具有抑制HT-29細(xì)胞增殖及益生功能乳酸桿菌的篩選

岳瑩雪，閆芬芬，李柏良，宋 月，史佳鷺，關(guān)嘉琦，霍貴成

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150030）

結(jié)直腸癌是第三大常見的癌癥，全世界每年診斷出超過一百萬例[1]。根據(jù)全球結(jié)直腸癌死亡率和發(fā)病率趨勢的調(diào)查，到2030年，預(yù)計(jì)結(jié)直腸癌疾病將增加60%，達(dá)到220多萬新病例和110萬人死亡[2]。高脂肪飲食、肥胖、飲酒、胃腸道慢性炎癥和慢性便秘被認(rèn)為是發(fā)生結(jié)直腸癌的主要原因。盡管基于手術(shù)的多學(xué)科治療（化療、放療和單克隆抗體）大大提高了結(jié)直腸癌患者的生存率，但晚期患者5 a內(nèi)的生存率僅為10%左右[3]。目前，大多數(shù)針對癌癥的化療藥物通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮其作用[4]。但這些化療藥物有不容忽視的副作用，例如化療引起的黏膜炎和放療引起的腹瀉，這些藥物損害了腸黏膜并改變了吸水能力[5]。大量研究集中在結(jié)腸癌的機(jī)制上，結(jié)腸癌的有效預(yù)防和治療已成為醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)[6]。

乳酸菌對人體健康的潛在益處包括刺激免疫系統(tǒng)、平衡腸道菌群、降低血清膽固醇及降低腫瘤風(fēng)險(xiǎn)等[7]。乳酸菌抗癌作用的潛在機(jī)制可能為改變宿主腸道微生物群的種類或數(shù)量、提高宿主的免疫應(yīng)激、抑制腫瘤生長、控制潛在有害細(xì)菌生長、產(chǎn)生抗腫瘤或抗誘變的代謝物等[8]。乳酸菌的活菌體具有激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的功能，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡并且可抑制Caco-2細(xì)胞[9]以及HT-29細(xì)胞[10]增殖。研究表明，副干酪乳桿菌M5的活菌體在體外可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[11]和抗結(jié)腸癌功能[12]。Cindy等[13]研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌能夠增加結(jié)直腸癌細(xì)胞系（LS513）的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)，表明這些乳酸菌可能具有抗癌活性。

生物氧化是生命有機(jī)體的重要生理過程，為生命提供能量的同時(shí)產(chǎn)生活性氧。研究表明一些疾病如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化及心血管疾病等都與體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生有關(guān)，但抗氧化防御系統(tǒng)不能完全有效地抵御或修復(fù)氧化帶來的損傷[14]。氧化DNA損傷誘導(dǎo)是某些藥物誘發(fā)癌癥癌變的初步反應(yīng)，而乳酸菌可以有效地減少氧化DNA損傷所造成的癌癥[15]。研究表明，口服乳酸菌及其代謝產(chǎn)物降低了活性氧族積累的風(fēng)險(xiǎn)，也降解了超氧化物陰離子和過氧化氫[16]。體外實(shí)驗(yàn)表明，植物乳桿菌MA2可耐受高達(dá)2.0 mmol/L的過氧化氫，其發(fā)酵物（發(fā)酵上清液、完整細(xì)胞和無細(xì)胞提取物）具有較強(qiáng)的還原能力、脂質(zhì)過氧化抑制能力、Fe2＋螯合能力以及各種自由基清除能力。另外，發(fā)酵上清液和細(xì)胞勻漿均顯示出谷胱甘肽過氧化物酶活性和超氧化物歧化酶活性[17]。

本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中分離出的15 株乳酸桿菌為研究對象，以具有良好黏附性能和益生功能的商業(yè)菌株LGG作為對照，對乳酸桿菌抑制HT-29細(xì)胞增殖、黏附性及其抗氧化性進(jìn)行研究。篩選出高抑制率乳酸桿菌，再通過主成分分析的方法篩選出高黏附性以及良好抗氧化性的乳酸桿菌，并對篩選出的菌株進(jìn)行模擬胃腸道耐受性評價(jià)，以期為乳酸菌功能食品的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

15 株乳酸桿菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室工業(yè)微生物菌種保藏中心提供，鼠李糖乳桿菌LGG ATCC 53103用作參考菌株，并已通過16S rRNA基因測序鑒定。

