陳柔含,古淑青,趙超敏,霍憶慧,鈕 冰,鄧曉軍

(1. 上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品工程系, 上海 200436;2. 上海海關(guān)動植物與食品檢驗檢疫技術(shù)中心, 上海 200135)

乳鐵蛋白是大分子非血紅素鐵結(jié)合糖蛋白,普遍存在于哺乳動物中,分子量為80 kDa,對鐵具有高度親和力,還可以結(jié)合Cu2+、Zn2+和Mn2+等金屬陽離子[1]。牛乳鐵蛋白具有廣譜抗菌性、免疫調(diào)節(jié)性、抗癌性等生物活性[2-5],大量存在于牛初乳中(含量約7 g/L),有“奶黃金”之稱。研究發(fā)現(xiàn),牛乳鐵蛋白和人乳鐵蛋白在蛋白結(jié)構(gòu)和氨基酸序列上具有高度相似性,易被嬰幼兒吸收,越來越多的嬰幼兒配方奶粉添加了牛乳鐵蛋白以取代人乳鐵蛋白,以改善免疫力[6]。

2012年《食品安全國家標準食品營養(yǎng)強化劑使用標準》將其列為食品營養(yǎng)強化劑,并明確規(guī)定乳制品及嬰幼兒配方食品中最高使用量均不得超過1.0 g/kg[7],但目前乳制品中乳鐵蛋白的檢測還缺乏標準方法。根據(jù)現(xiàn)有文獻報道,乳鐵蛋白檢測方法主要有酶聯(lián)免疫技術(shù)(ELISA)[8]、聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)[9]、電化學(xué)技術(shù)[10]、液相色譜法[11-15]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[16-18]等。ELISA盡管操作簡單,但靈敏度低,存在交叉反應(yīng);SDS-PAGE是蛋白分析常用的電泳法,耗時長,重現(xiàn)性較差;電化學(xué)技術(shù)簡便、快速、靈敏,但易受外界環(huán)境因素影響;液相色譜法采用肝素親和柱純化蛋白后進行液相檢測,結(jié)果準確,但價格昂貴,可重復(fù)利用次數(shù)少。乳制品尤其是奶粉作為復(fù)雜基質(zhì),采用LC-MS/MS分析具有很大的分析優(yōu)勢,既包含了液相色譜的分離,又能通過質(zhì)譜精確確證,在乳鐵蛋白檢測中得到了廣泛應(yīng)用。Zhang等[16]篩選出2個特征肽段,選用合成LRPVAAEIYGTK作標準曲線,同位素標記定量法定量,但該方法定量限較高(10 mg/kg)。Yuan等[17]基于特征肽ETTVFENLPEK定量牛乳鐵蛋白,經(jīng)初級局部序列搜索工具(basic local alignment search tool, BLAST, http://www.uniprot.org/blast/)表明該肽段非牛乳鐵蛋白特征肽段,其還存在于羊奶中。Chen等[18]結(jié)合超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-Q-TOF-MS)和毛細管電泳電噴霧離子化-四極桿-飛行時間質(zhì)譜兩種方法檢測牛乳鐵蛋白肽段,有效展現(xiàn)了乳鐵蛋白序列,對特征肽段的搜尋提供一定幫助,但未進行乳鐵蛋白的定量研究。

本文采用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q/Exactive-HRMS)篩選出牛乳鐵蛋白的8個特征肽段,并選擇其中3個特征肽段通過超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜(UPLC-QqQ-MS),建立乳和乳制品中牛乳鐵蛋白的多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)定量方法,同時考察了空白基質(zhì)匹配的非標記定量法和標記定量法對乳鐵蛋白檢測結(jié)果的差異。該方法抗干擾能力強,靈敏度高,重復(fù)性好,適用于液態(tài)乳、嬰幼兒配方奶粉等乳及乳制品中牛乳鐵蛋白的含量測定。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

