糖基化酪蛋白消化物對(duì)正常小鼠免疫調(diào)節(jié)作用的影響

時(shí) 佳，趙新淮*

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

蛋白質(zhì)糖基化是將親水的碳水化合物（單糖、寡糖）共價(jià)連接到蛋白質(zhì)分子上，從而改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、構(gòu)象、凈電荷、疏水性等性質(zhì)，最終實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的改變，如溶解性、表面性質(zhì)、吸水性、膠凝性以及熱穩(wěn)定性等。美拉德反應(yīng)是實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化的最常用途徑之一[1-2]。例如，燕麥分離蛋白和蘑菇β-葡聚糖發(fā)生美拉德糖基化反應(yīng)，修飾后的燕麥分離蛋白的溶解性、乳化活性和熱穩(wěn)定性都得到改善[3]。大米蛋白和葡聚糖發(fā)生美拉德糖基化反應(yīng)后，其溶解性、乳化活性、乳化穩(wěn)定性、起泡能力和泡沫穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)[4]。利用美拉德反應(yīng)和柑橘果膠發(fā)生糖基化反應(yīng)，所得乳清分離蛋白-果膠復(fù)合物的乳化活性得到改善[5]。另外，蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)對(duì)蛋白質(zhì)的某些生物活性也有影響。例如，葡萄糖糖基化的豌豆7S球蛋白有更低的抗體親和性，對(duì)Caco-2單層細(xì)胞的毒性和轉(zhuǎn)運(yùn)能力也降低[6]；乳糖糖基化的酪蛋白具有較低的體外免疫活性[7]，但晚期糖基化末端產(chǎn)物對(duì)人體免疫細(xì)胞具有直接的毒性作用[8]。因此，蛋白質(zhì)的美拉德糖基化反應(yīng)的其他不良影響，如對(duì)動(dòng)物免疫狀況的影響，需要進(jìn)一步研究。

免疫系統(tǒng)是動(dòng)物機(jī)體的重要防御系統(tǒng)，可特異性或非特異性排除侵入機(jī)體的異物。動(dòng)物的免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞與免疫分子組成。蛋白質(zhì)是動(dòng)物免疫系統(tǒng)和免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)水平低或氨基酸組成不合理都會(huì)影響動(dòng)物的免疫狀況。蛋白質(zhì)可以有效提高機(jī)體的免疫應(yīng)答和特異性抗體水平，促進(jìn)免疫器官發(fā)育、淋巴細(xì)胞增殖以及降低遲發(fā)性過(guò)敏反應(yīng)[9-11]。然而，在正常小鼠模型中，美拉德糖基化反應(yīng)對(duì)酪蛋白消化物的免疫活性是否有不良的影響或副作用，尚鮮見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究利用乳糖和酪蛋白制備糖基化酪蛋白，胰蛋白酶消化制備酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物，評(píng)估糖基化酪蛋白消化物對(duì)正常小鼠免疫狀況的作用，并與酪蛋白消化物作用對(duì)比，揭示美拉德糖基化反應(yīng)對(duì)酪蛋白消化物免疫活性的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雌性BALB/c小鼠（6～8 周齡；生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，使用許可證號(hào)：SYXK（黑）2016-007）和飼料 北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司；小鼠淋巴瘤YAC-1細(xì)胞 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)按照哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物準(zhǔn)則執(zhí)行。

酪蛋白、乳糖、刀豆蛋白（concanavalin A，ConA）美國(guó)Sigma公司；磷酸鹽緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；胰蛋白酶（比酶活力120 kU/g） 北京奧博星生物技術(shù)有限公司；臺(tái)盼藍(lán) 美國(guó)Amresco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基 美國(guó)HyClone公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 加拿大Wisent公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。酶法測(cè)定半乳糖試劑盒 美國(guó)BioAssay Systems公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒 日本Dojindo公司；鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）（IgM、IgA、IgG）檢測(cè)試劑盒 南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DELTA 320型精密pH計(jì)、AL204型電子分析天平梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HF-90型CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)力康公司；Model 680型酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Rad公司；DK-98-1型電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；DXC 800自動(dòng)生化分析儀 美國(guó)Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 乳糖糖基化酪蛋白消化物的制備

取一定量乳糖均勻分散于60 g/L酪蛋白溶液中，使乳糖和酪蛋白質(zhì)量比為1.6∶1，調(diào)整酪蛋白終質(zhì)量濃度為50 g/L、溶液pH 6.8。將反應(yīng)物于沸水?。?00 ℃）中反應(yīng)3 h，然后將樣品在冰浴中迅速冷卻至室溫。調(diào)整溶液pH值至4.5，4 000×g離心10 min，收集沉淀，pH 4.5下水洗2 遍，所得沉淀用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)至中性，冷凍干燥后粉碎得到糖基化酪蛋白（乳糖含量（13.2±0.4）g/kg pro）。