人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞株 青旗（上海）生物技術(shù)發(fā)展有限公司；MULTICELL胎牛血清 維森特生物技術(shù)（南京）有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基 美國HyClone公司；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒 美國APExBIO公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶-EDTA 美國Gibco公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、1,1-苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、鄰二氮菲、半胱氨酸、抗壞血酸、叔丁醇、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚 北京博奧拓達(dá)科技有限公司；硫酸亞鐵、雙氧水、無水乙醇、三氯化鐵、鐵氰化鉀 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS） 賽默飛世爾科技公司；三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA） 湖北廣奧生物科技有限公司；MRS培養(yǎng)基采用參考文獻(xiàn)[18]的方法制備。

1.2 儀器與設(shè)備

Heal Force型細(xì)胞培養(yǎng)箱 力康醫(yī)療生物科技控股有限公司；DMLB型光學(xué)顯微鏡 德國徠卡顯微鏡與系統(tǒng)公司；LDZF-50KB-II立式蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司；CJ-2D超凈工作臺(tái)、電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；DHP-927型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；JY-92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；臺(tái)式冷凍高速離心機(jī) 美國Sigma公司；DU800紫外-可見分光光度計(jì) 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸桿菌的培養(yǎng)

所用供試乳酸桿菌以2%（V/V）的接種量接種于MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，連續(xù)傳代3 次，其中第3代培養(yǎng)18 h以恢復(fù)菌種活力，并調(diào)整菌液為各實(shí)驗(yàn)所需濃度。

1.3.2 HT-29細(xì)胞的培養(yǎng)

從液氮罐中取出HT-29細(xì)胞，將凍存管迅速置于37 ℃水浴中復(fù)蘇細(xì)胞。離心收集細(xì)胞，加入4 mL高糖DMEM培養(yǎng)液（含體積分?jǐn)?shù)10%的熱滅活胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素），置于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每隔1～2 d更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長狀況良好時(shí)（70%～80%融合），按實(shí)驗(yàn)所需濃度接種于96 孔板或12 孔板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK-8法檢測乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞的增殖抑制作用

參照CCK-8試劑盒說明書略作修改。具體為當(dāng)培養(yǎng)瓶中的HT-29細(xì)胞達(dá)到70%～80%融合后，棄去舊的培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，用1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA進(jìn)行消化，2 min左右后吹散均勻。1 000 r/min離心5 min，棄掉上清液，用含雙抗DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為104個(gè)/mL，每孔100 μL細(xì)胞懸液接種于96 孔培養(yǎng)板，待96 孔板中的細(xì)胞完全貼壁，去掉舊培養(yǎng)液，PBS清洗3 次后加入200 μL不含雙抗的高糖DMEM菌懸液，以活菌體與細(xì)胞感染比為10∶1做乳酸桿菌對結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞增殖抑制的影響實(shí)驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置空白對照組，每組設(shè)置5 個(gè)重復(fù)孔。乳酸桿菌（活菌體）105CFU/mL作用HT-29細(xì)胞48 h后去掉舊培養(yǎng)液，PBS清洗3 次，每孔加110 μL混合液（100 μL無雙抗DMEM培養(yǎng)液＋10 μL CCK-8），隨后在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測OD值。抑制率按式（1）計(jì)算：

1.3.4 乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附性實(shí)驗(yàn)

采用占萌等[19]的方法，并稍作改動(dòng)。將HT-29細(xì)胞以105細(xì)胞/孔的濃度接種至12 孔板中，孔中培養(yǎng)液1～2 d更換一次，待細(xì)胞貼壁完全后，繼續(xù)培養(yǎng)約5 d，細(xì)胞鋪滿孔板時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的前一天，向孔板中更換不含雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液。添加乳酸桿菌之前，用無菌PBS洗滌孔板中單層細(xì)胞3 次，再向每個(gè)孔中加入500 μL濃度為109CFU/mL（V0）的乳酸桿菌。將12 孔板轉(zhuǎn)移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)2 h后用PBS洗滌12 孔板中每孔的單層細(xì)胞3 次以上，除游離的、未附著的細(xì)菌細(xì)胞。然后向每孔中加入250 μL 0.25%胰蛋白酶-EDTA孵育5 min；再加入250 μL含血清高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化。收集每孔內(nèi)溶液并分別進(jìn)行10 倍梯度稀釋，采用平板菌落計(jì)數(shù)法檢測培養(yǎng)后菌株的活菌數(shù)（V1）。黏附率按式（2）計(jì)算：

