廢棄黑葵花籽殼綠色制備金納米粒子及其抗氧化和催化性能

關(guān)樺楠，宋 巖，龔德狀，劉 博，韓博林，楊 帆，劉曉飛，張 娜

（哈爾濱商業(yè)大學食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

近年來，金屬納米材料因其特殊的物理化學性質(zhì)，已成為諸多領域的研究熱點[1-3]。以金納米粒子（AuNPs）為典型代表的貴金屬納米材料已被廣泛應用于生化分析[4]、生物制藥[5]、光學成像[6]、催化合成[7]和半導體制備[8]等領域。AuNPs具有良好的生物相容性，因其微小的粒徑和較高的比表面積具有良好的催化、光學、電化學、吸附特性以及表面等離子體共振等優(yōu)良性能[9-10]。AuNPs的制備通常采用化學還原法，利用還原劑將Au（III）轉(zhuǎn)變?yōu)閱钨|(zhì)金種，繼而生長為不同表觀形態(tài)的AuNPs。還原劑種類對AuNPs的粒徑、形狀、穩(wěn)定性甚至諸多特性均有顯著影響[11]。AuNPs通常被應用于醫(yī)藥、食品加工和物質(zhì)分析等領域，對其生物相容性和安全性有較高的要求，鑒于此，AuNPs綠色制備技術(shù)研發(fā)已吸引了國內(nèi)外諸多研究機構(gòu)的熱切關(guān)注[12-14]。

目前，AuNPs綠色制備技術(shù)中的還原劑多采用具有天然還原性成分的植物源材料，主要包括植物莖葉提取物[15]、花瓣提取物[16]、根系提取物[17]、種子油脂提取物[18]、果實提取物及多種植物生物質(zhì)材料[19]。這些提取物材料中大多含有較高濃度的脂肪酸類、維生素類、多酚類和黃酮類等具有還原性的天然活性成分[20]。這些還原性物質(zhì)在制備過程中，因其結(jié)構(gòu)的不同，多數(shù)成分以穩(wěn)定劑的形式分布在AuNPs外表層，在防止AuNPs聚集的同時還能有效提升AuNPs的相關(guān)性能。研究表明，采用不同植物成分所制備的AuNPs，不僅具有良好的生物安全性，而且可有效改良AuNPs的抗菌性能、催化性能、抗氧化性能和光電化學性能[21-23]。

黑葵花籽在我國北方地區(qū)分布廣泛，相關(guān)的食品種類也十分豐富，其食品加工過程中會產(chǎn)生大量的葵花籽殼廢棄物，如果處理不當不僅污染環(huán)境，而且容易傳播疾病[24-25]。與此同時，多項研究成果表明，黑葵花籽殼中含有豐富的花色苷類物質(zhì)和多酚類物質(zhì)。本實驗擬采用廢棄黑葵花籽殼提取物快速綠色制備AuNPs，并考察AuNPs的穩(wěn)定性、抗氧化活性和催化活性，為貴金屬納米材料在食品和醫(yī)藥行業(yè)的進一步應用提供基本資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑葵花籽 黑龍江省密山大成瓜子經(jīng)銷有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、氯金酸、硼氫化鈉 美國Sigma-Aldrich公司；4-硝基苯酚（4-nitrophenol，4-NP）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol，BHT） 國藥集團化學試劑有限公司；實驗試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FWl00高速萬能粉碎機 中國天津市泰斯特儀器有限公司；R-201旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 中國上海申順生物科技有限公司；BT-9300H激光粒度分布儀 美國惠普公司；JEOL2000透射電子顯微鏡 日本電子株式會社；MAGNA-IR560E.S.P傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）儀 美國Nicolet公司；phi-5000Versaprobe X射線衍射儀（X-ray diffraction，XRD） 美國ULVCA-PHI公司。

1.3 方法

1.3.1 黑葵花籽殼提取物的制備

將黑葵花籽手動剝殼，采用雙蒸水清洗黑葵花籽殼3 次，真空干燥后粉碎。精確稱取黑葵花籽殼粉末10 g，首先采用100 mL石油醚對其進行脫脂，再用300 mL體積分數(shù)為60%的乙醇溶液在50 ℃條件下回流提取1 h，過濾濃縮，獲得濃縮液100 mL，于4 ℃保存待用，此為黑葵花籽殼提取物原液（即100%提取物）。采用去離子水稀釋成不同體積分數(shù)的工作液，由低到高分別為0%提取物、10%提取物、20%提取物、40%提取物、60%提取物和80%提取物。