用去離子水配制質(zhì)量濃度為50 g/L的酪蛋白溶液和糖基化酪蛋白溶液，調(diào)整溶液pH 7.0，然后分別加入7 kU/g pro胰蛋白酶，37 ℃水解4 h，沸水浴滅酶5 min，快速冷卻至20 ℃，再用0.5 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH 7.0，冷凍干燥粉碎后得到酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物（乳糖含量（10.6±0.3）g/kg pro）。

1.3.2 化學(xué)指標(biāo)測(cè)定

蛋白含量：用凱氏定氮法測(cè)定樣品含氮量，轉(zhuǎn)換因子為6.38。

乳糖含量：按照文獻(xiàn)[12]方法測(cè)定乳糖含量。稱(chēng)取一定量樣品于安瓿瓶，加入2 mL 2 mol/L三氟乙酸溶液，100 ℃水解4 h，冷卻至20 ℃，用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)整pH值至7.0，用半乳糖檢測(cè)試劑盒測(cè)定水解液半乳糖濃度，然后換算為樣品中的乳糖含量。

1.3.3 小鼠分組

雌性BALB/c小鼠70 只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，隨機(jī)分為7 組：空白組和6 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10 只。空白組小鼠每天灌胃生理鹽水，實(shí)驗(yàn)組小鼠每天給予3 種劑量的酪蛋白消化物或糖蛋白消化物（低、中、高劑量分別為100、200 mg/kg mb和400 mg/kg mb），持續(xù)28 d。

1.3.4 血清生化指標(biāo)和免疫球蛋白分析

小鼠末次灌胃24 h后，稱(chēng)體質(zhì)量，眼球采血。血液樣品于2 000×g離心10 min，用DXC 800自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清生化指標(biāo)。收集血清樣品用相應(yīng)試劑盒按照說(shuō)明書(shū)操作步驟測(cè)定IgM、IgA、IgG質(zhì)量濃度。

1.3.5 脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)測(cè)定

小鼠眼球取血后，脫頸處死，剖取脾臟和胸腺，稱(chēng)濕質(zhì)量，分別按式（1）、（2）計(jì)算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。

1.3.6 脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

無(wú)菌條件下將各組小鼠剖腹、取出脾臟，剪成小塊置于200 目不銹鋼網(wǎng)篩，篩網(wǎng)中央浸沒(méi)于盛有Hank’s液的平皿中。無(wú)菌注射器芯研磨脾臟組織，用Hank’s液把網(wǎng)篩上剩余組織吹洗掉，收集脾臟組織懸液于無(wú)菌離心管，199×g下離心5 min，棄去上清液。加入3 mL紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞，靜置3 min，199×g離心5 min，棄去上清液；RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)實(shí)驗(yàn)計(jì)算細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞比例不少于95%，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/mL。

將200 μL脾細(xì)胞懸液接種于96 孔板，同時(shí)加20 μL ConA（終質(zhì)量濃度為5 μg/mL），置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h；加入20 μL CCK-8，繼續(xù)于37 ℃培養(yǎng)4 h；然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定光密度值。以不添加脾細(xì)胞添加RPMI-1640培養(yǎng)液作空白孔。脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)按式（3）計(jì)算[13]。

1.3.7 自然殺傷細(xì)胞活力分析

將靶細(xì)胞YAC-1細(xì)胞用RPMI培養(yǎng)液（含有體積分?jǐn)?shù)10% FBS）調(diào)整細(xì)胞濃度至1×104個(gè)/mL。將脾細(xì)胞懸液（5×105個(gè)/mL）和靶細(xì)胞懸液（1×104個(gè)/mL）各100 μL/孔接種于96 孔板，同時(shí)設(shè)定效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞實(shí)驗(yàn)孔。細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，加入15 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度值。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞活力按式（4）計(jì)算[14]。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 16.0軟件中的單因素方差分析和Duncan’s多重比較法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定各組間數(shù)據(jù)的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

本實(shí)驗(yàn)中兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清17 項(xiàng)生化指標(biāo)的影響如表1所示。與空白組小鼠相比，糖基化酪蛋白消化物組小鼠血清各項(xiàng)指標(biāo)均增加，表明糖基化酪蛋白消化物改善了小鼠生理狀況。然而，與酪蛋白消化物相比，糖基化酪蛋白消化物對(duì)小鼠生理狀況的改善程度要低一些，在小鼠體內(nèi)糖基化酪蛋白消化物的活性低于酪蛋白消化物。這可能是由于美拉德反應(yīng)破壞了蛋白質(zhì)中賴(lài)氨酸等氨基酸[15-16]。因此，酪蛋白乳糖糖基化導(dǎo)致酪蛋白消化物在正常小鼠中的活性降低。

