食管癌患者Pg優(yōu)勢菌株RgpA、B基因克隆表達、單克隆抗體的制備與臨床應(yīng)用

陳耀華　李智濤

【摘 要】目的：探討食管癌患者Pg優(yōu)勢菌株RgpA、B基因克隆表達、單克隆抗體的制備與臨床應(yīng)用效果。方法：將2018年6月-2018年12月我院收治的47例食管癌患者作為食管癌組，并選取235名進行健康大學(xué)生作為正常組，收集其口腔牙齦標(biāo)本，并進行PCR擴增得到牙齦卟啉單胞菌的RgpA與RgpB擴增產(chǎn)物。通過序列分析與同源性分析找出了食管癌患者中RgpA與RgpB基因的高表達菌株。結(jié)果：食管癌組RgpA與的RgpB陽性率明顯高于正常組。結(jié)論：食管癌患者Pg優(yōu)勢菌株RgpA、B基因克隆表達、單克隆抗體的制備在臨床應(yīng)用中具有顯著結(jié)果。

【關(guān)鍵詞】食管癌;RgpA;RgpB

【中圖分類號】R541

【文獻標(biāo)志碼】B

【文章編號】1005-0019（2020）07-007-01

食管癌在我國具有較高的發(fā)病率，對患者的機體健康將會造成嚴(yán)重的不良影響，因此若能夠?qū)ζ溥M行早期有效的篩查，便能夠予以及時有效的治療，從而消除不良癥狀，提升其健康水平[1]。通過臨床研究表明，牙齦卟啉單胞菌與多種消化道、呼吸道腫瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)聯(lián)，同時口腔關(guān)鍵致病菌之一的Pg蛋白數(shù)量異常增加是造成口腔局部微生態(tài)失衡的重要因素之一[2]。本研究正常人口腔內(nèi)細(xì)菌標(biāo)本中Pg菌RgpA、B的基因測序以及之間的序列對比，篩選出食管癌患者牙齦卟啉單胞菌優(yōu)勢菌株 RgpA、B，對其進行基因克隆表達，單克隆抗體的制備，從而以牙齦卟啉單胞菌和食管癌之間的關(guān)系為切入點，研究牙齦卟啉單胞菌特異性RgpA和RgpB基因在食管癌診斷和牙周炎預(yù)防方面的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2018年6月-2018年12月我院收治的47例食管癌患者作為食管癌組，并選取235名進行健康大學(xué)生作為正常組。正常組男186名，女49名，年齡為22-24歲，平均年齡為（23.1±4.9）歲;食管癌組男22例，女25例，年齡為22-28歲，平均年齡為（25.1±5.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：均自愿參加本研究且均獲得家屬的知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有其他惡性腫瘤疾病。

1.2 方法

①通過PCR擴增Pg的RgpA、RgpB基因：

首先處理采集的細(xì)菌標(biāo)本，提取含細(xì)菌基因組的DNA樣本;然后根據(jù)GeneBank 提供的 Pg RgpA、RgpB 序列設(shè)計RgpA、RgpB基因編碼序列的相應(yīng)引物并進行DNA擴增，最后采用瓊脂糖凝膠電泳對擴增的產(chǎn)物進行鑒定。

②核苷酸序列、蛋白質(zhì)序列及抗原表位分析：

將擴增的基因產(chǎn)物直接送公司進行測序，然后通過生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進行分析，找出食管癌患者與正常人中Pg優(yōu)勢菌株的RgpA、RgpB基因和抗原表位。

③RgpA、RgpB基因與相應(yīng)載體的基因重組與克隆表達：

分別挑選食管癌組與正常人組中Pg優(yōu)勢菌株的RgpA、RgpB基因，首先將RgpA、RgpB基因與pET-28a質(zhì)粒進行重組，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化在大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)并誘導(dǎo)表達，最后對獲取的RgpA、RgpB蛋白進行純化。