超高效液相色譜(Dionex UltiMate 3000)-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀(Q-Exactive)(Thermo Fisher,美國);液相色譜(NEXERA X2, LC-30AD)、三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(MS8060)(Shimadzu,日本);高效液相色譜儀(Agilent 1290, Agilent,美國);離心機(Allegra X-22R, Beckman Coulter,美國);高速振蕩機(CM1000, Eyela,日本);水浴鍋(SW22, Julabo,德國)。所有實驗用水由Milli-Q超純水系統(tǒng)(Millipore,美國)制得。

碳酸氫銨(純度≥99%)、二硫蘇糖醇(DTT,純度≥99%)、碘代乙酰胺(IAA,純度≥99%)、氯化鈣(CaCl2,純度≥99%)(Sigma,美國);牛胰蛋白酶(測序級,Promega,美國);甲酸(純度≥98%)(Fluka,美國)。牛乳鐵蛋白(純度≥95%)(Fujifilm Wako,日本),取0.002 g溶于10 mL水中,配制成200 μg/mL標準儲備液;內(nèi)標肽段SF(13C9、15N)QLFGSPPGQR(上海吉爾生化有限公司)用水配制成質(zhì)量濃度為50 μg/mL的內(nèi)標標準工作液。奶粉、液態(tài)奶、酸奶均為市售。

低蛋白吸附槍頭(0.1 mL/1 mL, Brand,德國);低蛋白吸附離心管(1.5 mL, Eppendorf,德國);低蛋白吸附進樣瓶、低蛋白吸附襯管(CNW,德國);低蛋白吸附濾膜(0.22 μm, Agela,美國)。

1.2 實驗條件

1.2.1樣品前處理

脫脂:稱取1 g(精確至0.01 g)奶粉樣品,置于50 mL離心管中,用水定容至50 mL,渦旋搖勻,于-20 ℃冰箱冷凍10 min后,以10 000 r/min高速離心5 min,除去上層脂質(zhì),即得到脫脂奶。

表 1 牛乳鐵蛋白特征肽段及MRM參數(shù)

CE: collision energy; * quantitative ion.

酶解:吸取200 μL脫脂奶,置于1.5 mL低蛋白吸附離心管中,加入150 μL 500 mmol/L的碳酸氫銨溶液,混勻,然后加入10 μL 500 mmol/L的DTT溶液,混勻,于75 ℃恒溫水浴0.5 h;冷卻至室溫,加入30 μL 500 mmol/L的IAA溶液,暗處靜置0.5 h,加入10 μL 100 mmol/L的氯化鈣溶液和20 μL 100 μg/mL的牛胰蛋白酶溶液,混勻后置于37 ℃恒溫水浴酶解過夜(≥16 h),最后加入10 μL甲酸終止反應(yīng),靜置15 min,用水定容至1 mL,過0.22 μm低蛋白吸附濾膜,待檢測。

1.2.2UPLC-Q/Exactive-HRMS條件

采用Aeris PEPTIDE XB-C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Phenomenex,美國);柱溫:35 ℃;流動相A為0.1%(v/v)甲酸水溶液,流動相B為0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液;流速:0.2 mL/min。洗脫梯度程序:0～4 min, 97%A; 4～29 min, 97%A～40%A; 29～30 min, 40%A～10%A, 30～34 min, 10%A; 34～35 min, 10%A～97%A; 35～40 min, 97%A。進樣體積:5 μL。

離子源:電噴霧電離(ESI)源,正離子模式;保護氣壓力:206.85 kPa;輔助氣壓力:68.95 kPa;噴嘴電壓:3.5 kPa;毛細管溫度:320 ℃;輔助氣溫度:250 ℃;全掃描模式;掃描范圍:m/z100～1 500;分辨率:35 000。篩選得到牛乳鐵蛋白的8個特征肽段,其質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.2.3UPLC-QqQ-MS條件

色譜柱和流動性條件如1.2.2節(jié)所述。柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 95%A; 2.0～14.0 min, 95%A～55%A; 14.0～17.0 min, 55%A; 17.0～17.1 min, 55%A～95%A; 17.1～20.0 min, 95%A。進樣體積:10 μL。

