王 佳,凌 云,鄧亞美,張雨佳,楊旭升,劉利俠,劉曉敏,李東輝,張 峰*

(1. 錦州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 錦州 121001; 2. 中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院食品安全研究所, 北京 100176)

降血脂藥是一類能降低血漿甘油三酯或膽固醇的藥物,其種類較多,主要有膽酸螯合劑、煙酸類、貝特類以及他汀類,其中貝特類和他汀類應(yīng)用最多。他汀類主要是通過選擇性抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(HMG-CoA)和降低甘油三酯(TG)水平以起到降低血脂的作用[1],但動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)表明,降血脂藥可以長時(shí)間存在于人體血漿中[2,3],且化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定[4],因此長期過量使用可能導(dǎo)致藥物在人體內(nèi)富集。降血脂藥在降脂的同時(shí),使用不當(dāng)也可能會(huì)影響肝腎功能[5],可能引發(fā)橫紋肌溶解癥[6,7]等,甚至?xí)心I衰竭的風(fēng)險(xiǎn)[8]。

近年來,淡水短缺,再生水被認(rèn)為是應(yīng)對(duì)全球水資源短缺問題的一個(gè)較好的解決方案[9]。污水經(jīng)過處理后形成的二次水可直接排入河流,也可作為農(nóng)業(yè)灌溉的可行資源。據(jù)文獻(xiàn)[10]報(bào)道,許多藥物如降血脂藥及其活性代謝物已被公認(rèn)為新出現(xiàn)的環(huán)境污染物存在于廢水中。因此,城市污水已被確定為將這些藥物帶入人們生活的主要物質(zhì)之一。污水處理廠下游及沿線河流中的魚類便成了藥物進(jìn)入生態(tài)系統(tǒng)的敏感體[11]。因此建立降血脂藥的檢測(cè)技術(shù)及分析方法尤為重要。

目前,國內(nèi)有關(guān)食品中降血脂藥的檢測(cè)報(bào)道較少,主要為氣相色譜-質(zhì)譜法[12-17]、高效液相色譜法[18]、液相色譜-質(zhì)譜法[19-25]。氣相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)時(shí)前處理需要衍生化,步驟繁瑣;高效液相色譜法能同時(shí)檢測(cè)和分析的樣品種類較少,化合物種類比較單一。本研究采用QuEChERS前處理技術(shù),建立了超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜(UHPLC-Q/Orbitrap-MS)檢測(cè)魚肉中的15種降血脂藥的方法,并檢測(cè)了市售的各種魚肉類。所建方法前處理步驟簡單,重復(fù)性好,有助于魚肉樣品中降血脂藥的篩查。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Q-Exactive-Ultimate 3000 RSLC超高效液相色譜-質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher公司); Milli-R04超純水發(fā)生器(德國Millipore公司); Allegra X-22R冷凍離心機(jī)(美國Beckman Coulter公司); KQ-500DE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器公司); HSC-12B針式氮吹儀(天津恒奧科技有限公司)。

15種降血脂藥標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr. Ehrenstorfer公司和美國Sigma公司),純度最高為99%。甲醇、乙腈、甲酸(色譜純,美國Thermo Fisher公司);乙酸銨、氯化鈉、硫酸鎂、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18(分析純,美國Sigma公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取15種標(biāo)準(zhǔn)品(10.0±0.1) mg,分別置于10 mL容量瓶中,加入10 mL甲醇,配制成質(zhì)量濃度為1 g/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,于-20 ℃冰箱中儲(chǔ)存待用。

分別移取15種降血脂藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL,置于10 mL容量瓶中,用甲醇稀釋并定容,混勻,配制得10 mg/L的降血脂藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,于4 ℃冰箱保存待用;用甲醇稀釋,配制0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10、20、50、100和200 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于4 ℃儲(chǔ)存待用。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取液體魚肉5 g,置于50 mL離心管中,加入10 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液,渦旋1 min,分別加入2 g氯化鈉和400 mg無水硫酸鎂用于沉淀蛋白質(zhì)和鹽析,渦旋1 min,混勻,于-4 ℃以10 000 r/min離心10 min,提取上清液至第二個(gè)50 mL離心管中,加入100 mg PSA、160 mg C18和1.0 g乙酸鈉,渦旋1 min,吸取上清液,置于10 mL試管中,于40 ℃水浴鍋中氮吹至干,用1 mL甲醇溶解殘留物,用0.22 μm尼龍濾膜過濾后,上機(jī)檢測(cè)。

表 1 15種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜參數(shù)

tR: retention time; * quantitative ion.

