TUBA1A 基因突變致大腦皮層發(fā)育不良2 例臨床及遺傳學分析

張 潮 黎珍妹 趙紅玲 李 雯 余紅蕾

咸寧市中心醫(yī)院 湖北科技學院附屬第一醫(yī)院兒科（湖北咸寧 437100）

人類大腦皮層的發(fā)育是一個復雜而精密的過程，發(fā)育過程中任何一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題均可以引起發(fā)育落后、智力低下、癲癇發(fā)作等一系列的臨床表現(xiàn)[1]。而神經(jīng)元移行相關基因突變是大腦皮層發(fā)育不良（malformation of cortical development，MCD）的重要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)，Reelin-LIS1-Tubulins信號通路可調控神經(jīng)元移行，該通路上的多個基因異?？蓪е虏煌愋偷腗CD，其中TUBA1A基因編碼微管相關蛋白，該基因突變可導致平滑腦畸形、小頭畸形以及多小腦回畸形等[3-4]。TUBA1A基因變異導致的MCD國內未見報道，現(xiàn)報告2例TUBA1A基因變異導致的MCD患兒的臨床資料，并復習相關文獻，探討其臨床特點。

1 臨床資料

例1，男，1歲3個月，確診癲癇1個月，3天內再次發(fā)作10余次就診?；純?個月前無明顯誘因突發(fā)抽搐，強直陣攣發(fā)作，具體表現(xiàn)為雙眼凝視、口唇面色發(fā)紺，口吐白沫，四肢強直，意識喪失，約1～2分鐘自行緩解，緩解后精神狀態(tài)差?？紤]癲癇給予左乙拉西坦，早晚各1.5 mL(約37.5mg/kg·d)，用藥后無抽搐發(fā)作。3天前患兒再次出現(xiàn)抽搐，3～5次/d，發(fā)作表現(xiàn)與之前類似，門診以癲癇收入院?；純簽镚2P2，足月剖宮產(chǎn)，出生體質量3.1 kg?；純赫w發(fā)育落后，獨站不穩(wěn)，精細動作明顯落后同齡兒童。入院體格檢查：面容無異常，神志清楚，頸軟，呼吸運動對稱，心臟各聽診區(qū)未聞及雜音，肌張力偏低，布氏征陰性。實驗室檢查：血常規(guī)、肝腎功能均未見異常，血氨基酸代謝物未見明顯異常。腦電圖示有癲癇波發(fā)放。頭顱磁共振成像（MRI）示神經(jīng)元移行障礙（平滑腦、巨腦回）。見圖1?；純撼鲈汉箅S訪暫未出現(xiàn)癲癇發(fā)作。

例2，女，6月齡，因間斷抽搐3天入院?；純簾o明顯誘因出現(xiàn)抽搐，表現(xiàn)為突然點頭、上肢內收，成串發(fā)作；四肢無明顯抖動及強直，口唇面色無明顯異常，癥狀持續(xù)數(shù)秒至2分鐘左右，無發(fā)熱、無吐瀉?；純簽镚2P1，足月剖宮產(chǎn)，出生體質量3.4 kg，發(fā)育無明顯異常，無特殊疾病史，無類似疾病家族史。入院體格檢查：面容無異常、神志清楚、全身皮膚未見皮疹；雙肺呼吸音稍粗，未聞及干濕性啰音；心率齊，未聞及病理性雜音；腹部無異常；四肢未見異常且活動不受限，肌張力無異常，四肢肌力四級，布氏征及巴氏征陰性。腦電圖示異常幼兒腦電圖，高度失律并檢測到孤立或成串痙攣發(fā)作。MRI示雙側額頂葉巨腦回畸形（圖1）?；純喝朐汉笥杩诜滋┘伴_普蘭治療，未見好轉；隨后加抗癲癇藥物德巴金并予以靜脈滴注ACTH一周（因肺炎停用），之后2 個月偶有發(fā)作。目前患兒使用潑尼松龍治療，抗癲癇藥物為丙戊酸鈉早晚4 mL，約30mg/（kg·d）；托吡酯早晚各12.5 mg，定期隨訪中。

為進一步明確診斷及尋找病因，經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審核及家屬知情同意后，分別采集患兒及家屬的外周靜脈血各2 mL，利用全血基因組DNA提取試劑盒（天根生物）提取基因組DNA，委托第三方公司進行全外顯子測序，并利用Sanger測序驗證。致病基因TUBA1A的引物由上海生工合成。經(jīng)過高通量測序以及Sanger 測序驗證后發(fā)現(xiàn)，例1 的TUBA1A基因存在c.387 C＞A 雜合突變，該突變導致該基因編碼的蛋白第129 位氨基酸由半胱氨酸突變?yōu)榻K止密碼子（p.C 129 X）；患兒父母該位點未見異常，見圖2。例2的TUBA1A基因存在c.848 A＞G 雜合突變，該突變導致該基因編碼的蛋白第283位氨基酸由組氨酸突變?yōu)榫彼幔╬.H283R），患兒父母該位點未見異常，見圖2。

圖1 患兒頭顱MRI 表現(xiàn)

圖2 2 例患兒TUBA1A 基因測序圖

2例患兒TUBA1A基因存在的2種突變，c.387C＞A和c.848 A＞G 均未見報道。其中c.387 C＞A 為無義突變，依據(jù)ACMG指南為致病性改變（PVS1，LOF變異可能導致基因功能喪失；PS2：新發(fā)突變，無家族史；PM1：數(shù)據(jù)庫未收錄，屬于低頻變異）。c.848A＞G為錯義突變，Polyphen2及SIFT軟件預測突變影響蛋白質的功能不同物種間蛋白序列保守性分析發(fā)現(xiàn)該位點十分保守，見圖3。依據(jù)ACMG 指南該突變?yōu)榭赡苤虏⊥蛔儯≒S2：雙親驗證的新發(fā)突變；PM2：EXaC及其他人群數(shù)據(jù)庫未見收錄；PP3多種軟件預測有害）。

