中的生物學(xué)功能有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，過(guò)量錳脅迫增加柱花草葉片原花青素、總酚和單寧含量，而降低類(lèi)黃酮。柱花草可能通過(guò)提高PAL酶活性以及增強(qiáng)SgPAL3和SgPAL4基因表達(dá)，從而調(diào)控次級(jí)代謝物的含量，進(jìn)而通過(guò)苯丙氨酸途徑調(diào)控次級(jí)代謝響應(yīng)金屬錳毒脅迫。本研究結(jié)果為探索柱花草響應(yīng)金屬錳毒害機(jī)理及提供重要的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

Millaleo R， Reyesdíaz M， Ivanov A G， et al. Manganese as essential and toxic element for plants：transport， accumulation and resistance mechanisms[J]. Journal of Soil Science and Plant Nutrition， 2010， 10（4）： 476-494.

Schmidt S B， Jensen P E， Husted S. Manganese deficiency in plants： the impact on photosystem II[J]. Trends in Plant Science， 2016， 21（7）： 622-632.

Kering M K. Manganese nutrition and photosynthesis in NAD malic enzyme C-4 plants[J]. Dissertations and Theses Gradworks， 2008（316）： 217-226.

Marschner H. Marschners mineral nutrition of higher plants[M]. Boston： Academic Press， 2012.

Niu L， Yang F， Xu C， et al. Status of metal accumulation in farmland soils across China： from distribution to risk assessment[J]. Environmental Pollution， 2013， 176（5）： 55-62.

臧小平. 土壤錳毒與植物錳的毒害[J]. 土壤通報(bào)， 1999， 30（3）： 139-141.

Fernando D R， Lynch J P. Manganese phytotoxicity： new light on an old problem[J]. Annals of Botany， 2015， 116（3）： 313-319.

Shao J F， Yamaji N， Shen R F， et al. The key to Mn homeostasis in plants： regulation of Mn transporters[J]. Trends in Plant Science， 2017， 22（3）： 215-224.

Ducic T， Polle A. Transport and detoxification of manganese and copper in plants[J]. Brazilian Journal of Plant Physiology， 2005， 17（1）： 103-112.

Sheng H， Zeng J， Yan F， et al. Effect of exogenous salicylic acid on manganese toxicity， mineral nutrients translocation and antioxidative system in polish wheat （Triticum polonicum L.）[J]. Acta Physiologiae Plantarum， 2015， 37（2）： 32.

曾? 琦， 耿明建， 張志江， 等. 錳毒害對(duì)油菜苗期Mn、Ca、Fe含量及 POD、CAT活性的影響[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2004， 23（3）： 300-303.

Wissemeier A H， Horst W J. Effect of light intensity on manganese toxicity symptoms and callose formation in cowpea （Vigna unguiculata （L.） Walp.）[J]. Plant and Soil， 1992， 143（2）： 299-309.

Chen Z， Sun L， Liu P， et al. Malate synthesis and secretion mediated by a manganese enhanced malate dehydrogenase confers superior manganese tolerance in Stylosanthes guianensis[J]. Plant Physiology， 2015， 167（1）： 176-188.

Liu P， Huang R， Hu X， et al. Physiological responses and proteomic changes reveal insights into Stylosanthes response to manganese toxicity[J]. BMC Plant Biology， 2019， 19： 212.

Marques A， Moraes L， Aparecida M D S， et al. Origin and parental genome characterization of the allotetraploid Stylosanthes scabra Vogel （Papilionoideae， Leguminosae）， an important legume pasture crop[J]. Annals of Botany， 2018， 122（7）： 1143-1159.

Delhaize E， Kataoka T， Hebb D M， et al. Genes encoding proteins of the cation diffusion facilitator family that confer manganese tolerance[J]. Plant Cell， 2003， 15（5）： 1131-1142.

劉攀道， 羅佳佳， 白昌軍， 等. 過(guò)量錳處理對(duì)苗期柱花草生長(zhǎng)及抗氧化酶活性的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報(bào)， 2018， 27（9）： 194-200.

陳志堅(jiān)， 嚴(yán)? 煒， 孫麗莉， 等. 錳毒對(duì)柱花草苗期生長(zhǎng)及鐵鎂吸收的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2011， 32（1）： 142-146.

劉攀道， 孫麗莉， 陳志堅(jiān)， 等. 低磷脅迫對(duì)柱花草酸性磷酸酶活性及其組成的動(dòng)態(tài)影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)， 2013， 34（7）： 1340-1346.

Clarkson D T， Marschner H. Mineral nutrition of higher plants[J]. Annals of Botany， 1996， 78（4）： 527-528.

嚴(yán)? 煒， 劉國(guó)道， 田? 江. 錳有效性對(duì)大豆錳、鐵和磷吸收及其分布的影響[J]. 植物生理通訊， 2010， 46（9）： 923-927.

Horiguchi T， Morita S. Mechanism of manganese toxicity and tolerance of plants VI. Effect of silicon on alleviation of manganese toxicity of barley[J]. Journal of Plant Nutrition， 1987， 10（17）： 2299-2310.