1.3.5 乳酸桿菌抗氧化能力的測定

1.3.5.1 供試樣品的制備

將活化好的乳酸桿菌8 000 r/min離心10 min，收集上清液，0.22 μm濾膜過濾，即為菌體發(fā)酵上清液。離心后的沉淀用PBS沖洗2 遍，8 000 r/min離心10 min，收集菌體，重懸于PBS中調(diào)整菌體濃度為109CFU/mL，即為活菌懸液。

細(xì)胞破碎液的制備：將菌懸液置于冰浴中，超聲破碎菌體細(xì)胞（超聲條件：800 W，超聲3 s，停5 s，持續(xù)15 min），顯微鏡下觀察無完整菌體，8 000 r/min離心10 min，收集上清液，即為菌體細(xì)胞破碎液。

1.3.5.2 溶液還原性的測定

參照Lin等[20]的方法，并有適當(dāng)改動(dòng)。取0.5 mL樣品加入0.5 mL 1%的鐵氰化鉀和0.5 mL的PBS（pH 7.2）混勻后，于50℃放置20 min，快速冷卻，加入0.5 mL 10%的TCA溶液，6 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL加入1 mL的0.1%的三氯化鐵溶液混勻，靜置10 min，700 nm波長處測OD值。設(shè)置不同劑量的半胱氨酸組作為標(biāo)準(zhǔn)，將樣品的OD值，換算為標(biāo)準(zhǔn)組的劑量（μmol/L）。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值。

1.3.5.3 DPPH自由基清除能力的測定

在1 mL供試樣品中加入0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液1 mL，振蕩混勻，再在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，6 000 r/min離心10 min，取上清液，517 nm波長處測定樣品OD值[20]。空白為用1 mL無水乙醇取代1 mL DPPH反應(yīng)；對照為PBS取代樣品反應(yīng)，每組重復(fù)3 次，取平均值。按照式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率：

1.3.5.4 羥自由基清除能力的測定

在反應(yīng)體系中加入1 mL 2.5 mmol/L的鄰菲羅啉溶液，1 mL PBS和1 mL各供試樣品充分混勻，再加入1 mL 2.5 mmol/L的硫酸亞鐵溶液，充分混勻，再加入1 mL 20 mmol/L的過氧化氫溶液，37 ℃水浴1.5 h，在536 nm波長處測定樣品OD值[21]?？瞻诪? mL去離子水替代1 mL樣品反應(yīng)；對照為1 mL去離子水替代1 mL過氧化氫反應(yīng)，每組重復(fù)3 次，取平均值。按照式（4）計(jì)算羥自由基清除率：

1.3.5.5 超氧陰離子自由基清除能力的測定

在2.8 mL pH 8.2的0.05 mol/L Tris-HCl中加入0.1 mL 0.05 mol/L的鄰苯三酚溶液、0.1 mL各樣品，充分混勻，室溫條件下避光反應(yīng)4 min，加入1 mL 8 mol/L鹽酸終止反應(yīng)，于320 nm波長處測OD值[17]?？瞻诪槿ルx子水代替樣品反應(yīng)。按照式（5）計(jì)算超氧陰離子自由基清除率：

1.3.5.6 脂質(zhì)抗氧化能力的測定

在反應(yīng)體系中加入1 mL亞油酸乳化液、0.5 mL的PBS、0.2 mL 0.01%的FeSO4溶液和抗壞血酸溶液，再加入0.5 mL樣品溶液，旋渦混勻1 min，37 ℃避光反應(yīng)12 h，再次混勻；取2 mL反應(yīng)液加入0.2 mL 0.4%的三氯乙酸溶液、2 mL 0.8%的硫代巴比妥酸溶液以及0.2 mL 0.4%的2,6-二叔丁基對甲苯酚溶液，混勻，沸水浴下反應(yīng)30 min，冷卻后加入2 mL氯仿，3 000 r/min離心10 min取上清液，在532 nm波長處測OD值[21]。空白為用0.5 mL PBS替代樣品。脂質(zhì)抗氧化能力按式（6）計(jì)算：