離子源:ESI源,正離子模式;離子源接口溫度:350 ℃;接口電壓:2.0 kV;加熱氣:空氣,12 L/min;霧化氣:氮氣,3 L/min;干燥氣:氮氣,8 L/min;碰撞氣:氬氣;脫溶劑管(desolvation line, DL)溫度:200 ℃;加熱模塊溫度:400 ℃;制冷氣溫度:15 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 特征肽段選擇

基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,特征肽段的選擇是關(guān)鍵的一步,關(guān)系到蛋白質(zhì)的定性和定量檢測[19]。隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展,牛乳鐵蛋白的氨基酸序列已被廣泛研究。利用Skyline軟件對牛乳鐵蛋白的氨基酸序列進行模擬酶切,得到一系列理論酶切肽段,上述肽段經(jīng)BLAST搜索得到理論特征肽段。將酶解后的樣品在UPLC-Q/Exactive-HRMS平臺的數(shù)據(jù)依賴型全掃(Full MS/data-dependent MS2)模式下全掃描,通過Protein Pilot軟件(Version 5.0, AB SCIEX)對特征肽段進行鑒定和篩選,排除含有錯切或漏切位點,以及含有甲硫氨酸、NXS/T的糖基化基序和易成環(huán)易氧化的肽段序列,優(yōu)先選擇沒有任何修飾的肽段以確保特征肽段的穩(wěn)定性,再結(jié)合質(zhì)譜檢測靈敏度高等選擇原則[20,21],共篩選出牛乳鐵蛋白的8條特征肽段。

將采集的數(shù)據(jù)和特征肽段理論碎片的匹配度進行驗證。多肽在二級質(zhì)譜中,母離子與惰性氣體碰撞,使得肽鏈中的肽鍵斷裂形成一系列子離子,主要為N端碎片離子(b離子)和C端碎片離子(y離子),碰撞后得到的碎片離子峰和理論碎片峰匹配度高,則表明該肽段的可信度高,更適合于后續(xù)的MRM定量分析。經(jīng)Protein Pilot軟件分析鑒定出8個特征肽段具有較好匹配度,以3個響應(yīng)最高的肽段ESPQTHYYAVAVVK(ESP)、SFQLFGSPPGQ(SFQ)、LRPVAAEIYGTK(LRP)為例(見圖1),結(jié)果顯示,理論y離子(紅線)和b離子(綠線)的碎片峰與實驗獲得碎片峰(藍線)重合,肽段ESP的28個理論y、b離子碎片中有20個碎片峰得到鑒定,肽段SFQ的22個理論y、b離子碎片中有15個碎片峰得到鑒定,肽段LRP的24個理論y、b離子碎片中有18個碎片峰得到鑒定,表明實驗結(jié)果與理論碎裂模式高度匹配。

由于實際樣品在加工中,常常經(jīng)歷加熱、蒸煮或烘烤等過程,易使蛋白質(zhì)發(fā)生多種副反應(yīng),影響定性定量結(jié)果。為考察特征肽段在實際樣品檢測中的適用性,將8個特征肽段導(dǎo)入Skyline軟件,采用MRM技術(shù)對多種不同的實際樣品進行檢測驗證,結(jié)果表明,這8個特征肽段均具有良好穩(wěn)定性和重復(fù)性。8個特征肽段氨基酸序列及在乳鐵蛋白中所處的位置、保留時間和碎片離子參數(shù)如表1所示,提取離子流色譜圖見圖2。選取3個響應(yīng)值較高的肽段ESP、SFQ、LRP,每個肽段選擇3個干擾最少、響應(yīng)最高的子離子進行后續(xù)的定量分析。

圖 2 牛乳鐵蛋白特征肽段的提取離子色譜圖Fig. 2 Extracted ion chromatograms of marker peptides of bovine lactoferrin