1.3.2 AuNPs的綠色合成

室溫條件下，將提前4 ℃預冷的20 mL氯金酸溶液（0.01 g/mL）置于錐形瓶中，伴隨磁力攪拌器溫和攪動（100 r/min）；1 min后，迅速加入不同體積分數(shù)黑葵花籽殼提取物2 mL；隨即觀察顏色的變化，即體系由淡黃色開始變?yōu)榈t色時，立刻提升攪拌速率（200 r/min），當體系顏色完全變?yōu)榫萍t色時，將整個體系于4 ℃貯存10 min，用以終止制備過程；4 000 r/min離心10 min去上清液，采用去離子水清洗沉淀1 次，4 000 r/min離心10 min后，再用5 mL去離子水溶解沉淀，此為黑葵花籽殼提取物綠色合成的AuNPs溶膠，計算溶膠中AuNPs的質(zhì)量濃度；擬通過紫外-可見光光譜、粒徑分布和表觀形貌篩選最適工作液質(zhì)量濃度。

1.3.3 AuNPs的穩(wěn)定性分析

將AuNPs置于4 ℃保存不同時間（5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 d和60 d）。充分振蕩后，吸取1 mL AuNPs溶膠置于比色皿中，再添加2 mL的去離子水，置于紫外-可見光分光光度計中，考察相同波長下，特征吸收峰的峰值變化情況；考察不同溫度條件下（25、35、45、55、65 ℃和75 ℃）AuNPs的穩(wěn)定性；考察不同鹽濃度條件下（100、200、300、400、500、600 mmol/L和700 mmol/L）AuNPs的穩(wěn)定性，充分振蕩后，吸取1 mL AuNPs溶膠置于比色皿中，再添加2 mL的不同濃度NaCl溶液，靜置反應10 min后，搖勻，置于紫外-可見光分光光度計中，考察相同波長下，特征吸收峰的峰值變化情況；考察不同pH值條件下（2、3、4、5、6、7、8、9、10和11）AuNPs的穩(wěn)定性，采用NaOH和鹽酸調(diào)節(jié)pH值。

1.3.4 AuNPs的抗氧化性分析

采用DPPH法測定所制備AuNPs的抗氧化活性[15]。向離心管中依次添加3 mL的DPPH-乙醇溶液（40 mg/L）和不同質(zhì)量濃度的AuNPs溶膠（10、20、30、40、50、60、70 μg/mL和80 μg/mL），混勻后，室溫避光條件下，振蕩孵育1 h。吸取上清液，考察517 nm波長處的可見光特征峰峰值的變化。以DPPH-乙醇溶液作為空白對照，以相同質(zhì)量濃度的BHT作為標準抗氧化劑。抗氧化活性以抑制率指標，計算見式（1）[15]：

式中：I為抑制率/%；A0為空白對照的吸光度；A1為不同質(zhì)量濃度AuNPs溶膠和BHT樣品的吸光度。

1.3.5 AuNPs的催化活性

選擇催化4-NP液相還原為對氨基苯酚（4-aminophenol，4-AP）探針反應驗證所制備AuNPs的催化活性。向20 mL的4-NP溶液（2.5×10-4mol/L）中，依次加入3 mL AuNPs溶膠和1 mL新鮮配制的NaBH4（0.25 mol/L），混勻后靜置不同時間。在總體系中吸取反應液0.5 mL，加入到比色皿中，再加入2 mL去離子水，混合均勻后，置于紫外-可見光分光光度計中，掃描反應體系的吸收光譜，觀察295 nm和400 nm波長處的特征吸收峰變化。AuNPs催化反應速率kapp計算見式（2）[19]：

式中：A0為4-NP初始吸光度，At為4-NP在不同催化時間t（min）時的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗均重復3～5 次，利用Origin 9.0軟件作圖，采用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑葵花籽殼提取物最適體積分數(shù)篩選及AuNPs的表征

