馮 煒，史勁松

江南大學 藥學院，無錫 214122

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是重要的促血管生長因素，可提高血管的通透性[1]，是誘導腫瘤血管形成的作用最強、特異性最高的血管生長因子[2]。因此，抑制血管內皮生長因子可以抑制腫瘤的生長[3]?？筕EGF治療的第一代藥物是諾華公司的Lucentis和羅氏公司的Avastin，前者價格昂貴，而后者價格低廉，在很多國家作為非標簽用藥，市場巨大[3, 4]。抗VEGF治療的第二代藥物是德國拜耳的Eylea和我國成都康弘生物科技有限公司的朗沐，此類藥物是一種融合蛋白，可以與VEGF競爭性結合VEGF受體，抑制VEGF產生作用，作用比第一代的抗VEGF藥物更強。Eylea目前在海外市場已經占據相當大的市場份額，而朗沐在我國已開始臨床三期試驗，表現出顯著的治療效果[5-8]。然而，前兩代抗VEGF治療的藥物都只適用于眼底病治療的藥物，應用范圍受到很大的限制。近年來，單克隆抗體類藥物發(fā)展迅猛，已被廣泛用于惡性腫瘤、免疫學疾病和罕見病等多個適應癥的治療[9]，目前已有超過300種單克隆抗體藥物處于臨床試驗階段[10]。與第一代和第二代抗VEGF藥物相比，抗VEGF單克隆抗體的應用范圍更加廣泛。本研究利用已經構建好的中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)細胞株表達抗VEGF人源化單克隆抗體(VEGF-MA)，并對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，以期獲得更高的目的蛋白產量。

1 材料與方法

1.1 細胞株

本研究所用細胞株為重組CHO細胞。目的產物為VEGF-MA，93%的序列為人源，7%的序列為鼠源(位于可變區(qū)的互補決定區(qū)CDR)，每個輕鏈由214個氨基酸組成，每個重鏈由453個氨基酸組成，相對分子量為149 000。

1.2 培養(yǎng)基

(1) 基礎培養(yǎng)基：本研究選取14種基礎培養(yǎng)基，編號以及濃度如表1所示。

表1 基礎培養(yǎng)基

(2) 補料培養(yǎng)基：本研究選取10種補料培養(yǎng)基，編號以及濃度如表2所示。

表2 補料培養(yǎng)基

(3) 外源添加物：本研究選取7種能夠促進VEGF-MA表達的外源添加物，為方便添加，將其配制成溶液，溶液濃度以及編號如表3所示。

表3 外源添加物

1.3 細胞培養(yǎng)

1.3.1細胞復蘇及搖瓶擴增

從液氮罐中取出凍存細胞37 ℃水浴解凍，將解凍后的凍存液轉入裝有8.5 mL CD CHO培養(yǎng)基的離心管中，充分混勻，1 000 r/min離心5 min，棄去上清。將細胞沉淀重新懸浮于5 mL CD CHO培養(yǎng)基中，以0.30×106個/mL～0.90×106個/mL的密度接種于裝有25 mL CD CHO培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。將三角瓶置于CO2搖床中培養(yǎng)，CO2濃度、溫度和轉速分別為6%、36.5 ℃和130 r/min。每三天對搖瓶中的細胞計數一次，按(0.4×106～0.6×106)個/mL的密度接種至新鮮培養(yǎng)基，逐級傳代擴增至0.25 L～2 L搖瓶中。

1.3.2搖瓶培養(yǎng)

用基礎培養(yǎng)基將細胞按一定的接種細胞密度接入250 mL擋板搖瓶中，接種體積80 mL，搖床培養(yǎng)參數為：6% CO2，36.5 ℃，130 r/min。其他工藝參數按照實驗設計進行設定。按相關實驗方案進行補料，補料體積為初始培養(yǎng)重量的4%，外源添加物體積為初始培養(yǎng)重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時，添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據通氣產生的泡沫情況，適量添加消泡劑。

1.3.33 L發(fā)酵罐培養(yǎng)

用基礎培養(yǎng)基將搖瓶種子細胞按一定比例稀釋至接種細胞密度設定值，接入3 L發(fā)酵罐，發(fā)酵罐初始培養(yǎng)體積1.0 L。設置發(fā)酵罐攪拌轉速為280 r/min，DO設定值為40%，與O2通氣量進行關聯控制，氧氣通氣流量范圍為(0～500) mL/min，根據活細胞密度調整空氣流量設定值，空氣流量控制范圍為(10～100) mL/min。其他工藝參數按照實驗設計進行設定。pH通過添加通碳酸氫鈉溶液和CO2進行關聯調節(jié)。每天取樣檢測活細胞密度、細胞活率，第3 d、5 d、7 d、9 d、11 d補料，補料體積為初始培養(yǎng)重量的4%，外源添加物體積為初始培養(yǎng)重量的1%。葡萄糖濃度低于2.0 g/L時，添加200 g/L的葡萄糖溶液將葡萄糖濃度提高至4.0 g/L。根據通氣產生的泡沫情況，適量添加消泡劑。

