魏躍　陳景景　鄭宏偉　許建　顏志明　孫朋朋

摘要：為創(chuàng)制矮牽牛三倍體種質(zhì)并對其進行細(xì)胞學(xué)研究，以矮牽牛二倍體、四倍體為親本進行正反雜交，對雜交后代進行染色體計數(shù)并與雙親進行農(nóng)藝性狀、解剖學(xué)比較，采用常規(guī)壓片法對三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進行觀察。結(jié)果表明：（1）以二倍體、四倍體為親本進行正反雜交可獲得三倍體矮牽牛，但結(jié)籽率均較低;（2）同源三倍體終變期大部分細(xì)胞內(nèi)都出現(xiàn)單價體、二價體和三價體共存的現(xiàn)象，中期Ⅰ和中期Ⅱ出現(xiàn)游離在赤道板外的染色體，后期Ⅰ染色體有10/11、9/12、8/13和少數(shù)7/14分離方式，并出現(xiàn)姊妹染色單體提前發(fā)生分離和丟失染色體等異?，F(xiàn)象?；ǚ勰讣?xì)胞減數(shù)分裂異常導(dǎo)致了大量不育花粉的形成，同源三倍體創(chuàng)制為初級三體系選育奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：矮牽牛;同源三倍體;染色體;花粉;減數(shù)分裂

中圖分類號： S681.601

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）02-0131-05

收稿日期：2018-12-19

作者簡介：陳景景（1996—），女，江蘇徐州人，主要從事園藝花卉育種與栽培研究。E-mail：695355008@qq.com。

通信作者：魏 躍，博士，教授，主要從事園藝花卉細(xì)胞學(xué)與遺傳育種研究。E-mail：1069125418@qq.com。

同源三倍體為植株細(xì)胞具有三套來源相同的染色體組，具有廣泛的應(yīng)用價值，不但可用于雜種優(yōu)勢和無籽果實的生產(chǎn)[1]，還可作為介質(zhì)合成單體、三體等各種非整倍體遺傳材料[2-3]，其中單體、三體是進行基因定位、確定連鎖群與染色體關(guān)系研究的重要遺傳材料[4]。同源三倍體一般是通過二倍體、四倍體雜交獲得，在橙子[5]、西瓜[6]、甜瓜[6]、葡萄[7]、結(jié)球甘藍(lán)[8]等作物上都已有成功報道。

矮牽牛（Petunia hybrida Vilm.）為茄科矮牽牛屬1年生草本花卉，是目前廣泛應(yīng)用的重要花壇花卉之一。近年來，國內(nèi)研究人員已對矮牽牛開展了聚類分析[9]、花藥培養(yǎng)[10]、基因克隆[11-12]、遺傳轉(zhuǎn)化[13]和多倍體[14]等多方面研究，但關(guān)于三倍體種質(zhì)創(chuàng)制及相關(guān)細(xì)胞學(xué)研究還沒有過報道。

本研究以二倍體、四倍體矮牽牛為材料進行同源三倍體矮牽牛種質(zhì)創(chuàng)制，并對其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂進行觀察和分析，這不僅豐富了矮牽牛種質(zhì)資源創(chuàng)制及相關(guān)細(xì)胞學(xué)內(nèi)容，也為系列初級三體等非整倍體創(chuàng)制和細(xì)胞遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

同源四倍體材料07-12為江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院花卉遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新課題組培育，二倍體品種夢幻（藍(lán)色）來源于浙江虹越花卉股份有限公司，后經(jīng)過多代自交保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 同源三倍體的獲得與鑒定 2015—2016年3月在江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝試驗基地（119.17°E、31.95°N）播種07-12和夢幻，6月上旬2個親本進入花期后以07-12、夢幻分別為父母本進行正反雜交，每次分別授粉50朵，重復(fù)3次，7～10 d后統(tǒng)計坐果率，23～35 d后統(tǒng)計單果結(jié)籽數(shù)，同時2個親本分別自交作為對照。坐果率=果實數(shù)/授粉花朵數(shù)×100%;單果結(jié)籽數(shù)=飽滿種子數(shù)/果實數(shù)。