由圖1可知，0%提取物制備體系無明顯的吸收峰，而10%～100%提取物制備體系都在波長526 nm處呈現(xiàn)出明顯的吸收峰。根據(jù)Mie理論，該峰為AuNPs的特征峰，且在波長520 nm左右出現(xiàn)明顯吸收峰的AuNPs，一般粒徑在3～20 nm范圍內(nèi)[4]。圖1說明黑葵花籽提取物中的活性成分可以作為還原劑制備出粒徑合適的AuNPs。從圖1可知，體積分數(shù)為100%、80%和60%提取物制備的AuNPs特征峰峰值皆高于0.5，而40%及以下提取物所制備的AuNPs峰值較弱，說明伴隨提取物體積分數(shù)越高，AuNPs的數(shù)量越多。鑒于體積分數(shù)為100%、80%和60%提取物制備的AuNPs數(shù)量較為接近，繼續(xù)通過粒徑分布數(shù)據(jù)對這3 個體積分數(shù)提取物制備的AuNPs進行篩選。

測定體積分數(shù)為100%、80%和60%提取物制備的AuNPs粒徑分布，見圖2。一般認為，AuNPs諸多性能與其粒徑大小和形狀有密切相關(guān)性，粒徑越小，性能越優(yōu)越[15,19,22]。由圖1可知，3 個體積分數(shù)提取物制備的AuNPs形狀差異不大（吸收峰波長基本一致），鑒于此，本實驗基于平均粒徑的大小篩選最適的提取物體積分數(shù)。由圖2可知，100%提取物制備的AuNPs平均粒徑為（7.84±2.56）nm，80%提取物制備的AuNPs平均粒徑為（7.25±2.24）nm，60%提取物制備的AuNPs平均粒徑為（7.49±1.31）nm。該結(jié)果表明，粒徑與提取物體積分數(shù)無直接相關(guān)性，可能是因為100%體積分數(shù)提取物中在含有還原性物質(zhì)之外還含有高濃度的大分子物質(zhì)（如氨基酸或者有機酸等），這類物質(zhì)反而影響了金種的生長，造成金種成長過程中的聚集，導致粒徑偏大，而體積分數(shù)偏低的提取物沒有足夠劑量還原性物質(zhì)，也會影響AuNPs的生長[18]。綜上所述，選擇80%提取物制備AuNPs參與后續(xù)實驗。

圖 1 不同體積分數(shù)提取物制備AuNPs的紫外-可見光光譜Fig. 1 UV-visible spectra of gold nanoparticles prepared with different concentrations of the extract

圖 2 不同體積分數(shù)提取物制備AuNPs的粒徑分布Fig. 2 Size distribution of gold nanoparticles prepared with different concentrations of the extract

采用透射電子顯微鏡表征80%提取物制備的AuNPs表觀形貌。由圖3A可知，AuNPs呈現(xiàn)圓球形，分散性良好，無明顯聚集現(xiàn)象，粒徑分布較為均勻，在6～10 nm之間，這與圖2B中粒徑表征結(jié)果基本一致。

為進一步揭示黑葵花籽殼提取物中的天然成分在AuNPs形成過程中的作用，采用FTIR表征葵花籽殼提取物和AuNPs表面化合物結(jié)構(gòu)。從圖3B可以看出，AuNPs分別在3 268、1 644 cm-1和1 475 cm-1處具有明顯吸收峰，分別對應O—H、C＝C和O—H。部分研究成果表明，黑葵花籽殼中富含的花色苷是一種以黃酮核為基礎含有C6—C3—C6骨架的類黃酮物質(zhì)，表面富含大量的—OH[26]。通過與提取物吸收峰作比較，AuNPs在1 644 cm-1處對應的C＝C應該來自于提取物中的碳骨架，在1 475 cm-1處對應的O—H應該來源于花色苷中豐富的羥基基團和多酚類物質(zhì)。而在3 268 cm-1處所對應的O—H，因其較高的透光率峰值，推斷可能來自于體系中殘留的乙醇或者提取物中的其他的多酚類物質(zhì)[19,26]。對比研究葵花籽殼提取物與制備反應后的體系上清液（主要成分為殘余的提取物和氯金酸）之間的成分變化，可以看出在1 644 cm-1和1 475 cm-1處的吸收峰強度明顯下降，說明C＝C和O—H基團數(shù)量減少，表明提取物中的類黃酮和花色苷等活性成分含量降低，進一步說明提取物中的活性成分參與AuNPs的還原制備過程。綜上所述，圖3B結(jié)果充分說明提取物中的花色苷和多酚類物質(zhì)不僅作為AuNPs合成過程中的還原劑，還可與AuNPs表面結(jié)合充當保護劑。

