周學(xué)輝

一、綜述

在生物體系中，Ag+是一種重要的金屬離子，由于Ag+的抗菌活性和它與核酸的相互作用，一直以來很受關(guān)注。近期，李濤等報(bào)道了一種利用G-四鏈體-hemin DNA酶比色法檢測(cè)溶液中Ag+和Cys的方法。這種方法是利用Ag+能夠與DNA二倍體/雙鏈結(jié)構(gòu)中的兩個(gè)錯(cuò)配胞嘧啶堿基C結(jié)合，形成C-Ag+-C金屬堿基對(duì)，使錯(cuò)配的C-C堿基對(duì)更穩(wěn)定，從而增強(qiáng)G-四鏈體-hemin配合物的過氧化物酶活性。這種方法的檢測(cè)結(jié)果很好，其中Ag+檢測(cè)體系的檢測(cè)限可達(dá)2.5 nM，但是由于反應(yīng)體系的最大吸光度值僅為0.08，所以需要靈敏度很高的檢測(cè)儀器，同時(shí)要求操作技術(shù)精準(zhǔn)。本工作中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種高靈敏度、高選擇性的Ag+定量檢測(cè)方法，但是檢測(cè)原理與李濤等報(bào)道的方法完全不同。我們的檢測(cè)方法是基于Ag+對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)的破壞作用。檢測(cè)體系吸光信號(hào)的差值可達(dá)0.45。由于Ag+與Cys具有很強(qiáng)的結(jié)合能力，使被Ag+破壞的G-四鏈體可以重新形成，利用這個(gè)過程通過簡(jiǎn)單的比色測(cè)定可設(shè)計(jì)一種Cys的靈敏檢測(cè)方法。由于Ag+檢測(cè)體系和Cys檢測(cè)體系在檢測(cè)過程中都可以產(chǎn)生較大的信號(hào)變化，反應(yīng)體系顏色的改變能夠用肉眼即可觀察，因此可以設(shè)計(jì)一種簡(jiǎn)單的肉眼檢測(cè)Ag+和Cys的方法。

二、儀器與試劑

TC-48/H（t）型基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀（杭州博日科技有限公司）

UV-1901紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）

Jasco J-820分光偏振計(jì)

UB-7 PH酸度計(jì)（北京賽多利斯科技儀器有限公司）

TGL-16C高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）

H-1微式混合器（上海強(qiáng)運(yùn)科技有限公司）

BS124S電子天平（北京賽多利斯科技儀器有限公司）

數(shù)碼相機(jī)（尼康）

DNA從上海生工生物技術(shù)有限公司定制合成;H2O2，Triton X-100，hemin，Tris（三（羥甲基）氨基甲烷），氨基酸，谷胱甘肽，ABTS，DMSO（二甲亞砜），HAc，KAc，AgNO3，Mg（NO3）2，Cu（NO3）2，Mn（Ac）2，Zn（Ac）2，Cr（NO3）3，Pb（NO3）2，Ni（NO3）2，Co（Ac）2，Cd（NO3）2，F(xiàn)e（NO3）3，Hg（Ac）2，Ca（Ac）2均從Sigma公司購(gòu)買。純度均為分析純。

DNA溶液的配制：溶于二次去離子水中，寡核苷酸的濃度以單鏈濃度的形式表示，其濃度通過測(cè)量260nm處的吸光度再根據(jù)對(duì)應(yīng)的消光系數(shù)計(jì)算得到。

hemin溶液的配制：稱取0.01304g的hemin，溶于4mLDMSO中，使用時(shí)根據(jù)需要稀釋。

本實(shí)驗(yàn)所用到的核苷酸鏈為：CatG4：5′-TGGGTAGGGCGGGTTG

GGAAA

三、結(jié)果與討論

（一）Ag+和半胱氨酸（Cys）檢測(cè)體系的設(shè)計(jì)