2016—2017年3月播種矮牽牛F1雜交種子，5月中旬F1植株進入花期后，于晴天08：00—10：00取長度0.5～1.0 cm的幼小花蕾，參考張紅梅等的方法[15]進行預(yù)處理、固定、水浴和染色等操作，切開子房取中心部位少量分生組織常規(guī)壓片，觀察有絲分裂中期分裂相進行染色體計數(shù)。

1.2.2 三倍體與父母本農(nóng)藝性狀和解剖學(xué)比較 觀察記錄F1三倍體與父母本植株的株高、冠幅、萼片等農(nóng)藝性狀并進行比較分析;將葉片背面表皮用鑷子撕下在40倍顯微鏡下用帶有標(biāo)尺的目鏡測量氣孔大小[16];取同源三倍體矮牽牛F1植株成熟花粉粒于載玻片上，用1%醋酸洋紅染色3～5 min，在光學(xué)顯微鏡下觀察。以染色深、大小正常、外形圓的為可育花粉，不染色或染色淺、外形皺縮畸形的為敗育花粉[17]，統(tǒng)計可育花粉率，可育花粉率=可染花粉數(shù)/花粉總數(shù)×100%。

1.2.3 同源三倍體減數(shù)分裂觀察 矮牽牛F1三倍體植株進入開花期后，于晴天08：00—10：00取長度4～7 mm的幼蕾，按照同源四倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察方法[18]進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 同源三倍體的獲得與子代染色體分布

獲得同源三倍體雜種的途徑通常都以同源二倍體、四倍體為親本進行正反交。由表1可知，以矮牽牛四倍體07-12、二倍體夢幻為雜交親本的正交坐果率為72%，反交坐果率為64%，授粉后結(jié)果率均較高，表明二倍體、四倍體正反交均能較好地完成授粉受精，子房能夠正常生長膨大;而正反交果實中含有發(fā)育正常的種子數(shù)均很少，正交單果種子數(shù)1.2個，反交為1.0個，與四倍體07-12自交單果種子數(shù)73個、二倍體夢幻自交207個相差很大，這表明正反交胚胎在發(fā)育過程中絕大多數(shù)都發(fā)生了敗育，不能夠形成正常種子。

對雜交F1后代植株的染色體數(shù)目進行觀察，由表2可知，正交后代中檢測的9株中有6株為2n=21的三倍體（圖1-1），還有2n=20、2n=22的非整倍體各1株和2n=28的四倍體1株;反交后代檢測的6株中有3株為2n=21的三倍體，還有2n=22的非整倍體1株、2n=14的二倍體和2n=28的四倍體各1株。雜交后代中都出現(xiàn)了少量四倍體，正交是因為二倍體父本產(chǎn)生了少量2n花粉，反交中則為二倍體母本產(chǎn)生了少量2n卵細(xì)胞。

2.2 三倍體與父母本農(nóng)藝性狀和解剖學(xué)比較

由表3可知，同源三倍體F1冠幅、主莖粗、萼片寬均顯著或極顯著大于雙親，而株高、花瓣直徑、萼片長度偏向于數(shù)值較大的雙親中的一方，且與之差異不顯著，葉片長度與寬度、柱頭直徑、氣孔長度與寬度和花粉直徑介于雙親之間，花色則與父母本都不相同（圖2）?？捎ǚ勐室訤1三倍體最低，為44.7%，花粉外觀形態(tài)有圓形、三角形和四邊形（圖1-2），二倍體夢幻最高，為95.2%，外觀形態(tài)以圓形和三角形為主（圖1-3），四倍體07-12為76.5%，以四邊形為主（圖1-4）。