1.4 色譜條件

色譜柱:XBridge-C18液相色譜柱(100 mm×2.1 mm, 3.5 μm,美國Waters公司);柱溫:35 ℃;流動(dòng)相:A為乙腈,B為0.1%(v/v)甲酸水溶液(含1.5 mmol/L乙酸銨);流速:0.2 mL/min。梯度洗脫程序:0～1 min, 30%A; 1～10 min, 30%A～65%A; 10～20 min, 65%A～98%A; 20～21 min, 98%A～30%A; 21～25 min, 30%A。進(jìn)樣體積:5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源:加熱電噴霧電離(HESI)源,負(fù)離子與正離子模式同時(shí)監(jiān)測(cè);噴霧電壓:3.6 kV;毛細(xì)管溫度:350 ℃;鞘氣流速:40 Arb;輔助氣流速:10 Arb;全掃描(full-ms)分辨率:70 000;二級(jí)質(zhì)譜掃描(dd-ms2)分辨率:35 000。15種降血脂藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為使目標(biāo)分析物達(dá)到最佳分離的效果,本實(shí)驗(yàn)考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液,以及乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(含0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10和20 mmol/L的乙酸銨)作為流動(dòng)相時(shí)的分離情況。當(dāng)采用甲醇-水和乙腈-水體系時(shí),乙腈-水體系對(duì)降血脂藥的色譜分離效果優(yōu)于甲醇-水體系,且響應(yīng)更高。在乙腈-水體系中添加0.1%(v/v)甲酸(含1.5 mmol/L乙酸銨)時(shí),色譜峰形最佳,因此選為所用。15種降血脂藥(100 μg/L)的色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別以甲醇、乙腈、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液、0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液(含1.5 mmol/L乙酸銨)為提取溶劑,采用基質(zhì)匹配法比較各提取劑對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響,考察不同提取溶劑的提取效果(見圖2)。結(jié)果表明,采用0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液提取時(shí),15種降血脂藥的回收率最佳,且可有效縮短前處理的時(shí)間。因此選擇0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液作為提取溶劑。

圖 1 15種降血脂藥(100 μg/L)的色譜圖Fig. 1 Chromatograms of the 15 lipid regulators (100 μg/L)

2.2.2提取溶劑體積的優(yōu)化

提取溶劑的體積是影響化合物提取效率的一個(gè)重要因素。本實(shí)驗(yàn)考察了采用5、10、15和20 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液提取時(shí)15種目標(biāo)化合物的提取效率(見圖3)。結(jié)果顯示,采用10 mL和15 mL 0.1%(v/v)甲酸乙腈溶液提取時(shí)提取效率相當(dāng),為了節(jié)省溶劑,最終選擇10 mL。

圖 2 不同提取溶劑對(duì)魚肉中15種降血脂藥回收率的影響(n=3)Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the recoveries of the 15 lipid regulators in fish meat (n=3)

圖 3 提取溶劑體積對(duì)魚肉中15種降血脂藥回收率的影響(n=3)Fig. 3 Effect of volumes of extraction solvent on the recoveries of the 15 lipid regulators in fish meat (n=3)