取患者新鮮靜脈血1 mL，裂解紅細胞后得到白細胞，利用Trizol 方法提取總RNA，經(jīng)過反轉錄得到cDNA，利用TUBA1A基因特異性生物引物進行相對定量分析，結果顯示相對于正常對照，例1的TUBA1A基因表達水平顯著下降，例2表達水平未見明顯異常，見圖4。

圖3 突變位點在蛋白結構中的位置以及c.848A＞G（p.H283R)保守性分析

圖4 患兒及同齡健康兒童靜脈血中TUBA1A 基因mRNA 水平

2 討論

人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常發(fā)揮功能需要腦發(fā)育早期的兩個重要的事件：神經(jīng)元干細胞的生長分化以及特定的神經(jīng)元在特定的時間內移行到目的區(qū)域并彼此交聯(lián)發(fā)揮正常功能[5]。腦皮層的多層結構就是神經(jīng)元正常移行形成的，否則會導致腦皮質發(fā)育畸形[6]。神經(jīng)元移行相關基因變異是導致大腦皮層發(fā)育不良的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，LIS1基因以及DCX基因異常可導致經(jīng)典型的平滑腦畸形，ARX基因突變可導致X連鎖平滑腦畸形伴生殖器異常；FLNA以及ARGEF2基因缺陷可導致腦室周圍灰質異位以及可調控神經(jīng)元移行的Reelin-LIS1-Tubulins信號通路上的多種基因突變可導致MCD[1,7-9]。

本組2 例患兒均以間斷抽搐入院治療，面容均未見異常，入院后生化檢測未見明顯異常，血氨基酸代謝未見異常。2 例患兒的腦電圖均存在異常，高度失率或者癲癇波發(fā)放。例1 頭顱MRI 提示平滑腦、巨腦回畸形，例2 頭顱MRI 示雙側額頂葉巨腦回畸形；均存在MCD的癥狀。全外顯子測序分析發(fā)現(xiàn)，2例患兒TUBA1A基因均存在變異，例1為無義突變（p.C129X），導致編碼的蛋白質提前終止而不能行使正常功能；例2為錯義突變（p.H283R），因TUBA1A蛋白在不同物種間十分保守，推測變異影響蛋白的正常功能。

TUBA1A基因位于12 號染色體q 13.12 區(qū)域，全長4530 bp，編碼含有451 個氨基酸的α 微管蛋白，該蛋白分為三個結構域，分別為N 端結構域、中間以及C 端結構域[10]。所有真核生物中都有α、β 和γ微管蛋白家族的基因，α 和β 微管蛋白是微管的主要成分。近年發(fā)現(xiàn)，越來越多的微管相關的基因（如TUBA1A、TUBA8、TUBB2A、TUBB3、TUBB、TUBB2B等）可導致微管疾病，該類疾病臨床表現(xiàn)為巨腦回畸形、多小腦回畸形、胼胝體發(fā)育不良、小頭畸形、智力低下等一系列癥狀[11-13]。

文獻報道，超過95%的TUBA1A基因突變患者有大腦皮層發(fā)育異常的特征，其中約70% 患者為無腦回/巨腦回畸形，約18%存在多小腦回畸形癥狀。進一步分析發(fā)現(xiàn)TUBA1A基因異?？赡芘c基底節(jié)、胼胝體以及小腦蚓部異常相關[14]。TUBA1A基因異常導致患者的臨床表型多樣：超過90%的患者存在全面發(fā)育遲緩，約70%存在小頭畸形、70%存在不同類型的癲癇發(fā)作，約40%肌張力減退，此外少數(shù)存在面容異常、斜視、眼球震顫以及視神經(jīng)發(fā)育不全等[14]。本組2例患兒存在MCD、癲癇以及發(fā)育落后等與國外報道一致。

進一步檢索文獻及數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，目前共計收錄TUBA1A基因121 個突變，絕大多數(shù)為錯義突變，其中第420（R402）位以及264（R264）位氨基酸為熱點突變位置，20%以上的患者可檢測到以上兩個熱點突變[14-15]。在TUBA1A蛋白的三維結構模型中發(fā)現(xiàn)，約40%的致病性突變影響蛋白與其他微管相關蛋白之間或者動力蛋白之間的結合作用。本組例1患兒存在無義突變（p.C 129 X），導致氨基酸編碼提前終止，定量PCR 顯示TUBA1A的RNA 水平明顯降低，推測變異影響蛋白表達量，進而影響功能。例2 攜帶錯義突變（p.H283R），雖變異未影響mRNA水平，推測變異的蛋白與其他微管蛋白的結合作用變弱，進而導致臨床表型。遺憾的是，本組2例患兒未檢測TUBA1A蛋白的表達水平；未在細胞水平進一步證實突變對TUBA1A蛋白功能的影響。

綜上所述，TUBA1A基因突變導致一系列臨床表型，包括大腦結構發(fā)育異常、整體發(fā)育落后，癲癇發(fā)作、肌張力異常以及面容、視力異常等，臨床診斷較為困難。本組2 例TUBA1A基因異常導致MCD 患兒經(jīng)分子診斷確診，且這2 個變異尚未見報道，豐富了TUBAIA基因突變數(shù)據(jù)庫。