林霞 陳崢 朱育菁 李慧敏 鄧文瓊 劉波

摘? 要：紫蘇屬植物的葉具多種生物活性，且有特異性香氣。為探究紫蘇屬不同植物鮮葉揮發(fā)性物質(zhì)異同，以紫蘇、白蘇和檸檬紫蘇為研究對象，采用固相微萃取進行富集提取，運用氣相質(zhì)譜對鮮葉揮發(fā)物進行分離鑒定。結(jié)果表明：（1）紫蘇屬植物鮮葉的揮發(fā)物存在較顯著差異。通過主成分分析，3種紫蘇屬植物的樣本點分別獨自聚為一類;（2）3種紫蘇屬植物高匹配（匹配度≥90%）、高相對含量（相對含量≥2%）的揮發(fā)物存在不同。檸檬紫蘇為檸檬醛、順式-檸檬醛和蘑菇醇等，紫蘇為α-石竹烯、β-石竹烯和洋芹腦等，白蘇則包括β-石竹烯、蘑菇醇和芳樟醇等;（3）3種紫蘇屬植物存在各自特異性揮發(fā)物。檸檬紫蘇葉片中檢測出特異性揮發(fā)物19種，為檸檬醛、β-檸檬醇等。紫蘇有8種，如洋芹腦等。白蘇有6種特異性揮發(fā)物，為芳樟醇等;（4）3種紫蘇屬植物同時存在4個共有揮發(fā)物，分別為β-欖香烯、大根香葉烯、β-石竹烯和蘑菇醇;（5）以所測揮發(fā)物為指標(biāo)，通過聚類分析得到白蘇和紫蘇的樣本聚為一個類群，而檸檬紫蘇的樣本單獨聚為另一類群。本研究為紫蘇屬植物資源的進一步開發(fā)和利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：紫蘇屬;揮發(fā)性物質(zhì);固相微萃取氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法;異質(zhì)性分析

中圖分類號：S567.219? ? ? 文獻標(biāo)識碼：A

Heterogeneity Analysis of Volatile Components of Fresh Leaves of Three Perilla Plants

LIN Xia1， CHEN Zheng2， ZHU Yujing2， LI Huimin2， DENG Wenqiong2， LIU Bo2*

1. Jinshan College， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China; 2. Agricultural Bio-Resources Research Institute， Fujian Academy of Agricultural Sciences， Fuzhou， Fujian 350003， China

Abstract： The leaf Perilla is of specific aroma and of biological activitie. The similarities and differences of the volatile organic compounds in the fresh leaves of P. frutescens （NMZS）， P. frutescens var. frutescens （BS） and P. frutescens var. frutescens （ZS） were studied. Solid phase microextraction （SPME） was used to enrich and extract the volatile compounds. The volatile components were isolated and identified by GC-MS. The volatile components were significantly different in three Perilla plants. The three plants could be clustered into a single group by principal component analysis. The high matching （≥90%） and relatively high content （≥2%） volatile componets of three plants were different. The high matching and high content compounds of NMZS were 3，7-dimethyl-2，6-octadienal， （Z）- 3，7- dimethyl-2，6-octadienal， 1-octen-3-ol etc.， while those of ZS were α-caryophyllene， β-caryophyllene， apiol etc.， and those of BS were β-caryophyllene， 1-octen-3-ol， 3，7-dimethyl-1，6-octadien-3-ol etc. A total of 19 specific volatile components were fould in NMZS （3，7-dimethyl-2，6-octadienal， （Z）-3，7-dimethyl-2，6-Octadienal etc.）， eight in BS （Apiol etc.）， and six in ZS （3，7-dimethyl-1，6-octadien-3-ol and so on）. Common volatiles were also found， which were β-elemene， germacrene D， β-caryophyllene and 1-octen-3-ol. Cluster analysis result showed that BS and ZS could be clustered into one group， while NMZS was clustered into another group. The study would provide a basis for the further development and utilization of Perilla plants.