2.3 三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察

三倍體矮牽?；ǚ勰讣?xì)胞的減數(shù)分裂過程基本符合二倍體植物減數(shù)分裂的規(guī)律，包括2次連續(xù)的核分裂和1次同時細(xì)胞質(zhì)分裂，但也有一些異?，F(xiàn)象。

前期Ⅰ的細(xì)線期染色體成細(xì)絲狀（圖1-5），雙線期染色體開始縮短變粗，配對的同源染色體開始排斥分離，7個長線狀染色體呈現(xiàn)0、U、N、S、9、ǒ等形狀（圖1-6）。終變期染色體進一步短縮，36.7%的細(xì)胞核內(nèi)分布著7個同源配對的三價體， 多呈現(xiàn)棒狀、U形或Y形（圖1-7），其余大部分細(xì)胞核內(nèi)都出現(xiàn)單價體、二價體和三價體混合共存的現(xiàn)象（圖1-8），經(jīng)統(tǒng)計平均單價體為3.8，二價體為3.2，三價體約為3.6。

中期Ⅰ：大多數(shù)細(xì)胞染色體排列在赤道板上（圖1-9、圖1-10），也有約6.2%的少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)游離在赤道板外染色體（圖1-11）。通常在此期，二價體即將解離成2個單價體（圖1-9），三價體將解離成二價體和單價體（圖1-10）。

后期Ⅰ：二價體、三價體配對的同源染色體分別呈現(xiàn) 1 ∶1 和1 ∶2分離，由紡錘絲隨機牽引至兩極，未配對的單價體則隨機牽引至兩極中的任一極，因此導(dǎo)致兩極的染色體數(shù)目不等。觀察了318個花粉母細(xì)胞，有10/11（圖1-12）、9/12（圖1-13）、8/13（圖1-14）和7/14（圖1-15）多種分離方式，經(jīng)統(tǒng)計，其比率分別為57.9%、32.4%、8.4%和1.3%。

后期Ⅰ中染色體不均等分離將導(dǎo)致各種非整倍體配子形成，為創(chuàng)制系列非整倍體提供了可能[19]，其中可利用8/13分離通過回交直接獲得初級三體[17]，而7/14則是獲得2n配子的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[20]。后期Ⅰ姊妹染色單體一般不分離，但少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)姊妹染色單體提前發(fā)生分離（圖1-14至圖1-18），其中有位于同極的1對姊妹染色單體提前發(fā)生分離（圖1-14），1對（圖1-16）和2對（圖1-17）姊妹染色單體提前發(fā)生分離分別牽引至兩極，還有提前分離的姊妹染色單體（圖1-18）和單價體（圖1-19）滯留在主核外成為丟失染色體，丟失染色體將導(dǎo)致微核形成。

末期Ⅰ：存在落后和丟失染色體（圖1-20）和染色體橋現(xiàn)象（圖1-21）。

中期Ⅱ：大部分細(xì)胞2組染色體分別排列在各自的赤道板上，約有10.4%的細(xì)胞出現(xiàn)赤道板外染色體（圖1-22）。

后期Ⅱ：大多數(shù)細(xì)胞中2組染色體的姊妹染色單體正常分離移向四極，觀察到主要有10/10/11/11（圖1-23）、9/9/12/12（圖1-24）、8/8/13/13（圖1-25）染色體分離方式，經(jīng)統(tǒng)計，其比率分別為53.6%、37.1%、9.3%。

末期Ⅱ：存在落后和丟失染色體（圖1-26）。

四分體時期：正常四分體比率約為86.7%，主要有四面體型和平行型2種類型（圖1-27）。減數(shù)分裂過程中滯留在細(xì)胞質(zhì)的丟失染色體往往導(dǎo)致微核形成，觀察到具有1～2個微核的四分體（圖1-28）。