1.3.6 主成分分析

篩選出8 株具有抑制HT-29細(xì)胞增殖的乳酸桿菌，然后對HT-29細(xì)胞進(jìn)行黏附實(shí)驗(yàn)，同時(shí)對菌株抗氧化能力實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最后對乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞黏附性以及抗氧化能力指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，以期篩選出性能最優(yōu)的益生菌。

1.3.7 模擬胃腸道實(shí)驗(yàn)

1.3.7.1 模擬胃液和胰液的配制

模擬胃液的配制：胃蛋白酶（1∶10 000）用滅菌（121 ℃，20 min）的PBS（pH 7.2）溶解配制成質(zhì)量濃度3 mg/mL的胃蛋白酶溶液。用1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至pH 3.0，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用。模擬胰液的配制：胰蛋白酶（1∶1 500）用滅菌（121 ℃，20 min）的PBS（pH 7.2）溶解配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL溶液，并用1 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 7.0后，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌后備用[22]。

1.3.7.2 模擬胃腸液耐受性實(shí)驗(yàn)

參照Nazzaro等[23]的方法并作修改，取5 mL活化好的嗜酸乳桿菌KLDS1.0901、KLDS1.1003菌液離心（8 000 r/min，4 ℃，10 min）收集菌體，用pH 7.2的滅菌PBS洗滌2 次再次離心收集菌體，然后在37 ℃、pH 3的人工胃液中孵育0、1、2、3 h，采用平板菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)量[24]。

同上，離心回收（8 000 r/min，4 ℃，10 min）在37 ℃人工胃液中孵育3 h的菌體，用pH 7.2的滅菌PBS洗滌2 次再次收集菌體，然后在37℃、pH 7的人工腸液中孵育0 、1、2、3 h，采用活菌計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

應(yīng)用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、顯著性分析和主成分分析，Origin 8.5進(jìn)行繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑制HT-29細(xì)胞乳酸桿菌的篩選

16 株菌對HT-29細(xì)胞均表現(xiàn)出一定的抑制效果，且對HT-29細(xì)胞的抑制作用差別顯著（2.78%～15.63%，P＜0.05），如表1所示。其中嗜酸乳桿菌KLDS1.1003、KLDS1.0901、KLDS1.0902和植物乳桿菌KLDS1.0386、KLDS1.0318、KLDS1.0344、KLDS1.0317、1-2的抑制活性均高于參考菌株LGG，分別為15.63%、15.00%、12.70%、12.52%、11.90%、11.81%、11.57%和10.02%，并顯著高于其他菌株。鼠李糖乳桿菌KLDS1.0205和5，植物乳桿菌1-5、2-2、4-4、4-5和8-6的抑制率均低于參考菌株LGG。Wang Shumei等[12]初篩乳酸桿菌時(shí)，在乳酸桿菌與HT-29細(xì)胞感染比10∶1、48 h的條件下篩選出具有抑制HT-29細(xì)胞增殖的乳酸桿菌，抑制率為5%～32%，其中多數(shù)為百分之十幾，與本研究結(jié)果一致。高錦錦[25]利用不同濃度嗜酸乳桿菌與HT-29細(xì)胞作用，在與本實(shí)驗(yàn)相同的條件時(shí)即可達(dá)到抑制HT-29細(xì)胞增殖的顯著效果。而LGG對結(jié)腸癌有潛在的保護(hù)作用并且可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和減輕炎癥[26]。因此，篩選8 株高于參考菌株的乳酸桿菌進(jìn)行黏附HT-29細(xì)胞以及抗氧化功能的實(shí)驗(yàn)。

表 1 乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞的抑制率Table 1 Inhibition rates of Lactobacillus against proliferation of HT-29 cells

2.2 乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附能力

黏附性強(qiáng)弱是益生菌篩選過程中的首要指標(biāo)，較強(qiáng)的腸道黏附能力能讓乳酸桿菌在腸道停留更長的時(shí)間，是后續(xù)發(fā)揮益生功能的前提條件[27]。乳酸桿菌與HT-29細(xì)胞作用后黏附能力如圖1所示。9 株乳酸桿菌活菌體對HT-29細(xì)胞的黏附率差別顯著（3.9%～19.1%，P＜0.05）。參照菌株LGG對HT-29細(xì)胞的黏附率為6.1%。其中黏附率依次為嗜酸乳桿菌KLDS1.0901＞植物乳桿菌KLDS1.0318＞植物乳桿菌KLDS1.0386＞植物乳桿菌KLDS1.0344，明顯高于其他菌株并高于參照菌株LGG，分別為19.10%、17.00%、13.80%和10.39%。其他菌株黏附率較低均不足6%。本實(shí)驗(yàn)中，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901與植物乳桿菌KLDS1.0318的黏附率較高且高于參照菌株。同時(shí)，9 株乳酸桿菌對細(xì)胞的黏附能力存在菌種差異性的同時(shí)也存在菌株差異性。實(shí)驗(yàn)所用乳酸桿菌可以黏附的原因可能是脂磷壁酸、表層蛋白、菌毛、肽聚糖以及脂多糖等這些可以與腸道細(xì)胞表面的受體進(jìn)行特異性結(jié)合的黏附素[28]。

