孫靈慧,陳 捷,徐 娟,李敏青,陳文銳

(廣州海關(guān)技術(shù)中心, 廣東省動(dòng)植物與食品進(jìn)出口技術(shù)措施研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510623)

當(dāng)前,糧食作物種植存在過量施用氮肥的現(xiàn)象[1,2],這降低了氮肥利用率,氮素?fù)p失嚴(yán)重[3],引起一系列的環(huán)境污染問題。三氯甲基吡啶(nitrapyrin),即2-氯-6-三氯甲基吡啶的簡(jiǎn)稱,是一種土壤氮肥保護(hù)劑,和氮肥配合使用于田間,可以有效地抑制硝化細(xì)菌對(duì)氨態(tài)氮的硝化作用[4],能減少氮肥損失,延長(zhǎng)肥效期,提高化肥的利用率[5]。其原理是延長(zhǎng)氮素在土壤中以銨態(tài)氮形態(tài)存在的時(shí)間,由此可以減少氮肥以硝態(tài)氮的形式淋溶損失以及反硝化作用[6],此外,三氯甲基吡啶也是重要的農(nóng)藥醫(yī)藥中間體。近年來國(guó)內(nèi)外對(duì)三氯甲基吡啶的研究主要是關(guān)于其對(duì)土壤的硝化抑制作用及對(duì)谷物的增產(chǎn)效果和制備工藝的研究[7-9],對(duì)測(cè)定其在蔬菜、水果、糧谷等食品中殘留方法的研究資料還相對(duì)較少,常見報(bào)道都為氨氯吡啶酸的測(cè)定[10,11],且采用氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜技術(shù)在玉米及其他糧谷農(nóng)殘方面的應(yīng)用在國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道[12],主要參考?xì)庀嗌V-三重四極桿質(zhì)譜法測(cè)定蔬菜、水果、糧谷等中其他農(nóng)藥殘留方法的標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[13]?，F(xiàn)僅美國(guó)、日本和韓國(guó)規(guī)定了最大殘留限量,分別規(guī)定了糧食作物及其副產(chǎn)品中三氯甲基吡啶的最大殘留限量范圍為0.1～6 mg/kg;歐盟、加拿大均無(wú)相關(guān)限量要求。我國(guó)香港地區(qū)《食物內(nèi)除害劑殘余規(guī)例》[14]規(guī)定了三氯甲基吡啶的殘留量,其中,爆谷、高粱及玉米中三氯甲基吡啶及其代謝物6-氯吡啶甲酸之和的建議限量為0.1 mg/kg,小麥的建議限量為0.5 mg/kg。目前,我國(guó)GB 2763-2019尚未制定其最大殘留限量。因此,建立三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的有效檢測(cè)方法,可為糧食作物中的代謝研究提供可行的技術(shù)支撐,為制定國(guó)內(nèi)糧食作物中三氯甲基吡啶的最大殘留限量提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù),對(duì)有效控制氮肥施用量、促進(jìn)農(nóng)業(yè)的健康發(fā)展、保障廣大人民群眾的食用安全具有深遠(yuǎn)的意義。

仇珍等[15]測(cè)定了稻米中三氯甲基吡啶代謝物6-氯吡啶甲酸的殘留量,樣品經(jīng)乙醚提取凈化,導(dǎo)入重氮甲烷甲酯化后定容,使用帶電子捕獲檢測(cè)器的氣相色譜儀進(jìn)行分析。該方法僅檢測(cè)了代謝物的殘留量,并且導(dǎo)入的重氮甲烷受熱、遇火、摩擦、撞擊會(huì)導(dǎo)致爆炸,危險(xiǎn)性高,不適合常規(guī)檢測(cè)。本工作在前人研究的基礎(chǔ)上,參考QuEChERS方法[16],選擇了相對(duì)安全的衍生試劑濃硫酸,對(duì)樣品前處理過程進(jìn)行了優(yōu)化,結(jié)合氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法(GC-MS/MS),建立起高粱、小麥、玉米及爆谷等糧食作物中三氯甲基吡啶殘留量的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)便,前處理成本低,靈敏度高,抗干擾能力強(qiáng),定性定量準(zhǔn)確,彌補(bǔ)了國(guó)內(nèi)糧食作物中三氯甲基吡啶及其代謝產(chǎn)物檢測(cè)方法的空白。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TSQ FortisTM型氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀,配有電子轟擊源(EI+)(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司); 3-18KS離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司); Biotage全自動(dòng)氮吹濃縮儀(LV型,美國(guó)Biotage公司);賽多利斯BSA124S-CW電子分析天平(賽多利斯科學(xué)科學(xué)儀器(北京)有限公司);恒溫振蕩水浴箱(北京五洲東方科技發(fā)展公司); MS3 basic渦旋混合器(德國(guó)IKA公司); Heidolph Multi Reax多位試管渦旋振蕩器、Heidolph往復(fù)式振蕩器、Promax搖床(德國(guó)Heidolph公司)。