G-四鏈體是由具有連續(xù)G序列的DNA形成的一種特殊的核酸二級(jí)結(jié)構(gòu)，它是由四個(gè)鳥嘌呤堿基G通過Hoogsteen氫鍵的配對(duì)方式首尾連接構(gòu)成平面的G-四分體（圖1A），相鄰的G-四分體平面之間又通過-堆積作用而形成的。據(jù)報(bào)道，Ag+與鳥嘌呤堿基G之間能夠以螯合的方式結(jié)合（圖1B），而結(jié)合位點(diǎn)恰恰是G-四鏈體中Hoogsteen氫鍵的形成位點(diǎn)。因此，Ag+與鳥嘌呤堿基G的結(jié)合可以阻礙G-四鏈體的形成，從而抑制G-四鏈體-hemin DNA酶的過氧化物酶活性（圖1C）。我們假設(shè)如果體系中過氧化物酶活性的降低取決于Ag+的濃度變化，那么就可以設(shè)計(jì)一種新的檢測(cè)Ag+的方法。Ag+具有抗菌活性，其抗菌原理主要是Ag+和硫醇鍵相結(jié)合，從而殺死細(xì)菌。Cys是一種生命體內(nèi)常見的含硫氨基酸，通過二硫鍵使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部交聯(lián)。Cys中的巰基（-SH）能夠與Ag+結(jié)合從而抑制了Ag+的活性，因此基于G-四鏈體與Cys對(duì)Ag+的競(jìng)爭(zhēng)，可將上述Ag+的檢測(cè)方法進(jìn)行進(jìn)一步設(shè)計(jì)用于Cys的檢測(cè)。Cys檢測(cè)方法的原理如圖1C所示。Ag+優(yōu)先與Cys結(jié)合，因此Cys能夠?qū)⒐押塑账徭溨信cG堿基絡(luò)合的Ag+置換出來，G-四鏈體重新形成，結(jié)果應(yīng)使檢測(cè)體系的過氧化物酶活性增強(qiáng)。如果檢測(cè)體系的過氧化物酶活性能夠隨著Cys濃度的增加而增強(qiáng)，那么基于這一反應(yīng)就可以設(shè)計(jì)一種新的檢測(cè)Cys的方法。為了驗(yàn)證上述假設(shè)是否成立，我們對(duì)Ag+和Cys加入前后CatG4的圓二色（CD）光譜的變化進(jìn)行了比較（圖2），不加Ag+時(shí)，CatG4的CD光譜在265nm附近有一個(gè)正的吸收峰，表明CatG4形成了平行的G-四鏈體。而加入Ag+后，CatG4的CD光譜信號(hào)強(qiáng)度急劇下降，表明CatG4形成的G-四鏈體結(jié)構(gòu)被破壞，與預(yù)期一致。Cys自身沒有CD信號(hào)，但是向CatG4/Ag+混合物加入Cys后，CD信號(hào)明顯增強(qiáng)，這表明G-四鏈體結(jié)構(gòu)又重新形成。然后向上述溶液中分別加入hemin后再做CD光譜，CD光譜的吸收峰與不加hemin的基本一致，這表明hemin的存在與否對(duì)Ag+和CatG4的相互作用沒有影響。

另外我們還研究了Ag+和Cys對(duì)過氧化物酶活性的影響，從圖3A可以看出，hemin自身的過氧化物酶活性很弱，而CatG4與hemin形成的配合物具有很強(qiáng)的過氧化物酶活性，能夠有效的催化H2O2氧化ABTS的反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物ABTS˙+在422nm處有最大吸收。同時(shí)，反應(yīng)混合物呈現(xiàn)特征綠色。向CatG4溶液中加入Ag+（終濃度為3μM）后，體系的吸光信號(hào)急劇下降，幾乎與背景吸收值接近，反應(yīng)混合物基本無色。2μM Cys的加入使體系的過氧化物活性明顯提高。這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象與圖1C所示反應(yīng)原理完全吻合。本工作中采用的是ABTS-H2O2的反應(yīng)體系，Ag+的加入導(dǎo)致吸收信號(hào)降低了將近0.45，這個(gè)變化通過肉眼就可以觀察到（圖3B）。因此，利用這個(gè)結(jié)果可以開發(fā)一種簡(jiǎn)單的肉眼檢測(cè)Ag+和Cys的方法。