2.2.3QuEChERS凈化條件的優(yōu)化

魚肉樣品中存在脂肪、蛋白質(zhì)、色素等雜質(zhì),QuEChERS吸附劑能否有效去除雜質(zhì)且不對(duì)目標(biāo)物有吸附作用。QuEChERS吸附劑有MgSO4、PSA、C18、石墨化炭黑(GCB)、乙酸鈉等。本文就魚肉多脂肪、多蛋白質(zhì)、多色素的性質(zhì)選擇了PSA、C18、乙酸鈉3種吸附劑,并著重對(duì)吸附劑的用量進(jìn)行了優(yōu)化。本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法考察了不同吸附劑用量對(duì)魚肉樣品的凈化效果,根據(jù)響應(yīng)曲面法(RSM)的原理,使用Design-Expert軟件中的中心復(fù)合設(shè)計(jì)(CCD)設(shè)計(jì)了具有3個(gè)因素和5個(gè)水平的20組實(shí)驗(yàn),以考察3種吸附劑對(duì)目標(biāo)物回收率的影響。3個(gè)因素分別為PSA、C18、乙酸鈉,5個(gè)水平分別為20、60、100、140和180 mg (PSA)，40、100、160、220和280 mg (C18)，0.2、0.6、1.0、1.4和1.8 g(乙酸鈉)。由圖4可知,當(dāng)PSA、C18和乙酸鈉的用量分別為100 mg、160 mg和1.0 g時(shí),目標(biāo)化合物回收率相對(duì)較高,因此選為所用。

圖 4 C18、PSA和乙酸鈉的用量對(duì)回收率的影響Fig. 4 Effect of varying amount of C18, primary secondary amine (PSA) and sodium acetate on the recoveries

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

應(yīng)用液相色譜-質(zhì)譜法檢測(cè)復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí),基質(zhì)共提物會(huì)對(duì)目標(biāo)物的離子化具有基質(zhì)增強(qiáng)或基質(zhì)抑制效應(yīng),從而影響對(duì)目標(biāo)物的定量測(cè)定。根據(jù)公式基質(zhì)效應(yīng)(ME)=(1-Ss/Sm)×100%計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)值,其中,Ss和Sm分別是基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線和純?nèi)軇┬?zhǔn)曲線的斜率[26]。當(dāng)ME=-20%～20%時(shí)為弱基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)ME=-50%～-20%或20%～50%時(shí)為中等基質(zhì)效應(yīng);當(dāng)ME<-50%或>50%時(shí)為強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)考察了5種魚肉基質(zhì)中目標(biāo)化合物的基質(zhì)效應(yīng),結(jié)果表明,15種降血脂藥具有弱基質(zhì)效應(yīng)或中等基質(zhì)效應(yīng),因此采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線法用于降血脂藥的定量分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

按1.2節(jié)配制15種降血脂藥的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,分別添加到5 g空白魚肉中,按1.3節(jié)和1.4節(jié)方法處理并檢測(cè),以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表2)。結(jié)果表明,15種降血脂藥在各自范圍內(nèi)線性良好,相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99。

在空白樣品中分別添加系列濃度的目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,以3倍和10倍信噪比確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,15種降血脂藥的檢出限為0.2～1.0 μg/kg,定量限為0.3～3.1 μg/kg(見表2)。

2.4.2回收率與精密度

取18份空白魚肉樣品,分成3組,分別添加LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ 3個(gè)水平的15種目標(biāo)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,每份樣品測(cè)定一次,間隔3 d后再一次測(cè)定。結(jié)果表明,15種目標(biāo)化合物的平均回收率為76.4%～116.0%,日內(nèi)精密度為1.0%～7.9%,日間精密度為1.7%～18.4%(見表3),準(zhǔn)確度和精密度滿足殘留檢測(cè)要求。表明該方法可靠準(zhǔn)確,適合15種降血脂藥的檢測(cè)分析。

表 2 15種降血脂藥的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

表 3 15種降血脂藥的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

利用上述方法對(duì)從北京某市場(chǎng)購買的20份魚肉樣品進(jìn)行測(cè)定。在2個(gè)樣品中觀察到痕量的非諾貝特和環(huán)丙貝特,其含量

圖 5 標(biāo)準(zhǔn)溶液和實(shí)際樣品中非諾貝特和環(huán)丙貝特的色譜圖和質(zhì)譜圖Fig. 5 Chromatograms and mass spectra of the fenofibrate and ciprofibrate in the standard solutions and real samples a. fenofibrate in the standard solution; b. fenofibrate in the real sample; c. ciprofibrate in the standard solution; d. ciprofibrate in the real sample.

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS-超高效液相色譜-四極桿/靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜法,實(shí)現(xiàn)了魚肉中15種降血脂藥的定性和定量分析。該法操作簡單,重復(fù)性好,分辨率高,能同時(shí)對(duì)魚肉中15種降血脂藥殘留進(jìn)行篩查定量。