三氯甲基吡啶(純度99.4%)、6-氯吡啶甲酸(純度99.0%)及2-吡啶甲酸甲酯(純度98.0%)標(biāo)準(zhǔn)品(德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司);無(wú)水硫酸鎂、氯化鈉(分析純,廣州化學(xué)試劑廠);海砂(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸乙酯、乙腈、甲醇(HPLC級(jí),美國(guó)Fisher公司);去離子水由Millipore公司超純水機(jī)制得;15 mL QuEChERS凈化管,含200 mg MgSO4、50 mgN-丙基乙二胺(PSA)、100 mg石墨化炭黑(100～200目)、100 mg C18,均購(gòu)自博納艾杰爾科技公司。

1.2 樣品前處理

取市售具有代表性的糧食作物高粱、小麥、玉米及爆谷各2 kg,用粉碎機(jī)粉碎后密封,于陰涼處避光保存。

稱取5 g樣品(精確至0.01 g)至50 mL離心管中,加入15 g海砂攪拌均勻,加入5 mL水渦旋振蕩均勻,靜置10 min。加入10 mL乙腈、0.1 mL甲酸,振搖15 min,加3 g氯化鈉,振搖5 min,于4 000 r/min離心5 min。取4 mL上清液至已配好的15 mL凈化管中渦旋振蕩3 min,取2 mL凈化液待用。將凈化液吹至近干,立即加入1 mL甲醇復(fù)溶,在冰水浴中加入200 μL濃硫酸,振勻。于55 ℃水浴搖床中衍生30 min后,于50 ℃氮吹濃縮,用1 mL乙酸乙酯復(fù)溶。將復(fù)溶液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管,加入5 mL飽和氯化鈉溶液,振蕩提取后移取上清液,再向15 mL離心管中分兩次加入共6 mL乙酸乙酯,振蕩并提取上清液。合并上清液于50 mL離心管中,再加入2 mL 2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的硫酸鈉水溶液,洗滌,移取乙酸乙酯層于吹氮管中,氮吹濃縮至近干,用2 mL正己烷復(fù)溶,加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)2-吡啶甲酸甲酯,振勻后經(jīng)0.2 μm濾膜過濾后,供GC-MS/MS測(cè)定。

1.3 色譜條件

色譜柱:THERMOTR-35MS石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);色譜柱溫度:70 ℃保持1.5 min,以20 ℃/min升溫至180 ℃,然后以5 ℃/min升溫至210 ℃,再以25 ℃/min升溫至280 ℃,保持5 min;載氣:氦氣,純度≥99.999%,流速1.2 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250 ℃;進(jìn)樣量:1 μL;進(jìn)樣方式:不分流進(jìn)樣。

1.4 質(zhì)譜條件

電子轟擊源:70 eV;離子源溫度:230 ℃;傳輸線溫度:280 ℃;溶劑延遲:3 min;掃描方式:多選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(multiple reaction monitoring, MRM);待測(cè)物的其他參數(shù)見表1,用Mass Hunter工作站進(jìn)行儀器控制和數(shù)據(jù)處理。

表 1 三氯甲基吡啶及其代謝產(chǎn)物的MRM參數(shù)

* 6-Chloro-2-picolinic acid methyl ester is a derivative of the metabolite of nitrapyrin.