2.2 質(zhì)譜條件選擇

采用MRM技術(shù)定量檢測目標肽段具有較高的準確性和穩(wěn)定性,但改變質(zhì)譜條件對目標物質(zhì)的響應(yīng)強度有較大影響,因此需要對質(zhì)譜條件進行優(yōu)化,以提高檢測靈敏度和穩(wěn)定性。針對3個特征肽段進行優(yōu)化,主要考察了氣流量、DL溫度、離子源接口溫度、接口電壓、碰撞能量對響應(yīng)強度的影響。

利用島津LC-MS/MS自帶的Interface軟件,考察了霧化氣、加熱氣、干燥氣、DL溫度及離子源接口溫度對離子響應(yīng)強度的影響。以SFQLFGSPPGQR為例,將霧化氣(2.5、3.0)、加熱氣(8.0、10.0、12.0)和干燥氣(8.0、10.0、12.0)的氣流量采用交叉組合的優(yōu)化方式,生成的12組條件見圖3a。結(jié)果表明,當霧化氣、加熱氣和干燥氣流量分別為3.0、12.0和8.0 L/min時,各子離子響應(yīng)強度最高。DL溫度(200 ℃和250 ℃)和離子源接口溫度(250、300和350 ℃)兩兩組合生成6組條件(見圖3b),當DL溫度和離子源接口溫度分為200 ℃和350 ℃時,對應(yīng)子離子響應(yīng)強度最高。

圖 3 牛乳鐵蛋白特征肽段SFQLFGSPPGQR的質(zhì)譜條件優(yōu)化結(jié)果Fig. 3 Optimization results of mass spectrometry conditions of the SFQLFGSPPGQR peptide of bovine lactoferrin a. nebulizing, heating, and drying gas flow rates; b. desolvation line (DL) and interface temperatures; c. interface voltage; d. collision energy.

ESI源接口電壓大小同樣影響肽段的電離和帶電情況,從而導(dǎo)致檢測信號強弱和有無,分別考察了接口電壓為0.5、1.0、2.0、3.0和4.0 kV時離子的響應(yīng)強度,結(jié)果表明當接口電壓為2.0 kV時,響應(yīng)最高(見圖3c)。

子離子是由母離子在碰撞室經(jīng)氬氣碰撞后產(chǎn)生的碎片,每個子離子都有一個最優(yōu)的碰撞能,利用Skyline軟件生成優(yōu)化碰撞能方法,以SFQ為例,對離子通路m/z660.838 4>554.304 5分別施加如圖3d所示的11個不同碰撞能,結(jié)果表明,碰撞能22.9 eV下可獲得最大峰面積。其他特征肽段的MRM參數(shù)及優(yōu)化后的碰撞能見表1。

2.3 樣品前處理條件的選擇

前處理包括提取乳鐵蛋白及酶解,擬定兩個步驟(脫脂和除酪蛋白)處理奶粉樣品。乳制品中含有大量脂肪,油脂包裹住蛋白質(zhì)影響酶與蛋白質(zhì)接觸,影響酶解和質(zhì)譜分析,除脂是必要步驟。酪蛋白在乳制品中約占78%[11],而牛乳鐵蛋白占比較低,推測其對檢測有一定干擾。

本研究對比冷凍離心和采用正己烷、氯仿-三氟乙酸(4∶1, v/v)時肽段的響應(yīng)值(見圖4)。結(jié)果表明,脫脂后響應(yīng)增強,采用冷凍離心方法除去上層脂質(zhì),酶解得到肽段響應(yīng)值最高,損失最少,故采用該方法。冷凍離心方式無需有機試劑,環(huán)境友好;正己烷會和乳制品產(chǎn)生乳化現(xiàn)象難以分離;氯仿-三氟乙酸(4∶1, v/v)處理乳制品,可能由于復(fù)溶過程未完全溶解造成損失。

圖 4 不同脫脂方法對3種肽段響應(yīng)強度的影響(n=3)Fig. 4 Effect of different degreasing methods on the intensities of the three peptides (n=3)