對三倍體花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂的中期Ⅰ、后期Ⅰ、末期Ⅰ、中期Ⅱ、末期Ⅱ和四分體6個時期染色體異常行為進行統(tǒng)計分析，結(jié)果表明，各時期平均約有8.6%的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂表現(xiàn)異常（表4）。

3 討論與結(jié)論

獲得植物同源三倍體的途徑主要是通過二倍體、四倍體進行雜交，而二倍體、四倍體雜交不稔或稔性低是普遍存在的現(xiàn)象，如大白菜[21]、白菜[22]就未能獲得同源三倍體， 谷子三倍體結(jié)籽率為0.24%[23]、甘藍(lán)為3.61%[24]、菜薹僅為0.37粒/莢[25]。本試驗中以二倍體、四倍體矮牽牛作親本進行正反雜交均能夠獲得較高的坐果率，但單果結(jié)籽數(shù)均較低，表明正反雜交柱頭能夠接受花粉受精，子房能正常膨大，但胚胎發(fā)育成種子過程中均存在嚴(yán)重障礙。對菜薹胚胎學(xué)研究表明，三倍體胚胎敗育是由于胚乳的衰退失去了養(yǎng)分來源，同時內(nèi)珠被細(xì)胞迅速壞死阻塞營養(yǎng)物質(zhì)的運輸通道[25]，矮牽牛三倍體敗育具體原因還有待對胚胎的發(fā)育過程進行研究。

同源三倍體矮牽牛的花藥大都能正常開裂，花粉較多，可育率為44.7%，作為父本與二倍體雜交都有較高的結(jié)籽率。一般認(rèn)為，三倍體的育性與染色體基數(shù)有關(guān)，染色體基數(shù)少的物種產(chǎn)生具完整染色體組配子的概率較大，育性較高。但黃瓜和矮牽牛染色體基數(shù)都為x=7，而黃瓜同源三倍體花粉可育率僅有18.8%[17]，谷子染色體組基數(shù)為x=9，甘藍(lán)為 x=10，谷子三倍體幾乎沒有生活力花粉[23]，甘藍(lán)同源三倍體花粉生活力卻高達(dá)65.49%[24]，可見染色體基數(shù)數(shù)量不是決定因素。三倍體矮牽牛后期Ⅱ由染色體分離方式7/7/14/14形成完整染色體組花粉理論比率為（1/2）6=1.56%，而花粉可育率卻為44.7%，表明許多非整倍性染色體數(shù)目的花粉具有生活力，可見植物三倍體的育性主要由對添加額外染色體的忍受程度決定，矮牽牛具體添加了哪些染色體的非整倍體花粉仍具有生活力尚有待進一步研究。

本研究獲得的同源三倍體無論是自交還是與二倍體回交都有較高的結(jié)籽率，下一步將對雜交后代進行染色體計數(shù)和鑒定，從中篩選各種三體、單體等非整倍體，矮牽牛同源三倍體的成功獲得為后續(xù)細(xì)胞遺傳研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李 健，王錦秀，王立英，等. 無籽枸杞新品種選育研究[J]. 西北植物學(xué)報，2001，21（3）：446-450.

[2]張成合，王東平，申書興，等. 菜薹部分初級三體的選育與細(xì)胞學(xué)鑒定[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，36（6）：681-684.

[3]Ishiki K.Cytogenetical studies on African rice，Oryza glaberrima Steud.3.Primary trisomic produced by pollinating autotriploid with diploid[J]. Euphytica，1991，55（1）：7-13.

[4]Khush G S，Singh R J，Sur S C，et al. Primary trisomic of rice：origin，morphology，cytology，and use in linkage mapping[J]. Genetics，1984，107（1）：141-163.

[5]陳方永，倪海枝，徐小菊，等. 種間雜交培育“溫嶺高橙”三倍體雜種[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2013，39（5）：531-536.

[6]劉文革，王 鳴. 西瓜甜瓜育種中的染色體倍性操作及倍性鑒定[J]. 果樹學(xué)報，2002，19（2）：132-135.