從圖3C可見，衍射峰（111）、（200）、（220）和（311）分別對應2θ為38.25°、44.58°、64.93°和77.61°，皆為AuNPs的特征衍射峰[27]，其中（111）和（311）說明AuNPs為催化裂化型晶格，有助于提升該納米粒子的催化性能。

圖 3 AuNPs透射電子顯微鏡圖（A）、FTIR光譜圖（B）和XRD圖（C）Fig. 3 TEM image of gold nanoparticles with (A), FTIR spectra of gold nanoparticles and the extract (B), and X-ray diffraction pattern of gold nanoparticles (C)

2.2 穩(wěn)定性分析

AuNPs穩(wěn)定性主要體現(xiàn)粒子尺寸依賴性上，根據(jù)其表面等離子共振特性，當粒徑、間距和形狀發(fā)生變化時，紫外-可見光光譜中的表面離子共振特征峰會發(fā)生衰減或偏移（紅移或藍移）[11]。本實驗分別評估黑葵花籽殼提取物綠色制備的AuNPs在不同貯藏時間、溫度、鹽濃度和pH值條件下的穩(wěn)定性，以特征峰波長526 nm處的吸光度作為指標，考察不同條件下其變化情況。

由圖4A可知，在4 ℃長期貯存條件下，AuNPs在前30 d貯存期內(nèi)，特征峰的峰值變化不大，說明貯藏30 d過程中，AuNPs沒有發(fā)生團聚，且數(shù)量穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)沉淀；當貯存時間超過30 d以后，峰值開始出現(xiàn)輕微的下降；貯存60 d后的峰值與初始峰值之比，仍然高于90%，說明制備的AuNPs具有良好貯存穩(wěn)定性。選擇25～75 ℃水浴加熱20 min，評估AuNPs在常見溫度范圍內(nèi)的穩(wěn)定性，見圖4B。結(jié)果表明，溫度對AuNPs的穩(wěn)定性影響較小，峰值變化不大。AuNPs的“高鹽聚集”是其一個非常重要的現(xiàn)象，但是卻在某些領域上限制了其廣泛應用，尤其在食品藥品催化加工或者成分檢測時，鹽濃度對其穩(wěn)定性的影響不可忽視。本研究以氯化鈉為模型，考察AuNPs在高鹽濃度下的穩(wěn)定性。如圖4C所示，當體系中NaCl濃度超過300 mmol/L時，特征峰的峰值開始出現(xiàn)明顯下降趨勢；當NaCl濃度達到700 mmol/L時，峰值下降至初始峰值的1/3。該結(jié)果是因為高濃度金屬陽離子（Na＋）大量吸附在某些AuNPs表面，與部分AuNPs表面的負電荷物質(zhì)（花色苷或多酚類物質(zhì)）發(fā)生靜電吸附，導致不同粒子之間的聚集，從而引起吸收峰位置的紅移[13]。但是在NaCl濃度不超過300 mmol/L時，仍然保持較高的穩(wěn)定性，已優(yōu)于其他研究的成果[16,21,27]。由圖4D可知，AuNPs在強酸體系中（pH＜3），峰值出現(xiàn)明顯下降，呈現(xiàn)出不穩(wěn)定性。根據(jù)之前的實驗結(jié)果推測，所制備的AuNPs表面會有花色苷或者某些多酚物質(zhì)作為保護劑，而其中花色苷對pH值較為敏感。當花色苷處于酸性體系中時，其結(jié)構(gòu)會逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S鹽陽離子，該陽離子所帶正電荷會加劇AuNPs的聚集甚至出現(xiàn)沉淀，導致特征峰峰值劇烈下降[27]。鑒于此，也可推斷AuNPs表面應該覆蓋有負電荷。綜上所述，AuNPs分別在在不同貯藏時間、溫度、鹽濃度和pH值條件下都體現(xiàn)了良好的穩(wěn)定性。該結(jié)果可對AuNPs在某些領域的使用進行有效指導。