圖 1 乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞的黏附率Fig. 1 Adhesion rates of 9 strains of Lactobacillus to HT-29 cells

2.3 乳酸桿菌抗氧化能力

2.3.1 還原性

乳酸桿菌的還原能力以半胱氨酸還原標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，如圖2所示。結(jié)果表明9 株乳酸桿菌均具有一定還原能力，范圍為23.43～271.76 μmol/L的L-半胱氨酸鹽酸鹽量，且每種樣品均具有顯著差異（P＜0.05）。其中活菌懸液還原能力最高的為嗜酸乳桿菌KLDS1.0901（170.84 μmol/L），其次為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003（161.11 μmol/L），其他菌株均在50 μmol/L以上。嗜酸乳桿菌KLDS1.1003與嗜酸乳桿菌KLDS1.0902菌體細(xì)胞破碎液的還原能力較強(qiáng)分別為193.51、175.69 μmol/L。其他菌株均在20 μmol/L以上。在菌體發(fā)酵上清液的還原能力中較強(qiáng)的為LGG（271.76 μmol/L）與嗜酸乳桿菌KLDS1.0901（246.16 μmol/L），其他菌株均在70 μmol/L以上。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷，不同屬及同屬不同的菌株具有還原能力的活性物質(zhì)含量不同。還原能力一般為菌體發(fā)酵上清液＞活菌懸液＞菌體細(xì)胞破碎液，其中LGG菌體發(fā)酵上清液還原能力最佳。

圖 2 乳酸桿菌的還原能力Fig. 2 Reducing capacity of live cell suspensions, lysates and culture supernatants of nine strains of Lactobacillus

2.3.2 DPPH自由基清除能力

如圖3所示，9 株乳酸桿菌清除DPPH自由基范圍為10.89%～50.42%?；罹鷳乙呵宄芰ψ顝?qiáng)的為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003（44.35%）且與其他菌株差異顯著（P＜0.05），其他菌株均在19%以上。同時(shí)嗜酸乳桿菌KLDS1.0901細(xì)胞破碎液清除率較強(qiáng)為27.34%，與植物乳桿菌KLDS1.0344和LGG無顯著差異（P＞0.05），與其他6 菌株差異顯著（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。在菌體發(fā)酵上清液中清除能力較強(qiáng)的為鼠李糖乳桿菌LGG（50.42%），與其他菌株差異顯著（P＜0.05），其他菌株均在27%以上。乳酸桿菌清除DPPH自由基能力多數(shù)為菌體發(fā)酵上清液大于活菌懸液，而菌體細(xì)胞破碎液的清除能力最差，說明各菌株的DPPH自由基清除能力很可能主要存在于胞外代謝產(chǎn)物中。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果嗜酸乳桿菌KLDS1.1003活菌懸液DPPH自由基清除率為44.10%。Son等[29]從韓國泡菜中分離出的植物乳桿菌SC61的DPPH自由基清除活性為51.06%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

圖 3 乳酸桿菌DPPH自由基清除能力Fig. 3 DPPH free radical scavenging activities of live cell suspensions,lysates and culture supernatants of nine strains of Lactobacillus