[7]趙艷華，程和禾，吳雅琴，等. 三倍體葡萄種質(zhì)創(chuàng)新及倍性快速鑒定[J]. 園藝學(xué)報，2011，38（6）：1161-1166.

[8]滿 紅，張成合，柳霖坡，等. 結(jié)球甘藍(lán)二、四倍體間雜交三倍體的獲得及細(xì)胞學(xué)鑒定[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2005，6（4）：405-408.

[9]吳志祥，聶京濤，曹 嫻，等. 利用ISSR對矮牽牛品種遺傳多樣性的聚類分析[J]. 上海交通大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2012，30（3）：36-44.

[10]代色平，包滿珠. 矮牽?；ㄋ幣囵B(yǎng)及植株再生研究[J]. 亞熱帶植物科學(xué)，2003，32（2）：55-57.

[11]郭余龍，閆明旭，陳 君，等. 矮牽牛PMADS9基因啟動子的克隆及分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2011，12（2）：275-280.

[12]楊 莎，張 彬，韓 垚，等. 矮牽牛PDS基因的克隆及其在shRNA介導(dǎo)的基因沉默中的應(yīng)用[J]. 園藝學(xué)報，2017，44（2）：315-322.

[13]李 穎，劉姬艷，胡江琴，等. 矮牽牛轉(zhuǎn)基因體系的建立及轉(zhuǎn)BIO和bio基因研究初報[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報（農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版），2013，39（1）：42-49.

[14]魏 躍，王開凍，李洪海，等. 矮牽牛四倍體的誘導(dǎo)及其形態(tài)特征[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（3）：125-127.

[15]張紅梅，張蜀寧，孔艷娥，等. 利用青花菜幼嫩雌蕊進行染色體核型分析[J]. 園藝學(xué)報，2009，36（5）：727-730.

[16]張凌媛，郭啟高，李曉林，等. 枇杷氣孔保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體數(shù)目與倍性相關(guān)性研究[J]. 果樹學(xué)報，2005，22（3）：229-233.

[17]刁衛(wèi)平，崔 利，江 彪，等. 黃瓜同源三倍體創(chuàng)制及減數(shù)分裂行為觀察[J]. 西北植物學(xué)報，2009，29（1）：36-42.

[18]魏 躍，張蜀寧，隋益虎，等. 同源四倍體矮牽牛花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂觀察[J]. 西北植物學(xué)報，2008，28（9）：1742-1745.

[19]申書興，侯喜林，張成合. 利用小孢子培養(yǎng)創(chuàng)建大白菜初級三體的研究[J]. 園藝學(xué)報，2006，33（6）：1209-1214.

[20]鐘 程，張蜀寧，于旭紅，等. 白菜2n配子誘導(dǎo)及有性多倍化創(chuàng)制四倍體的研究[J]. 園藝學(xué)報，2010，37（11）：1789-1795.

[21]劉學(xué)岷，申書興，孫日飛，等. 大白菜二倍體與四倍體雜交后代倍性及胚胎學(xué)觀察[J]. 園藝學(xué)報，1996，23（3）：309-311.

[22]胡金良，徐漢卿，劉惠吉，等. 二倍體和四倍體小白菜的胚胎學(xué)研究[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1996，19（4）：15-19.

[23]王潤奇，高俊華，王志興，等. 谷子三體系列的建立[J]. 植物學(xué)報，1994，36（9）：690-693.

[24]柳霖坡，張成合，張 麗，等. 甘藍(lán)異倍體間雜交獲得三倍體和非整倍體的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，26（3）：69-72.

[25]張成合，張書玲，申書興，等. ‘青露菜薹三倍體的獲得及其胚胎學(xué)觀察[J]. 園藝學(xué)報，2001，28（4）：317-322.李剛波，陳 剛，趙 林，等. 大棚栽培對砂梨果實生長發(fā)育及品質(zhì)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（2）：136-139.