圖 1 凈化條件對(duì)三氯甲基吡啶及其代謝物回收率的影響Fig. 1 Effects of purification conditions on the recoveries of nitrapyrin and its metabolite

圖 2 衍生時(shí)間對(duì)衍生物回收率的影響Fig. 2 Effect of the derivatization time on the recovery of the derivative

2 結(jié)果與分析

2.1 凈化條件的優(yōu)化

由于糧食作物中含有大量的油脂、糖分等干擾物,容易形成基質(zhì)干擾,因此必須對(duì)其進(jìn)行凈化處理,以達(dá)到減少基質(zhì)效應(yīng)的效果。以高粱、小麥、玉米及爆谷為樣品基質(zhì),采用QuEChERS方法,添加PSA、石墨炭黑、C18的凈化粉進(jìn)行凈化。凈化過程中,加標(biāo)0.2 mg/kg,分別對(duì)3種凈化粉的用量進(jìn)行優(yōu)化(見圖1)。最終選用凈化粉的用量為:MgSO4200 mg、C18 100 mg、PSA 50 mg和GCB 100 mg。

2.2 衍生條件的優(yōu)化

分別考察了衍生時(shí)間和衍生物加入量對(duì)三氯甲基吡啶及其代謝產(chǎn)物定量測(cè)定時(shí)的回收率的影響。以玉米基質(zhì)為例,衍生時(shí)間分別選取了10、20、30、60 min。對(duì)6-氯吡啶甲酸進(jìn)行考察,衍生30 min時(shí),回收率達(dá)到最高值,隨后略有下降(見圖2)。測(cè)定結(jié)果顯示,衍生10 min響應(yīng)最低,20 min后略有升高,之后趨于穩(wěn)定。故選擇衍生時(shí)間30 min。

圖 3 硫酸用量對(duì)衍生物響應(yīng)值的影響Fig. 3 Effect of the sulfuric acid amount on the response of the derivative

考察衍生物濃硫酸的添加量,對(duì)比同等濃度的6-氯吡啶甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中添加50、100、200、300 μL濃硫酸后的影響(見圖3)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),加100 μL濃硫酸即可以衍生完全,轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定。轉(zhuǎn)化率為衍生后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)響應(yīng)濃度與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)理論濃度的比值。在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn),在樣品基質(zhì)中添加相同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),若僅加100 μL濃硫酸,會(huì)因雜質(zhì)消耗硫酸,導(dǎo)致衍生轉(zhuǎn)化率下降,而加入200 μL的濃硫酸后結(jié)果相對(duì)穩(wěn)定。因此,最終對(duì)樣品進(jìn)行衍生時(shí),選擇了添加200 μL濃硫酸。

2.3 色譜柱的選擇

分別考察了色譜柱DB-1701、DB-INOVWAX、DB-5MS和TR-35MS對(duì)三氯甲基吡啶及其代謝產(chǎn)物進(jìn)行色譜分離時(shí)的峰形和靈敏度。如圖4所示,DB1701柱和DB-INOVWAX柱僅能分離三氯甲基吡啶,但無(wú)法有效分離代謝物;比較另外兩種色譜柱,TR-35MS柱涂漬層為(35%苯基)-聚硅氧烷固定液,可使三氯甲基吡啶和6-氯-2-吡啶羧酸甲酯的峰形尖銳、無(wú)拖尾,靈敏度更高,同時(shí)色譜柱價(jià)格適中,因此選為實(shí)驗(yàn)所用。

圖 4 采用不同色譜柱分離三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯的色譜圖Fig. 4 Chromatograms of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester separated on different columns

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

利用EI源,在正離子模式下,分別對(duì)三氯甲基吡啶和6-氯-2-吡啶羧酸甲酯進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜分析(Q1掃描),得到母離子峰,對(duì)母離子峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(子離子掃描),得到碎片離子信息,由此確定定量、定性離子對(duì)。

本方法采用Timed選擇離子模式,由于對(duì)離子掃描只在其相應(yīng)保留時(shí)間的一個(gè)狹窄區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,因此,相對(duì)于常規(guī)的選擇離子模式,在整個(gè)相同的掃描過程中,可以使更多對(duì)離子獲得更長(zhǎng)的駐留時(shí)間,從而提高靈敏度,且盡可能減少峰與峰之間的相互干擾。

采用MRM模式采集數(shù)據(jù),通過優(yōu)化碰撞能量,使各離子對(duì)達(dá)到最好響應(yīng),MRM參數(shù)見表2。

三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯(內(nèi)標(biāo))的標(biāo)準(zhǔn)品全掃描質(zhì)譜圖及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)色譜圖見圖5和圖6。

圖 5 三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的全掃描質(zhì)譜圖Fig. 5 Full scan mass spectra of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester standards