酪蛋白的等電點為4.6,本研究分別考察鹽酸、醋酸調(diào)節(jié)pH值,沉降離心后對澄清液酶解上機。結(jié)果表明,調(diào)節(jié)pH值會降低肽段的響應(yīng)強度?？赡苁且驗檎{(diào)節(jié)pH值會使牛乳鐵蛋白內(nèi)部疏水性氨基酸逐漸暴露聚集,降低了乳鐵蛋白從乳清中的回收率[22],且質(zhì)譜檢測不受牛奶中大量酪蛋白負面影響。

圖 5 人、牛、羊乳鐵蛋白氨基酸序列圖Fig. 5 Amino acid sequence of lactoferrin from human, bovine and goat sp|P02788|TRFL_HUMAN, sp|P24627|TRFL_BOVIN and sp|Q29477|TRFL_CAPHI represented human lactoferrin, bovine lactoferrin, and goat lactoferrin, respectively. The green, red and black represented the same, the similar, and the different amino acid sequence, respectively.

2.4 空白基質(zhì)的選擇

乳制品是復(fù)雜的食品基質(zhì),采用外標法定量法時,需考慮空白基質(zhì)匹配以消除基質(zhì)效應(yīng)。牛、人和羊乳鐵蛋白具有同源性,比對三者氨基酸序列(見圖5),牛乳鐵蛋白和人乳鐵蛋白序列同源性為70%,牛和羊乳鐵蛋白序列同源性高達92%。綠字表示完全相同的氨基酸;紅字表示為同一類氨基酸,結(jié)構(gòu)和功能相似;黑字表示完全不同的氨基酸,3個特征肽段(紅色背景標注)僅存在于牛鐵蛋白,不存在人和羊乳鐵蛋白中?？紤]特異性和基質(zhì)匹配效應(yīng)[23],通過質(zhì)譜確證表明羊奶粉中不含有特征肽段,其次羊奶粉成分配比和牛奶粉相近,可作為空白基質(zhì)。

2.5 方法學(xué)驗證

蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法根據(jù)是否對蛋白質(zhì)進行標記可分為外標法(external standard method, ESM)和內(nèi)標法(internal standard method, ISM)兩類[24]。外標定量法不需要使用昂貴的穩(wěn)定同位素標簽,采用離子峰面積和離子濃度的相關(guān)性進行定量,成本低;內(nèi)標定量法即引入穩(wěn)定同位素標記(如13C、2H、18O、15N)的內(nèi)標物質(zhì),使其具有相同色譜行為和離子化效率,提高精確性,然而制備同位素內(nèi)標提高了成本[23]。本工作考察了外標法和內(nèi)標法的線性關(guān)系、檢出限、定量限、回收率、精密度等性能,并利用實際樣品對兩種檢測方法的結(jié)果進行了對比。

2.5.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

建立2種標準曲線進行定量比較。

(1)外標法:吸取適量體積的乳鐵蛋白儲備液,以羊奶粉為空白基質(zhì),用水逐級稀釋成系列濃度的標準工作溶液,酶解后用于質(zhì)譜檢測,以質(zhì)量濃度為橫坐標,特征肽段峰面積為縱坐標建立標準曲線。

(2)內(nèi)標法:選擇特征肽段SFQLFGSPPGQR考察內(nèi)標法,設(shè)計內(nèi)標肽段為SF(13C9、15N)QLFGSPPGQR。為降低質(zhì)譜離子化效率及酶解效率的差異對檢測結(jié)果的影響,在內(nèi)標肽段兩端分別加上與特征肽段相同的6個氨基酸GKNKSRSF(13C9、15N)QLFGSPPGQRDLLFKD作為內(nèi)標物[16,25]。吸取適量體積的乳鐵蛋白儲備液,用水逐級稀釋成系列濃度的標準工作溶液,每個濃度溶液中加入50 μL同位素內(nèi)標,以質(zhì)量濃度為橫坐標,特征肽段和內(nèi)標肽段峰面積比為縱坐標建立標準曲線。

兩種方法的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10)見表2。結(jié)果表明,采用外標法時3個肽段在各自范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,R2均大于0.99, 3個肽段的檢出限為0.023～0.041 mg/kg,定量限為0.077～0.137 mg/kg。內(nèi)標法結(jié)果與外標法基本相當。該結(jié)果優(yōu)于大部分文獻[16,17],能夠滿足牛乳鐵蛋白在各類乳制品中的定量要求。

表 2 采用外標法和內(nèi)標法時特征肽段的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L;Y′: peak area ratio of maker peptide to internal standard peptide.