1.4 檢測方法

1.4.1VEGF-MA濃度檢測

VEGF-MA濃度檢測方法見參考文獻[11]。

1.4.2VEGF-MA純化

VEGF-MA純化方法見參考文獻[12,13]。

1.4.3糖基化水平檢測

糖基化水平檢測方法見參考文獻[14-16]。

1.4.4蛋白純度檢測

蛋白純度檢測方法見參考文獻[14-16]。

1.4.5電荷異質性檢測

電荷異質性檢測方法見參考文獻[14-16]。

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1基礎培養(yǎng)基優(yōu)化

首先選取14種細胞培養(yǎng)中常用的基礎培養(yǎng)基，種類如表1所示。分別在不同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO細胞，考察抗VEGF抗體的生產性能，目的在于選擇最優(yōu)的基礎培養(yǎng)基。目的蛋白產量是體現生產性能的主要指標，在上述14種基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)CHO細胞7 d后，發(fā)酵液中的VEGF-MA濃度如圖1所示。從中可以看出，最優(yōu)的批次所使用的基礎培養(yǎng)基為5#，VEGF-MA的產量為0.70 g/L。此外，使用7#、9#和11#三種基礎培養(yǎng)基時，也可以獲得較高的目的蛋白產量(0.60 g/L以上)。除目的蛋白產量外，目的產物質量也是體現生產性能的重要指標。目的產物質量可以依靠其電荷異質性、糖基化組分和蛋白純度三個指標判斷。通常情況下，電荷異質性≤35.0%、糖基化組分處于50.0%～60.0%之間以及蛋白純度≥85.0%的目的產物被認為質量合格。在上述14個批次結束時刻的發(fā)酵液中分離純化抗VEGF抗體，測定其電荷異質性、糖基化組分和蛋白純度，結果如表4所示?？梢钥闯觯?#基礎培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA質量較高。綜合目的產物產量及質量，選用5#培養(yǎng)基，即ActiCHO P Powder CD，作為后續(xù)研究中所用的基礎培養(yǎng)基。

2.1.2補料培養(yǎng)基優(yōu)化

選取如表2所示的10種補料培養(yǎng)基，在使用ActiCHO P Powder CD基礎培養(yǎng)基的條件下，按照1.3.2小節(jié)所述的方法進行補料操作，以篩選最優(yōu)的補料培養(yǎng)基。培養(yǎng)14 d后，細胞培養(yǎng)液中的VEGF-MA產量和質量分別如圖2和表5所示。綜合考慮VEGF-MA的產量和質量，選取8#補料培養(yǎng)基，即CD Efficient Feed C AG，作為后續(xù)研究中使用的補料培養(yǎng)基。補加CD Efficient Feed C AG后，對目的產物質量影響不明顯，且VEGF-MA的產量達到2.55 g/L。

圖1 不同基礎培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA產量

圖2 添加不同補料培養(yǎng)基條件下的VEGF-MA產量

表4 不同基礎培養(yǎng)基下的VEGF-MA質量

表5 添加不同補料培養(yǎng)條件基下的VEGF-MA質量

2.1.3外源添加物優(yōu)化

選取如表3所示的7種外源添加物，考察在補加不同外源添加物條件下VEGF-MA的生產性能。在使用ActiCHO P Powder CD基礎培養(yǎng)基和CD Efficient Feed C AG補料培養(yǎng)基的條件下，培養(yǎng)14 d后，細胞培養(yǎng)液中的VEGF-MA產量和質量分別如圖3和表6所示。從中可以看出，添加各種外源添加物條件下，VEGF-MA產量均有不同程度的提高。綜合考慮VEGF-MA的產量和質量，選取1#外源添加物，即Sheff-CHO Plus PF ACF。添加該物質后，對目的產物質量影響不明顯，且VEGF-MA產量由2.54 g/L提高至3.20 g/L。

表6 補加不同外源添加物條件下的VEGF-MA質量

圖3 補加不同外源添加物條件下的VEGF-MA產量

2.2 3 L發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.2.1接種密度優(yōu)化

將上述研究中所獲得的培養(yǎng)基組合用于3 L發(fā)酵罐中培養(yǎng)CHO細胞生產VEGF-MA的過程，即使用ActiCHO P Powder CD基礎培養(yǎng)基CD Efficient Feed C AG補料培養(yǎng)基，并添加Sheff-CHO Plus PF ACF。共進行三個批次的發(fā)酵實驗，培養(yǎng)14 d后VEGF-MA產量均在3.20 g/L左右(圖4)，且VEGF-MA電荷異質性、糖基化水平和蛋白純度均達到質量標準(表7)。在后續(xù)的研究中，將以這三個批次作為對照，在3 L發(fā)酵罐中對接種密度、pH、溶解氧濃度(DO)、前期培養(yǎng)溫度和后期培養(yǎng)溫度做進一步優(yōu)化。