圖 6 三氯甲基吡啶、6-氯-2-吡啶羧酸甲酯和2-吡啶甲酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of nitrapyrin, 6-chloro-2-picolinic acid methyl ester, and pyridine-2-carboxylic acid methyl ester standards

2.5 基質(zhì)效應(yīng)

按如下計(jì)算方法對(duì)基質(zhì)效應(yīng)(ME)進(jìn)行評(píng)價(jià):ME=(空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線斜率-1)×100%。當(dāng)ME為負(fù)值時(shí)表示存在基質(zhì)抑制效應(yīng),正值時(shí)表示存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng);絕對(duì)值越大則基質(zhì)效應(yīng)越強(qiáng),如恰好為0,則表示不存在基質(zhì)效應(yīng)[17]。結(jié)果表明,三氯甲基吡啶在各基質(zhì)溶液中受到一定的基質(zhì)增強(qiáng)作用,爆谷和玉米樣品的基質(zhì)效應(yīng)最為明顯,為+13.6%;而其代謝物的衍生物6-氯-2-吡啶羧酸甲酯在各基質(zhì)溶液中受到一定的基質(zhì)抑制作用,尤其是爆谷樣品基質(zhì)抑制效應(yīng)最為明顯,為-57.1%,玉米樣品的基質(zhì)效應(yīng)略低,為-48.2%?？偟膩碚f,小麥和高粱的基質(zhì)效應(yīng)相對(duì)較小。對(duì)于糧谷類基質(zhì)而言,經(jīng)本方法凈化處理后,目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng)均在可接受范圍內(nèi)。采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法測(cè)定實(shí)際樣品,也可在一定程度上對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響進(jìn)行補(bǔ)償。

2.6 線性范圍、線性方程和檢出限

用空白基質(zhì)溶液(不含三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的高粱、小麥、玉米及爆谷樣品)分別配制質(zhì)量濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的系列三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的基質(zhì)匹配溶液,對(duì)其進(jìn)行分析,分別以三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),以三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸定量離子峰面積除以內(nèi)標(biāo)峰面積的值與內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度的乘積為縱坐標(biāo)(Y),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,所得線性方程及相關(guān)系數(shù)(r2)見表3。當(dāng)樣品中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸的質(zhì)量濃度超出0.025～0.4 mg/L這一線性范圍時(shí),適當(dāng)加大樣品的稀釋倍數(shù)。

在本方法測(cè)定條件下,以信噪比(S/N)>3時(shí)基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度乘以方法的稀釋倍數(shù)推算出方法檢出限(LOD)。選擇空白玉米樣品,當(dāng)添加水平為0.05 mg/kg時(shí),S/N>10,表明其定量限(LOQ)可達(dá)到0.05 mg/kg。該定量限滿足我國(guó)香港地區(qū)《食物內(nèi)除害劑殘余規(guī)例》[14]中的最高殘留限量要求。檢出限及定量限結(jié)果見表2。

2.7 回收率和精密度

在不同空白樣品基質(zhì)中添加3個(gè)水平(0.05、0.1、0.2 mg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)添加水平重復(fù)6次,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,三氯甲基吡啶及6-氯吡啶甲酸的回收率為80.4%～98.4%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0%～10.1%(n=6),方法的精密度和準(zhǔn)確度能夠滿足定量分析的要求。

2.8 實(shí)際樣品的檢測(cè)

隨機(jī)購(gòu)買市售的高粱樣品15個(gè)、小麥樣品10個(gè)、玉米12個(gè)及爆谷15個(gè),按照本研究建立的檢測(cè)方法進(jìn)行測(cè)定,52種糧食作物均未檢出三氯甲基吡啶及其代謝產(chǎn)物。

表 2 不同基質(zhì)中三氯甲基吡啶及其代謝物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area of product ion/peak area of internal standard×mass concentration of internal standard;X: mass concentration, g/L. Linear range: 0.025-0.4 mg/L.

表 3 不同基質(zhì)中三氯甲基吡啶及其代謝物的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本研究采用酸性乙腈提取,QuEChERS方法凈化,濃硫酸衍生后提取衍生物,建立了同時(shí)測(cè)定糧食作物中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸殘留的氣相色譜-三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)方法,回收率、精密度和檢出限均滿足糧食作物中三氯甲基吡啶和6-氯吡啶甲酸殘留限量的要求。