2.3.3 羥自由基清除能力

如圖4所示，9 株乳酸桿菌清除羥自由基范圍為7.46%～33.16%?；罹鷳乙呵宄芰^強(qiáng)的為植物乳桿菌KLDS1.0317（33.16%）、植物乳桿菌1-2（28.45%），與其他菌株具有顯著差異（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。植物乳桿菌KLDS1.0318、KLDS1.0386、KLDS1.0344、KLDS1.0317和LGG的菌體細(xì)胞破碎液清除率與其他菌株差異顯著（P＜0.05），最高的為植物乳桿菌KLDS1.0318（26.77%），其他菌株均在17%以上。在菌體發(fā)酵上清液中清除能力最強(qiáng)的為植物乳桿菌KLDS1.0318（10.65%），與部分菌株具有顯著差異（P＜0.05），其他菌株均在8%以上。乳酸桿菌活菌懸液清除羥自由基能力多數(shù)大于菌體細(xì)胞破碎液，最低的為菌體發(fā)酵上清液，說明這幾株菌的羥自由基清除活性成分主要存在于其胞內(nèi)成分和完整菌體中。Tang Wei等[17]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌MA2清除羥自由基率依次為：完整細(xì)胞（（58.52±0.90）%）＞菌體細(xì)胞破碎液（（30.82±0.40）%）＞發(fā)酵上清液（（1.27±2.43）%）。與本實(shí)驗(yàn)3 種供試樣品清除能力一致。

圖 4 乳酸桿菌羥自由基清除能力Fig. 4 DPPH free radical scavenging activities of live cell suspensions,lysates and culture supernatants of nine stains of Lactobacillus

2.3.4 超氧陰離子自由基清除能力

圖 5 乳酸桿菌超氧陰離子自由基清除能力Fig. 5 Superoxide anion radical scavenging activities of live cell suspensions, lysates and culture supernatants of Lactobacillus

如圖5所示，9 株乳酸桿菌超氧陰離子自由基清除率范圍為17.64%～46.13%?；罹鷳乙呵宄芰^強(qiáng)的為LGG（46.13%）、植物乳桿菌KLDS1.0344（33.61%），兩者差異顯著（P＜0.05），其他菌株均在17%以上。嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的菌體細(xì)胞破碎液清除率較強(qiáng)為42.32%，且與其他菌株差異顯著（P＜0.05）。其他菌株均在33%以上。在菌體發(fā)酵上清液中清除能力較強(qiáng)的為植物乳桿菌KLDS1.0318（26.53%）與植物乳桿菌KLDS1.0344（26.19%），這兩株不具有顯著差異（P＞0.05），但與其他菌株差異顯著（P＜0.05），其他菌株均在16%以上。本實(shí)驗(yàn)乳酸桿菌超氧陰離子自由基清除能力整體上為菌體細(xì)胞破碎液＞活菌懸液＞菌體發(fā)酵上清液，說明幾株菌清除超氧陰離子自由基的活性物質(zhì)大部分存在于胞內(nèi)。李曉軍等[30]發(fā)現(xiàn)菌株La5、菌株La8、保加利亞乳桿菌NQ2508以及長雙歧桿菌NQ1501對超氧陰離子自由基的清除率均在20.00%以上，其中La5最高為22.29%，而本實(shí)驗(yàn)植物乳桿菌KLDS1.0344活菌懸液清除率為33.61%，相比較高于菌株La5。

2.3.5 乳酸桿菌脂質(zhì)抗氧化能力

圖 6 乳酸桿菌脂質(zhì)抗氧化能力Fig. 6 Anti-lipid oxidation capacities of live cell suspensions, lysates and culture supernatants of nine strains of Lactobacillus

如圖6所示，9 株乳酸桿菌脂質(zhì)抗氧化能力范圍為10.45%～51.91%?；罹鷳乙呵宄芰^強(qiáng)的為植物乳桿菌KLDS1.0901（50.98%）和植物乳桿菌1-2（45.42%），其他菌株均在21%以上且每株菌之間都具有顯著差異（P＜0.05）。植物乳桿菌KLDS1.0318與LGG的菌體細(xì)胞破碎液清除率較強(qiáng)，分別為51.96%和47.71%，且與其他菌株差異顯著（P＜0.05），其他菌株均在10%以上。在菌體發(fā)酵上清液中清除能力較強(qiáng)的為植物乳桿菌1-2（32.97%)與其他菌株差異顯著（P＜0.05），其他菌株均在22%以上。9 株乳酸桿菌脂質(zhì)抗氧化能力在活菌懸液與菌體細(xì)胞破碎液中因菌株不同而強(qiáng)弱不同，但菌體發(fā)酵上清液為三者中最低，推斷3 種物質(zhì)脂質(zhì)抗氧化能力因菌株而異。而乳酸桿菌抗氧化性能可能是因其不同且相對獨(dú)立的抗氧化機(jī)制所致。