圖4 最優(yōu)培養(yǎng)基配比條件下的VEGF-MA產量

表7 最優(yōu)培養(yǎng)基配比條件下的VEGF-MA質量

首先優(yōu)化接種密度，分別考察0.7×106個/mL、1.0×106個/mL和1.3×106個/mL三個接種密度條件下的VEGF-MA生產性能，VEGF-MA產量和質量和分別如圖5和表8所示。可以看出接種密度對VEGF-MA產量、電荷 異質性、糖基化水平和VEGF-MA純度均沒有顯著影響。因此，在后續(xù)研究中，仍然使用1.0×106個/mL的接種密度。

圖5 不同接種密度條件下的VEGF-MA產量

表8 不同接種密度條件下的VEGF-MA質量

2.2.2pH優(yōu)化

對細胞培養(yǎng)過程中的pH進行優(yōu)化，分別考察pH設定為7.00(對照)、7.10和7.15條件下的VEGF-MA生產性能，VEGF-MA產量和質量和分別如圖6和表9所示。pH設定為7.10時VEGF-MA產量最高，達到表達量3.70 g/L。此時的電荷異質性、糖基化水平和VEGF-MA均處在標準的范圍內。因此，在后續(xù)的研究中都將選用7.10作為pH的設定值。

圖6 不同pH條件下的VEGF-MA產量

表9 不同pH條件下的VEGF-MA質量

2.2.3DO優(yōu)化

對細胞培養(yǎng)過程中的DO進行優(yōu)化，分別考察DO為20%(對照)、40%和80%條件下的VEGF-MA生產性能，VEGF-MA產量和質量和分別如圖7和表10所示。從中可以看出，DO對VEGF-MA產量、蛋白異質性和糖基化水平并無顯著影響，但DO為40%時VEGF-MA純度最高。因此，在后續(xù)的研究中，均使用40%的DO水平。

圖7 不同DO條件下的VEGF-MA產量

表10 不同DO條件下的VEGF-MA質量

2.2.4前期培養(yǎng)溫度優(yōu)化

在培養(yǎng)CHO細胞表達目的蛋白的過程中，培養(yǎng)前期通常采用較高的溫度，而在培養(yǎng)后期適當降溫，本研究首先對培養(yǎng)前期的溫度進行優(yōu)化?？疾炫囵B(yǎng)前期溫度分別為36.0 ℃(對照)、36.5 ℃和37.0 ℃條件下VEGF-MA的生產性能，結果如圖8和表11所示。36.5 ℃條件下，VEGF-MA濃度和純度分別為3.26 g/L和96.6%，均高于其他兩個批次。因此，在后續(xù)的研究中將繼續(xù)采用36.5 ℃的前期培養(yǎng)溫度。

圖8 不同前期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA產量

表11 不同前期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA質量

2.2.5后期培養(yǎng)溫度優(yōu)化

對培養(yǎng)后期的溫度進行優(yōu)化?？疾炫囵B(yǎng)后期溫度分別為32.0 ℃、33.0 ℃(對照)和34.0 ℃條件下VEGF-MA的生產性能，結果如圖9和表12所示。后期培養(yǎng)溫度為34.0 ℃時能夠獲得最高的VEGF-MA產量(4.10 g/L)，而此時的VEGF-MA質量也能達到標準。因此可以確定，最佳的后期培養(yǎng)溫度為34.0 ℃。

圖9 不同后期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA產量

表12 不同后期培養(yǎng)溫度條件下的VEGF-MA質量

3 結論

(1) 培養(yǎng)重組CHO細胞生產VEGF-MA的最優(yōu)基礎培養(yǎng)基、補料培養(yǎng)基和外源添加物分別為ActiCHO P Powder CD、CD Efficient Feed C AG和Sheff-CHO Plus PF ACF。在此條件下的VEGF-MA的產量為3.20 g/L。

(2) 3 L發(fā)酵罐下的最優(yōu)培養(yǎng)條件：接種密度為1.0×106個/mL、pH為 7.10、溶解氧濃度為40%、前期培養(yǎng)溫度為36.5 ℃、后期培養(yǎng)溫度為34 ℃。在此條件下VEGF-MA的產量能夠達到4.10 g/L的較高水平，且VEGF-MA質量較高。