④單克隆抗體的制備及食管癌診斷試劑盒的研發(fā)：

利用分離純化的RgpA、RgpB蛋白或人工合成的抗原肽作為免疫原，制備單克隆抗體和食管癌診斷試劑盒并研究其應(yīng)用。

⑤RgpA、RgpB蛋白疫苗的制備及療效觀察：

利用純化的RgpA、RgpB蛋白為免疫原制備疫苗，注入小鼠或雞體內(nèi)觀察抗體滴度的變化規(guī)律，檢測制備的多抗或者單抗的體外抗菌實驗，建立Pg感染小鼠牙周炎模型觀察疫苗的攻毒保護作用。

1.5 觀察指標(biāo)

兩組人群中Pg的RgpA和RgpB基因擴增結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料，采用x2檢驗，P<0.05提示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組人群中Pg的RgpA和RgpB基因擴增結(jié)果比較

食管癌組RgpA與的RgpB陽性率明顯高于正常組，見表1。

3 討論

通過相關(guān)的臨床研究顯示[3]，食管癌與牙齦卟啉單胞菌發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)，本研究擬以牙齦卟啉單胞菌為切入點，篩選確定食管癌患者中感染牙齦卟啉單胞菌的優(yōu)勢亞型菌株，根據(jù)其特異的基因及蛋白抗原表位，開發(fā)出針對食管癌患者Pg感染診斷檢測用的單克隆抗體診斷試劑盒。由于牙齦卟啉單胞菌全菌抗原成分復(fù)雜，相應(yīng)抗體可能與宿主其他組織產(chǎn)生免疫交叉反應(yīng)，產(chǎn)生假陽性結(jié)果，因此提取細(xì)菌中具有代表性的特異性抗原才能夠能夠提高診斷效率[4-5]。本研究選取牙齦卟啉單胞菌特異性的rgpA與rgpB基因，通過擴增食管癌患者與健康大學(xué)生中牙齦卟啉單胞菌陽性菌株，之后對rgpA與rgpB基因進行序列測定，然后通過核苷酸序列分析、氨基酸序列分析和模擬抗原表位分析、構(gòu)建遺傳進化樹等，找出食管癌特異性牙齦卟啉單胞菌菌株的rgpA與rgpB基因，構(gòu)建rgpA與rgpB基因的原核表達載體pET-28a/rgpA與pET-28a/rgpB，使其在大腸桿菌中獲得穩(wěn)定、高效表達，后續(xù)實驗以純化的rgpA與rgpB蛋白為抗原，制備rgpA與rgpB蛋白的單克隆抗體，特異性單克隆rgpA與rgpB抗體的獲得可以為制備食管癌診斷相應(yīng)的試劑盒做準(zhǔn)備[4]。依據(jù)結(jié)果顯示，食管癌組RgpA與的RgpB陽性率明顯高于正常組，由此可說明食管癌患者Pg優(yōu)勢菌株RgpA、B基因克隆表達、單克隆抗體的制備在臨床應(yīng)用中具有顯著結(jié)果。但仍然需要加強研究，以獲得更進一步的效果。

參考文獻

[1]黎晶晶，黎珊珊，于艷麗.副溶血弧菌TDH的原核表達及單克隆抗體的制備[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（03）：113-117.

[2]王紅梅，陳曄洲，田晶晶，等.新型腫瘤標(biāo)志物人PF4重組表達、活性鑒定及單克隆抗體制備[J].現(xiàn)代檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（5）：12-16.

[3]趙興旺，劉冉冉，鄭麥青，等.雞髓樣分化因子88的原核表達及單克隆抗體制備[J].生物技術(shù)通訊，2011，22（6）：850-854.

[4]齊明花，徐躍飛，任鳳，張文利.結(jié)核分枝桿菌Rv2673基因過表達對分枝桿菌細(xì)胞壁組分的影響[J].中國病原生物學(xué)雜志，2019，14（03）：257-263.

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[6]Sudo K， Xiao L， Wadhwa R， et al. Importance of surveillance and success of salvage strategies after definitive chemoradiation in patients with esophageal cancer[J]. Journal of Clinical Oncology， 2015， 32（30）：3400-3405.