表1 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 1 Serum biochemical indices of mice in response to the two digests

對(duì)于5 項(xiàng)重要生化指標(biāo)（總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、球蛋白（globulin，GLO）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine amiotransferase，ALT）和血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）），與空白組小鼠相比，酪蛋白消化物組小鼠血清TP質(zhì)量濃度增加了9.8%～26.4%、ALB質(zhì)量濃度增加了6.9%～26.0%、GLO質(zhì)量濃度增加了8.1%～42.1%、ALT活力增加了11.1%～38.9%和BUN濃度增加了12.9%～29.0%。而糖基化酪蛋白消化物組小鼠血清5 項(xiàng)重要生化指標(biāo)較空白組小鼠僅分別增加了7.9%～25.5%、6.3%～23.9%、3.4%～33.2%、7.4%～22.2%和3.2%～19.4%。兩種酪蛋白消化物處理組間，灌胃劑量為100 mg/kgmb時(shí)，小鼠血清BUN濃度差異顯著；灌胃劑量為200 mg/kgmb時(shí)，TP質(zhì)量濃度、ALT活力和BUN濃度均差異顯著；灌胃劑量為400 mg/kgmb時(shí)，ALT活力和BUN濃度差異顯著。以上結(jié)果表明，酪蛋白消化物較糖基化酪蛋白消化物對(duì)正常小鼠具有更好的免疫提升效率。動(dòng)物血清生化指標(biāo)常用于反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的生理代謝與健康狀況[17]。血清TP主要由血清GLO和血清ALB構(gòu)成。TP在維持血管內(nèi)膠體滲透壓、運(yùn)輸養(yǎng)分等功能中具有重要作用，可反映機(jī)體本身的營(yíng)養(yǎng)狀況和對(duì)蛋白質(zhì)的消化吸收情況，TP含量越高，表明機(jī)體合成蛋白質(zhì)能力越強(qiáng)，即動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況良好[18]。ALT是檢測(cè)肝功能的重要指標(biāo)。血清BUN為機(jī)體蛋白質(zhì)和氨基酸等組分的代謝產(chǎn)物，是反映動(dòng)物體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝和氨基酸平衡狀況的指標(biāo)[19]。已有研究表明，膳食補(bǔ)充L-賴(lài)氨酸可通過(guò)影響血清生化指標(biāo)調(diào)控機(jī)體免疫功能[20]。

2.2 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清中Ig分泌的影響

圖1 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠血清IgM（A）、IgA（B）和IgG（C）分泌的影響Fig. 1 Effects of the two digests on the levels of serum IgM (A), IgA (B),and IgG (C) of mice

由圖1可知，與空白組小鼠比較，酪蛋白消化物處理使小鼠血清IgM、IgA和IgG質(zhì)量濃度分別增加了5.3%～29.6%、14.3%～44.5%和12.2%～31.7%，糖基化酪蛋白消化物處理使小鼠血清IgM、IgA和IgG質(zhì)量濃度分別增加了3.9%～26.7%、9.9%～31.3%和2.26%～29.5%。酪蛋白消化物組小鼠與糖基化酪蛋白消化物組小鼠在灌胃劑量為200 mg/kg mb和400 mg/kg mb時(shí)，IgM質(zhì)量濃度差異顯著；在灌胃劑量為100、200 mg/kg mb和400 mg/kg mb時(shí)，IgA和IgG質(zhì)量濃度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在同一劑量水平下，酪蛋白消化物顯示出比糖基化酪蛋白消化物更強(qiáng)的作用效果，證明酪蛋白的糖基化反應(yīng)降低了酪蛋白消化物提升小鼠Ig分泌的能力。Ig是機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)分子，由動(dòng)物機(jī)體內(nèi)淋巴系統(tǒng)B細(xì)胞產(chǎn)生，其含量大小直接反映動(dòng)物機(jī)體免疫應(yīng)答能力的高低[21]。已有研究表明，鯉魚(yú)卵蛋白的胃蛋白酶水解物可以顯著提高小鼠IgA和IgG的分泌[22]；大豆低聚糖可以增加小鼠IgM、IgA和IgG的分泌[23]；酪蛋白肽通過(guò)促進(jìn)Ig產(chǎn)生和免疫分子分泌，實(shí)現(xiàn)對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)控作用[24-26]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明兩種酪蛋白消化物均對(duì)正常小鼠血清Ig分泌具有促進(jìn)作用。