Keywords： Perilla; volatile components; solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry; heterogeneity analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.03.023

紫蘇屬（Perilla）為唇形科（Labiateae）1年生草本植物，具特殊香味[1]。紫蘇是我國傳統(tǒng)的藥食、油料作物[2]，也是衛(wèi)生部首批公布藥食兼用性植物之一[3-4]，在醫(yī)藥、食品、油料及景觀方面具有重要的應(yīng)用價值[4]。在藥用價值方面，紫蘇葉用于防治風(fēng)寒感冒和咳嗽嘔惡，還能提高機體免疫，有效抑制癌癥發(fā)生[5-6]，藥品中的藿香正氣系列產(chǎn)品均以紫蘇葉油為組分[7];而在食用價值上，紫蘇可作為蔬菜、香料和調(diào)味料等。我國紫蘇資源豐富，紫蘇的研究與開發(fā)具有巨大潛力和廣闊市場[8]。

植物揮發(fā)性有機物（volatile organic compounds， VOCs）是植物體內(nèi)次生代謝途徑合成的低沸點、易揮發(fā)的小分子化合物[9-10]，具有很高的化學(xué)活性[10]。紫蘇作為一種重要的香料植物，其揮發(fā)性物質(zhì)包括單萜類、倍半萜類、苯丙素類和呋喃酮類等，如檸檬烯、紫蘇醛、紫蘇烯、α-法呢烯、β-石竹烯和異白蘇烯酮等[4， 11-12]。目前，國內(nèi)關(guān)于紫蘇屬植物揮發(fā)物的研究，主要集中在紫蘇和白蘇[13]，而對紫蘇其他變種的揮發(fā)物只有零星報道[14]。研究者們采用水蒸氣蒸餾[15]、固相微萃取[16-17]、吹掃捕集[18]等方法提取紫蘇揮發(fā)性物質(zhì)（揮發(fā)油），再結(jié)合氣相色譜質(zhì)譜[19-20]、電子鼻[21]與全二維氣相色譜飛行時間質(zhì)譜[22]等測定揮發(fā)物組成。其中，固相微萃取法（solid-phase microextraction， SPME）具有無需溶劑與前處理、能更好體現(xiàn)揮發(fā)物真實組成[23]的特點，成為檢測植物揮發(fā)物的有效手段。而固相微萃取法還未被應(yīng)用于紫蘇屬不同植物揮發(fā)性物質(zhì)的異質(zhì)性研究中。

紫蘇香氣呈現(xiàn)多樣性[1]，研究者們致力于把復(fù)雜的紫蘇氣味進行區(qū)分和歸類。如Morinaka等[24]通過芳香氣味將紫蘇葉片中氣味分為青草香、紫蘇香、鮮香和刺激性氣味等;而Ito等[25]根據(jù)揮發(fā)油中單萜類或苯丙素類的不同，劃分不同的化學(xué)型。植物的揮發(fā)性物質(zhì)不僅具有生物活性，也作為植物分類的重要參考，對種質(zhì)資源多樣性鑒定及資源材料的應(yīng)用研究非常重要。作者在野外調(diào)查中發(fā)現(xiàn)1種紫蘇屬植物，其葉的主要特征為正面略帶紫色，尤其葉脈周圍更顯紫色，而背面全部為紫色，葉邊緣鋸齒盾圓形，幾乎無毛，其主要特征與《中國植物志》[26]所描述的紫蘇原變種和變種均存在不同。該紫蘇屬植物的葉呈濃郁的檸檬香味，當(dāng)?shù)厮追Q為檸檬紫蘇。為探究檸檬紫蘇與紫蘇原變種（白蘇、紫蘇）在揮發(fā)性物質(zhì)上的異質(zhì)性，本研究選取紫蘇、白蘇和檸檬紫蘇的鮮葉為實驗材料，采用固相微萃取技術(shù)富集提取，通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分離和鑒定，并開展數(shù)據(jù)比對和統(tǒng)計學(xué)分析，嘗試從代謝物水平上探究3種紫蘇屬植物葉片在揮發(fā)物上的差異，為紫蘇資源的進一步研究開發(fā)和利用提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物材料? 供試材料見表1和圖1，取3種紫蘇屬植物鮮葉各3片為實驗材料，分別為檸檬紫蘇（暫名）（NMZS-1、NMZS-2、NMZS-3）、白蘇（BS-1、BS-2、BS-3）、紫蘇（ZS-1、ZS-2、ZS-3）的葉片，樣品采集自福建農(nóng)林大學(xué)校園，?采集時間為2018年6月。選擇成年活體上健康葉片為實驗材料。