2.5.2回收率和精密度

根據(jù)定量限及實際樣品中牛乳鐵蛋白的含量范圍,選擇0.1、1.0和10 mg/kg 3個水平的乳鐵蛋白加入羊奶粉中,按照樣品前處理步驟進行酶解后檢測,考察方法的回收率。取空白基質(zhì),每個水平單獨加標3次,按照1.2節(jié)方法酶解后,每個樣品平行檢測3次,考察日內(nèi)精密度;連續(xù)3 d中,樣品每個水平加標一次,酶解后,每個樣品平行檢測3次,考察日間精密度。如表3所示,外標法平均回收率為93.8%～103.9%,日內(nèi)精密度≤8.8%,日間精密度≤9.5%;內(nèi)標法平均回收率為98.5%～102.7%,日內(nèi)精密度≤7.7%,日間精密度≤10.9%。

表 3 特征肽段的加標回收率、日內(nèi)精密度和日間精密度

表 4 不同定量方法檢測市售奶粉樣品中牛乳鐵蛋白的含量(n=3)

Detected contents: mean±SD.

2.6 實際樣品檢測

在實際樣品檢測時,首先考察了不同特征肽段對定量結(jié)果的影響,以及外標法與內(nèi)標法之間的差異。分別采用外標法和內(nèi)標法對3個市售奶粉樣品進行定量檢測,結(jié)果見表4。通過單因素方差分析比較外標法中3個特征肽段檢測結(jié)果的差異性及外標法與內(nèi)標法之間檢測結(jié)果的差異性,得到P值分別為0.901 9和0.973 7,均>0.05,表明不同肽段之間及外標法與內(nèi)標法之間均無顯著性差異。為了降低檢測成本,在后續(xù)的樣品檢測中采用SFQ外標法定量。

為驗證所建方法的實用性,選取24份市售乳制品,包括嬰幼兒配方奶粉、酸奶、巴氏乳、超高溫瞬時滅菌乳(UHT),按照1.2節(jié)前處理步驟進行酶解,采用特征肽段SFQ進行定量,結(jié)果見表5。結(jié)果表明,奶粉中乳鐵蛋白含量為223.13～4 299.07 mg/kg,部分嬰幼兒配方奶粉會添加額外乳鐵蛋白以增強免疫力;酸奶中含量為7.14～53.70 mg/kg,酸奶復(fù)雜的加工步驟會損失部分牛乳鐵蛋白,可在發(fā)酵后添加乳鐵蛋白以避免熱變性和活性喪失,同時提高酸奶的營養(yǎng)價值[26];巴氏奶和UHT奶分別采用低溫殺菌和超高溫瞬時殺菌方法處理生牛乳,生牛乳中乳鐵蛋白含量約為20～200 mg/kg,熱處理和高壓對牛乳鐵蛋白造成一定損失[27],檢測結(jié)果為59.45～116.16 mg/kg。

表 5 不同乳制品中牛乳鐵蛋白的含量(n=3)

UHT: ultra high temperature instantaneous sterilization.

3 結(jié)論

本方法采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測乳及乳制品中的牛乳鐵蛋白,共篩選出牛乳鐵蛋白的8個特征肽段,選擇其中3個特征肽段進行了定量分析,通過對比空白基質(zhì)匹配的外標法和內(nèi)標法對乳鐵蛋白檢測結(jié)果的差異,表明所建立的空白基質(zhì)匹配定量方法與內(nèi)標法無顯著性差異,方法靈敏度高,重復(fù)性好,能夠滿足乳與乳制品中乳鐵蛋白的定量檢測需求。