2.4 主成分分析

圖7A為各個(gè)特性在各主成分中占的載荷分布圖。成分1和2共占總變量的53.48%，第1主成分解釋為活菌懸液還原性、活菌懸液DPPH自由基清除能力、破碎液DPPH自由基清除能力、上清液DPPH自由基清除能力、活菌懸液羥自由基清除能力、上清液超氧陰離子自由基清除能力、活菌懸液脂質(zhì)抗氧化能力及上清液脂質(zhì)抗氧化能力；第2主成分解釋為破碎液還原性、上清液還原性、上清液DPPH自由基清除能力、破碎液羥自由基清除能力、活菌懸液超氧陰離子自由基清除能力、破碎液脂質(zhì)抗氧化能力和黏附性。

圖7B展示了所選益生菌的分布，根據(jù)圖7B和表2可以看出，嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的綜合得分最高為2.48，高于對照菌株，其次為嗜酸乳桿菌KLDS1.1003得分為0.88，明顯高于其他菌株，嗜酸乳桿菌KLDS1.0902的綜合得分最低。該結(jié)果表明嗜酸乳桿菌 KLDS1.0901及嗜酸乳桿菌KLDS1.1003是8 株中具有良好黏附性以及抗氧化特性的益生菌。

圖 7 因子載荷圖（A）和因子得分圖（B）Fig. 7 Factor loading (A) and factor score plots (B)

表 2 各菌株因子得分Table 2 Analysis of factor scores for each strain

2.5 乳酸桿菌胃腸液耐受性

最后篩選出2 株益生功能較好的菌株，對其在模擬胃腸液中的耐受性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。人體胃液的pH值不斷變化，通常保持在pH 3.0左右，通過胃部的時(shí)間大約在1～2 h[31]，本實(shí)驗(yàn)選取胃液pH 3.0。腸液pH值通常為7.6左右，本實(shí)驗(yàn)選取pH 7.0。2 株乳酸桿菌在模擬胃腸液中的耐受性如圖8所示。嗜酸乳桿菌KLDS1.0901與KLDS1.1003在pH 3.0的模擬胃液中3 h后活菌數(shù)雖略有下降，但均可達(dá)108CFU/mL以上。經(jīng)過模擬胃液耐受后再經(jīng)過pH 7.0的模擬腸液3 h后活菌數(shù)同樣有一定程度下降，但仍然可達(dá)108CFU/mL以上。而乳酸桿菌發(fā)揮益生作用的菌體濃度一般為106～109CFU/mL[14]。Matias等[32]研究嗜酸乳桿菌La5可以抵抗體外胃腸道檢測，存活率顯著，成活率超過50%。而本實(shí)驗(yàn)2 株乳酸桿菌經(jīng)過模擬胃液3 h再經(jīng)過模擬腸液3 h后菌體濃度都保持在108CFU/mL，其成活率也可達(dá)50%，可發(fā)揮益生作用，因此具有較好的胃腸液耐受性。

圖 8 嗜酸乳桿菌KLDS1.0901（A）和嗜酸乳桿菌KLDS1.1003（B）模擬胃腸液耐受性Fig. 8 Stimulated gastrointestinal tolerance of L. acidophilus KLDS1.0901 (A) and L. acidophilus KLDS1.1003 (B)

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)以15 株實(shí)驗(yàn)室保藏菌株為研究對象，以乳酸桿菌對HT-29細(xì)胞增殖的抑制、黏附以及抗氧化作用為篩選指標(biāo)，篩選出對結(jié)腸癌細(xì)胞具有抑制效果的益生菌。初篩8 株對HT-29細(xì)胞具有抑制效果的乳酸桿菌。隨后的乳酸桿菌抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，乳酸桿菌活菌懸液、菌體細(xì)胞破碎液及菌體發(fā)酵上清液均具有一定抗氧化性，但不同抗氧化實(shí)驗(yàn)三者效果不同，并且不同菌株對HT-29細(xì)胞的黏附率也有所不同。主成分分析對黏附性以及抗氧化性進(jìn)行綜合評估，結(jié)果表明嗜酸乳桿菌KLDS1.0901的得分最高，嗜酸乳桿菌KLDS1.1003次之，且2 株菌具有良好的耐受性和抑制人體結(jié)腸腺癌細(xì)胞系HT-29細(xì)胞能力。