1.1.2? 儀器與設(shè)備? Agilent 7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）;HP-5MS色譜柱（美國Agilent公司）;萃取裝置有SPME手動進樣手柄（美國Supleco公司），65 μm PDMS/DVB萃取頭（美國Supleco公司）和20 mL頂空瓶。

1.2? 方法

1.2.1? SPME法萃取? 萃取頭老化條件：65 μm PDMS/DVB萃取頭用丙酮浸泡30 min后，再將萃取頭250 ℃進行老化，老化時間為30 min。

萃取條件：分別稱取鮮葉各1 g，剪碎后置于密封的頂空瓶中，插入萃取頭吸附20 min。

1.2.2? 氣相色譜質(zhì)譜分析條件? 氣相色譜條件：進樣口溫度250 ℃，柱溫50 ℃，起始溫度50 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升到140 ℃，保持3 min，以7 ℃/min升到230 ℃，保持0 min，運行時間，40.357 min。

質(zhì)譜條件：離子源EI;采集模式為全掃描;溶劑延遲6 min;EMV模式為相對值;質(zhì)量掃描范圍：25.00～550.00 amu;閾值設(shè)為0;輔助加熱溫度為280 ℃;MS離子源溫度為230 ℃，MS四級桿溫度150 ℃。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析：采用Agilent MSD Chemstaion;檢測的化合物經(jīng)NIST 05譜庫檢索，結(jié)合文獻報道進行鑒定。揮發(fā)物組分相對含量采用峰面積歸一化法計算，表示為各香氣組分的峰面積占總峰面積之比值。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計：數(shù)據(jù)處理統(tǒng)計采用Agilent Mass Profiler Professional（MPP），采用主成分分析（Principal component analysis， PCA）和聚類分析（Hierarchical cluster analysis， HCA）等多變量統(tǒng)計分析方法比較紫蘇屬3種植物的揮發(fā)物的輪廓差異及篩選導(dǎo)致差異的特征性化學(xué)成分。其中，數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化采用軟件Agilent GC/MS Tran slator;色譜圖解卷積提取采用Agilent MassHunter Workstation Software Qualitative Analysis。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 3種紫蘇屬植物葉片揮發(fā)性物質(zhì)的總離子流圖

3種紫蘇屬植物葉片揮發(fā)物的總離子流圖見圖2。其中，檸檬紫蘇葉片揮發(fā)性物質(zhì)峰主要集中于13～28 min區(qū)間;而白蘇物質(zhì)峰主要分布于24～34 min區(qū)間;紫蘇主要揮發(fā)物峰則集中在19～28 min區(qū)間。

2.2? 3種紫蘇屬植物葉片高匹配揮發(fā)性物質(zhì)分析

把在同一植物樣本的3個重復(fù)中被檢出2次及以上，并且與NIST譜庫匹配度≥90%的揮發(fā)物，定義為該樣本的高匹配揮發(fā)物。從3種紫蘇屬植物中，共統(tǒng)計出高匹配揮發(fā)物48個，結(jié)果見表2。