圖 4 AuNPs的穩(wěn)定性分析Fig. 4 Stability of gold nanoparticles

2.3 抗氧化活性分析

本實驗以BHT對照，以DPPH自由基抑制率為指標，考察黑葵花籽殼提取物制備AuNPs的抗氧化活性即供氫能力。由圖5可知，當添加的AuNPs和BHT質(zhì)量濃度在10～30 μg/mL范圍內(nèi)時，AuNPs的抗氧化能力與BHT有一定差距；AuNPs質(zhì)量濃度逐漸增加時，抗氧化能力隨之提高，當添加質(zhì)量濃度為80 μg/mL時，AuNPs對DPPH的抑制率（27.9%）與BHT（28.1%）極為接近。結(jié)果表明，綠色制備的AuNPs在適宜質(zhì)量濃度下有良好的抗氧化活性。同時也再一次證明，AuNPs表面存在花色苷和多酚類物質(zhì)作為保護劑，此類物質(zhì)的羥基等基團具有良好的抗氧化性能。

圖 5 黑葵花籽殼提取物合成AuNPs的抗氧化活性Fig. 5 Antioxidant activity of gold nanoparticles synthesized with black sunflower seed shell extract

2.4 催化活性分析

采用綠色制備的AuNPs催化4-NP轉(zhuǎn)化4-AP，以此作為評估其催化活性的探針反應。一般研究認為貴金屬納米粒子作為催化劑，可在體系中含有過量NaBH4情況下，將BH4-和4-NP同時吸附在粒子表面，促進電子由供體（BH4-）向受體（4-NP）轉(zhuǎn)移，進而將4-NP轉(zhuǎn)化為4-AP，引起體系紫外-可見光吸收峰的位移[28-29]。由圖6可知，當體系中只含有4-NP和NaBH4兩種成分時，兩者之間沒有發(fā)生任何反應，其紫外光譜顯示僅在波長400 nm處具有吸收峰，此為4-NP的特征吸收峰。當向該體系中加入AuNPs時，波長400 nm處的吸收峰峰值開始下降，并伴隨著在波長295 nm處出現(xiàn)新的吸收峰（4-AP的特征峰），這充分證明了AuNPs能夠催化此還原反應，將4-NP逐漸轉(zhuǎn)化為4-AP。隨著催化時間的延長，4-NP的吸收峰峰值逐漸降低，對應的4-AP的吸收峰峰值在逐漸增大，見圖6A。當催化時間為11 min后，體系中的4-NP已接近全部轉(zhuǎn)化為4-AP。由圖6B可知，AuNPs在催化該反應過程中，ln（A0/At）和反應時間t之間存在良好的線性關(guān)系，說明該反應符合準一級反應動力學，因此，AuNPs催化4-NP轉(zhuǎn)化為4-AP反應可用一級動力學體系評估其催化反應速率。根據(jù)該方程計算，kapp值為0.004 23 s-1，該反應速率優(yōu)于大部分研究結(jié)果[11,14-15,17,30-31]，其原因為AuNPs表面的富含多種活性基團，有助于吸附BH4-和4-NP，可促進電子的傳遞，該結(jié)果與其他研究類似[30-31]。綜上所述，采用黑葵花籽殼提取物所制備的AuNPs具有良好的催化活性。

圖 6 AuNPs催化活性Fig. 6 Catalytic activity of gold nanoparticles

3 結(jié) 論

本實驗采用廢棄的黑葵花籽殼提取其活性成分，綠色還原氯金酸鹽成功制備具有微小粒徑和良好性能的AuNPs。結(jié)果表明，選擇80%提取物制備的AuNPs最為合適，平均粒徑為（7.25±2.24）nm。該粒子在不同溫度、貯藏時間、pH值和鹽濃度條件下具有良好的穩(wěn)定性，說明黑葵花籽殼中的活性成分（花色苷和多酚類）在AuNPs形成過程中既是還原劑又是保護劑。表面固著的活性成分極大改善了AuNPs的抗氧化活性。此外，利用黑葵花籽殼提取物制備AuNPs的催化動力學研究中所獲得的kapp值可達0.004 23 s-1，進一步說明其還具有良好的催化活性。采用此方法制備AuNPs不僅具有廣闊的應用前景和實踐價值，還可以拓寬其適用領域，在條件苛刻的食品藥品催化生產(chǎn)、食品藥品成分原位分析、醫(yī)療靶向及成像和環(huán)境保護方面顯示出較高的實用價值。同時，也可為其他種類貴金屬納米粒子和部分新型納米材料綠色制備技術(shù)的改良提供基礎資料。