2.3 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

圖2 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響Fig. 2 Effects of the two digests on immune organ indices of mice

由圖2可知，與空白組小鼠比較，給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，各劑量組小鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)均顯著增加（P＜0.05）。酪蛋白消化物處理導(dǎo)致小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)較空白組小鼠分別增加了21.0%～37.4%和38.2%～74.0%，而糖基化酪蛋白消化物處理導(dǎo)致小鼠兩種免疫器官指數(shù)較空白組小鼠分別增加13.1%～28.0%和25.2%～58.5%。在同一劑量水平下，酪蛋白消化物對(duì)兩種免疫器官指數(shù)的提升作用均強(qiáng)于糖基化酪蛋白消化物，并且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明酪蛋白的糖基化反應(yīng)不利于酪蛋白消化物改善小鼠脾臟和胸腺的生長(zhǎng)發(fā)育狀況。

脾臟是動(dòng)物的外周免疫器官，富含T淋巴細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，是體液和細(xì)胞免疫的中心。胸腺是動(dòng)物的一級(jí)免疫器官，對(duì)T細(xì)胞成熟和分化起作用[27]。因此，脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)可直接反映機(jī)體免疫狀況。研究表明，毛霉發(fā)酵豆制品毛豆腐及其提取物可以增加正常小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高動(dòng)物免疫狀況[28]。胃蛋白酶水解薏苡仁谷蛋白后，其水解物可以增加小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，提高動(dòng)物免疫狀況[29]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與這些研究的結(jié)論一致。

2.4 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活力的影響

圖3 兩種酪蛋白消化物對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞增殖和NK細(xì)胞活力的影響Fig. 3 Effects of the two digests on lymphocyte proliferation and NK cell activity in mice

由圖3可知，兩種酪蛋白消化物以劑量依賴(lài)方式促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和增強(qiáng)NK細(xì)胞活力。與空白組小鼠相比，酪蛋白消化物處理組小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和NK細(xì)胞活力分別提高了5.9%～42.0%和23.4%～63.0%，而糖基化酪蛋白消化物處理組小鼠僅分別提高了4.5%～36.2%和13.5%～53.4%。兩種酪蛋白消化物處理組小鼠相比，在灌胃劑量100 mg/kg mb時(shí)，僅NK細(xì)胞活力有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；在灌胃劑量200 mg/kg mb和400 mg/kg mb時(shí)，脾淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)和NK細(xì)胞活力均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。因此，糖基化酪蛋白消化物刺激小鼠脾細(xì)胞增殖的能力低于酪蛋白消化物，再次證明糖基化反應(yīng)降低了酪蛋白消化物提升小鼠免疫細(xì)胞活性的作用。

脾淋巴細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞，其增殖和分化是機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程的一個(gè)重要階段。因此，通過(guò)對(duì)淋巴細(xì)胞增殖作用的評(píng)估可以間接證明動(dòng)物機(jī)體的免疫水平[30]。NK細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞，與機(jī)體抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[31]。已有研究結(jié)果表明，乳蛋白肽可以促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖和提高NK細(xì)胞活力[32]。胃蛋白酶水解鯉魚(yú)卵蛋白后，其水解物顯著提高了小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖作用和NK細(xì)胞活力[22]。用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶混合水解乳清分離蛋白，其消化物均具有增強(qiáng)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的作用[33]。這些結(jié)論為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了科學(xué)依據(jù)。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)評(píng)估正常小鼠的17 項(xiàng)血清生化指標(biāo)、3 種血清Ig質(zhì)量濃度、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)、淋巴細(xì)胞增殖指數(shù)、NK細(xì)胞活力等重要免疫學(xué)指標(biāo)，明確了酪蛋白的美拉德乳糖糖基化反應(yīng)對(duì)酪蛋白消化物的不利影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，正常小鼠分別給予酪蛋白消化物和糖基化酪蛋白消化物后，雖然免疫狀況均得到提升，各指標(biāo)數(shù)值增加，但酪蛋白消化物具有比糖基化酪蛋白消化物更好的免疫提升效率。因此，本研究結(jié)果揭示酪蛋白的美拉德乳糖糖基化反應(yīng)對(duì)酪蛋白消化物的體內(nèi)免疫提升活性有不良影響?？紤]蛋白質(zhì)的美拉德糖基化反應(yīng)可能降低蛋白質(zhì)消化物的免疫活性，而乳品加工過(guò)程中乳蛋白和乳糖之間的美拉德反應(yīng)不可避免，因此，控制乳制品加工處理過(guò)程中的美拉德反應(yīng)具有重要意義和必要性。