檸檬紫蘇有30個高匹配揮發(fā)物（占其揮發(fā)物總體相對含量的66.34%），包括檸檬醛（22.37%）、β-石竹烯（19.20%）、順式-檸檬醛（14.93%）、α-石竹烯（3.41%）和蘑菇醇（2.30%）等;而紫蘇中含高匹配物質(zhì)20種（占61.28%），包括β-石竹烯（23.77%）、2，6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯（9.51%）、1，5，9，9-四甲基-1，4，7-環(huán)-十一碳三烯（6.59%）、洋芹腦（6.33%）、蘑菇醇（5.37%）和α-石竹烯（3.57%）等;白蘇中有16種高匹配物質(zhì)（占21.29%），主要揮發(fā)物則包括β-石竹烯（7.15%）、蘑菇醇（5.12%）、芳樟醇（3.58%）和3，7，11-三甲基-1，3，6，10-十二碳-四烯（2.15%）等。

2.3? 3種紫蘇屬植物葉片高匹配高相對含量

揮發(fā)性物質(zhì)分析

以匹配度≥90%且相對含量≥2%為指標(biāo)，篩出高匹配、高相對含量物質(zhì)，共計10個（表3）。分別占檸檬紫蘇、紫蘇和白蘇其相對含量的62.21%、55.14%和18.00%。β-石竹烯和蘑菇醇在3組紫蘇中含量都較高，而各組又有各自特異的主要揮發(fā)物。

檸檬紫蘇的主要揮發(fā)物有5個，包括檸檬醛（占其相對含量為22.37%）、β-石竹烯（19.20%）、順式-檸檬醛（14.93%）、α-石竹烯（3.41%）和蘑菇醇（2.30%）;而在紫蘇葉片中主要揮發(fā)物有6個，包括β-石竹烯（23.77%）、2，6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯（9.51%）、1，5， 9，9-四甲基-1，4，7-環(huán)十一碳-三烯（6.59%）、洋芹腦（6.33%）、蘑菇醇（5.37%）和α-石竹烯（3.57%）;白蘇主要揮發(fā)物則包括β-石竹烯（7.15%）、蘑菇醇（5.12%）、芳樟醇（3.58%）和3，7，11-三甲基-1，3，6，10-十二碳-四烯（2.15%）。

2.4? 3種紫蘇屬植物葉片共有揮發(fā)性物質(zhì)分析

3種紫蘇屬植物的揮發(fā)物中包含4種共有成分，分別為β-欖香烯、大根香葉烯、β-石竹烯和蘑菇醇（表4）。其中相對含量最高的為β-石竹烯，分別占檸檬紫蘇、紫蘇和白蘇葉片揮發(fā)物相對含量為19.20%、23.77%和7.15%;其次為蘑菇醇，占檸檬紫蘇、紫蘇和白蘇葉片揮發(fā)性物相對含量為2.30%、5.37%和5.12%。

對3種紫蘇的葉片揮發(fā)物進行兩兩對比，得到以下結(jié)果：（1）檸檬紫蘇和紫蘇共有的揮發(fā)物為8種，分別為β-欖香烯、大根香葉烯、β-石竹烯、蘑菇醇、α-蓽澄茄油烯、α-石竹烯、石竹烯氧化物和（+）-雙環(huán)倍半水芹烯;（2）檸檬紫蘇與白蘇共有揮發(fā)物為7種，分別為β-欖香烯、大根香葉烯、β-石竹烯、蘑菇醇、古巴烯、δ-杜松烯和別香橙烯;（3）紫蘇和白蘇有共有的揮發(fā)物為7種，分別為β-欖香烯、大根香葉烯、β-石竹烯、蘑菇醇、α-法呢烯、（-）-β-波旁烯和1，5，9，9-四甲基-1，4，7-環(huán)十一碳-三烯。

2.5? 3種紫蘇屬植物葉片特異性揮發(fā)性物質(zhì)分析

結(jié)果見表5。從檸檬紫蘇葉片中檢測出的特異性揮發(fā)物有19種，為檸檬醛（占其相對含量的22.37%）、順式-檸檬醛（14.93%）和β-檸檬醇（0.53%）等;而紫蘇葉片特異性揮發(fā)物有8種，為2，6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯（占其相對含量的9.51%）和洋芹腦（6.33%）等;白蘇葉片特異性揮發(fā)物則有6種，包括芳樟醇（占其相對含量的3.58%）等。

2.6? 3種紫蘇屬植物鮮葉揮發(fā)物的聚類分析

以樣本中測出的揮發(fā)物為指標(biāo)，進行聚類分析，結(jié)果見圖3。9個樣品分為2大類群，類群1包括白蘇和紫蘇的各3個樣本，而類群2為檸檬紫蘇的3個樣本。從感官上評價，檸檬紫蘇具特殊的檸檬香味，氣味與紫蘇和白蘇有明顯不同，聚類結(jié)果與實際情況相吻合。

2.7? 3種紫蘇屬植物鮮葉揮發(fā)物的主成分分析

以檢測到的揮發(fā)物為指標(biāo)，構(gòu)建數(shù)據(jù)矩陣，對3種紫蘇屬植物樣品進行主成分分析（Principal Component Analysis， PCA），結(jié)果見圖4。從PCA結(jié)果可知，3種紫蘇屬植物各自的樣品點都比較集中，各自聚為1類。在2D PCA中組分1和組分2的累積貢獻率也達到96.74%。其中在3D PCA中，X軸為組分1，貢獻率為60.48%;Y軸為組分2，貢獻率為36.26%;Z軸為組分3，貢獻率為2.25%，組分1～3的累積貢獻率為98.99%。在PCA得分圖中，9個樣本聚為3類，分別為紫蘇、白蘇和檸檬紫蘇，提示這3種植物的揮發(fā)物存在較顯著差異。

3? 討論

紫蘇是重要的經(jīng)濟作物，研究與利用紫蘇成為世界性的熱點課題[27]。據(jù)報道，紫蘇屬的不同植物在用途、品質(zhì)及作用上存在一定差異[28]，但紫蘇的分類地位尚有爭論[29-30]。根據(jù)《中國植物志》[26]記載，紫蘇屬有1種3變種，即紫蘇（原變種包括紫蘇和白蘇）P. fruteseens var. frutescens、野生紫蘇P. frutescens var. purpurascens、回回蘇P. Fruteseens var. crispa和耳齒紫蘇 P. frutescens var. auriculato-dentata[26]。隨后，國內(nèi)研究者們提出各自不同的觀點，劉月秀等[31]將紫蘇屬植物分為4個變種（白蘇、紫蘇、回回蘇和野生紫蘇）;郭鳳根等[32]將云南省紫蘇屬植物分為5個變種（紫蘇、白蘇、回回蘇、野生紫蘇和耳齒紫蘇）;Yan等[33]將紫蘇分為5個變種（白蘇、紫蘇、耳齒紫蘇、回回蘇和野生紫蘇變種）。由于紫蘇屬遺傳穩(wěn)定性差[1]，用其他技術(shù)手段輔助結(jié)合植物形態(tài)識別，成為解決紫蘇變種的分類難題的途徑。

紫蘇屬植物具特異香氣，被用作食用蔬菜和香辛料。植物的揮發(fā)性物質(zhì)不僅具很高化學(xué)活性，也是植物分類的重要依據(jù)，對種質(zhì)資源多樣性鑒定及資源材料的應(yīng)用研究非常重要。目前，紫蘇的揮發(fā)物提取多采用水蒸氣蒸餾法[15]。紫蘇材料經(jīng)高溫蒸餾、冷凝、油水分離、澄清和除水等步驟后，得到紫蘇的揮發(fā)油。但該方法也存在一定弊端，如蒸餾提取可能造成的小分子揮發(fā)物的損失。固相微萃取法（SPME）無需溶劑與前處理，從樣品中直接采集揮發(fā)性成分，能更好地體現(xiàn)被檢測揮發(fā)物的真實組成[23]。本研究結(jié)果表明，在檸檬紫蘇和紫蘇樣品中，高匹配高含量的物質(zhì)均達到了55%以上。因此，固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用法可應(yīng)用于紫蘇屬植物葉片的揮發(fā)性物質(zhì)的檢測。

本研究對3種紫蘇屬植物鮮葉的揮發(fā)物進行聚類分析，其中白蘇和紫蘇的樣本聚為1個類群，而檸檬紫蘇的樣本單獨聚為另1類群。該結(jié)論與樣品的嗅覺體驗相符，檸檬紫蘇葉片具有的特殊檸檬香味，在嗅覺體驗上與紫蘇和白蘇存在明顯差異。為對比3種紫蘇屬植物葉片揮發(fā)物的異同，對高匹配、高相對含量的揮發(fā)物進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，此類揮發(fā)物存在差異，檸檬紫蘇為檸檬醛、順式-檸檬醛和蘑菇醇等;紫蘇為α-石竹烯、β-石竹烯和洋芹腦等;白蘇則包括β-石竹烯、蘑菇醇、芳樟醇等。此外，對3種紫蘇屬植物鮮葉揮發(fā)物中的特異性揮發(fā)物和共有揮發(fā)物進行統(tǒng)計，結(jié)果表明，3種紫蘇屬植物中存在各自特異性揮發(fā)性代謝物，檸檬紫蘇葉片中存在特異性揮發(fā)性物質(zhì)19種（檸檬醛、β-檸檬醇等）;而紫蘇葉片特異性揮發(fā)性物質(zhì)有8種（洋芹腦等）;白蘇葉片特異性揮發(fā)性物質(zhì)則有6種（芳樟醇等）;而在共有化合物方面，3種紫蘇屬植物葉片中存在共有揮發(fā)物4個，分別為β-欖香烯、大根香葉烯、β-石竹烯和蘑菇醇。另外，本研究中檢測出的揮發(fā)物，研究者們對紫蘇植株揮發(fā)物中也有報道，包括β-石竹烯[34-37]、β-欖香烯[34-37]、蘑菇醇[34-36， 38]、石竹烯氧化物[38]、香橙烯[34， 36]、α-蓽澄茄油烯[37]、2，6-二甲基-6-（4-甲基-3-戊烯基）雙環(huán)[3.1.1]庚-2-烯[37]，α-石竹烯[34-36]、大根香葉烯[34， 36]、α-廣藿香萜烯[37]、橙花叔醇[34-36]、洋芹腦肉[34， 36]、豆蔻醚[34， 36]、α-法呢烯[35， 38]等。本研究檢出的紫蘇的揮發(fā)性物質(zhì)，對照文獻報道，具有以下生物活性：（1）消炎抑菌：芳樟醇具有鎮(zhèn)痛、抗焦慮、鎮(zhèn)靜催眠、抗炎、抗腫瘤、抗菌等藥理活性[37];（2）香精和添加劑：α-法呢烯主要存在于甜橙油、玫瑰油、依蘭依蘭油和桔子油等精油中;（3）抗癌抗腫瘤：欖香烯是一種抗癌成分，用于治療腦癌、肺癌和消化道腫瘤等[38]。

通過3種不同紫蘇屬植物鮮葉揮發(fā)物的研究，為進一步開展紫蘇的種屬特異性和生物活性提供基礎(chǔ)，為該屬植物資源的進一步開發(fā)和利用提供參考。而氣候變化、水分，溫度，光照，土壤營養(yǎng)、植株差異等因素，是否對紫蘇的揮發(fā)性物質(zhì)存在影響，還有待進一步研究和探索。

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