費(fèi) 蘇，夏永軍，艾連中，王光強(qiáng)

上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院， 上海食品微生物工程技術(shù)研究中心

乳酸菌在動物胃腸道內(nèi)是一種被普遍認(rèn)可的優(yōu)勢菌。隨著目前動物生長及疾病預(yù)防和治療過程中乳酸菌的大量使用，乳酸菌在腸道定殖方面，有著巨大的推廣和應(yīng)用價值[1]。因此其研究價值也日益突出。

黏附定殖是評價乳酸菌在動物腸道內(nèi)發(fā)揮益生作用的重要指標(biāo)之一。乳酸菌通過黏附作用定殖于腸道黏液層與其上皮細(xì)胞，增強(qiáng)腸道黏膜的防御功能，促進(jìn)自身菌群定殖[2], 調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)[3,4]。

乳酸菌的定殖效果易受多種因素影響，因此，了解乳酸菌黏附定殖的相關(guān)因子，研究其在腸道內(nèi)定殖的生理效應(yīng)，分析各類影響因子對其黏附定殖的作用，對深入發(fā)揮乳酸菌在腸道內(nèi)定殖的益生性能有所幫助。

1 黏附相關(guān)的分子基礎(chǔ)研究

1.1 乳酸菌表面黏附因子

乳酸菌表面有單層表面蛋白(s-層蛋白)、脂磷壁酸(LTA)、肽聚糖(WPG)等與黏附相關(guān)的因子(表1)，都參與了乳酸菌的定殖過程。

1.1.1s-層蛋白

乳酸菌表面包括單一蛋白和糖基化或磷酸化的蛋白，具有相當(dāng)規(guī)則的晶體排列形狀，附著于乳酸菌的表面維持細(xì)胞的形態(tài)。s-層蛋白是排列有序、結(jié)構(gòu)對稱且穩(wěn)定的單體晶體，可以提供外來酶的結(jié)合結(jié)構(gòu)、還能夠附著于宿主腸道的上皮細(xì)胞[5]。為了進(jìn)一步了解s-層蛋白的黏附作用，去除或破壞s-層蛋白，再評估乳酸菌在腸道上皮細(xì)胞的黏附作用，細(xì)菌細(xì)胞的黏附作用會明顯降低，在干酪乳桿菌J5 (L.caseiJ5)，鼠李糖乳桿菌F0533 (L.rhamnosusF0533)，鼠李糖乳桿菌IN4125 (L.rhamnosusIN4125)，副干酪乳桿菌M7 (L.paracaseiM7) 和干酪乳桿菌G15 (L.caseiG15 ) 去除s-層蛋白的情況下，黏附性分別降低了90%、44%、91%、92%和89%[6]。這表明，s-層蛋白在乳酸菌定殖過程中起著至關(guān)重要的作用。 已有研究表明，s-層蛋白具有高含量的疏水性氨基酸和較高的等電點(diǎn)(PI值為9.35～10.4)，這一特征在乳酸桿菌中普遍存在[7,8]。疏水性氨基酸有利于細(xì)菌細(xì)胞的自我凝集，在腸上皮細(xì)胞形成凝集狀態(tài)細(xì)菌，能夠有效阻止有害菌的定植與繁殖[9,10]。

1.1.2脂磷壁酸

脂磷壁酸(LTA)與壁磷壁酸(WTA)統(tǒng)稱為磷壁酸，是乳酸菌細(xì)胞壁的重要組成部分。其中脂磷壁酸是磷壁酸通過共價鍵作用結(jié)合在細(xì)胞膜上形成的。LTA為乳酸菌細(xì)胞表面的疏水性也作出了貢獻(xiàn)，促進(jìn)乳酸菌的非特異性黏附[11]。LTA低等電點(diǎn)的特性，使乳酸菌表面的負(fù)電荷較多，產(chǎn)生靜電引力，使其黏附于腸上皮細(xì)胞。Granato[12]等發(fā)現(xiàn)從約氏乳桿菌La1(LactobacillusjohnsoniiLa1)中提取的LTA確定為細(xì)胞的黏附因子，能夠抑制致病菌對Caco-2細(xì)胞的黏附作用。

1.1.3完整肽聚糖(WPG)與多糖(PS)

胞外多糖由乳酸菌分泌，化學(xué)結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，與肽聚糖組成的完整肽聚糖，保持細(xì)胞壁的完整結(jié)構(gòu)[13]。胞外多糖的存在可以阻止致病菌的黏附因子發(fā)揮作用，阻礙致病菌凝集，從而達(dá)到抑制其他細(xì)胞定殖的目的[14]。這足以說明，胞外多糖在乳酸菌和致病菌的定殖競爭過程中，起著不可忽視的調(diào)節(jié)作用。LEBEER[15]等發(fā)現(xiàn)在腸道內(nèi)鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG)產(chǎn)生的胞外多糖能為機(jī)體的先天免疫形成保護(hù)屏障，使其能在腸道內(nèi)黏附。鄧一平[16]等研究雙歧桿菌及表面分子脂磷壁酸 (Lipoteichoic acid, LTA)、完整肽聚糖 (Whole peptidoglycan WPG)、多糖 (Polysaccharide, PS)對豬胃黏膜糖蛋白的黏附作用，結(jié)果表明 LTA、WPG的粘附作用明顯, PS粘附作用很弱。粘附隨著菌液濃度的增高而增強(qiáng)。

1.2 黏附受體及特異性

乳酸菌在腸道內(nèi)黏附定殖一般分為兩個階段，首先是菌體聚集吸附在腸上皮細(xì)胞表面，是物理層面的吸附作用，是一類可逆的過程，稱為非特異性結(jié)合。后者是乳酸菌與腸上皮細(xì)胞之間的特異性結(jié)合，涉及黏附因子及宿主細(xì)胞的黏附受體。定殖過程中黏附因子和黏附受體的結(jié)合具有特異性，即不同的黏附受體只接受特定的黏附因子，只有兩者結(jié)合，黏附才算完成，而這一部分主要依賴表面蛋白[17]。

研究表明，菌體表面及腸道上皮細(xì)胞的表面均有一層黏液，厚度分別為110 μm和550 μm左右。該黏液層是菌體與腸體最先接觸的部分[18]。在回腸切開術(shù)所得的糖蛋白的實(shí)驗(yàn)中[19]，測定益生菌潛在的黏附性，結(jié)果表明益生菌未能明顯降解腸黏液，黏液中的糖蛋白可作為黏附受體進(jìn)行進(jìn)一步的研究。在利用嗜酸乳桿菌探究鯉魚、草雞、新西蘭兔及昆明鼠腸道黏液中能與菌體表面蛋白發(fā)生作用的黏液蛋白的研究中[20]，新西蘭兔和昆明鼠腸黏液中蛋白相對分子量分別為35 000和55 000為菌體s-層蛋白的黏附受體。而鯉魚及草雞腸道黏液中蛋白與s-層蛋白不存在特異性相互作用，說明黏附受體蛋白隨物種不同而產(chǎn)生變化。

表1 乳酸菌中與黏附相關(guān)的黏附因子

2 常用黏附能力評估模型

2.1 體外細(xì)胞黏附模型

該模型是目前使用最為廣泛的一種評價手段。通過腸上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)，測定乳酸菌的黏附能力。具有便捷、快速等優(yōu)勢，主要以CaCo-2、HT-29和IPEC-J2等腸上皮細(xì)胞為主[21-25]。在篩選乳制品丙酸乳桿菌黏附特性的研究中，嗜酸乳桿菌MJLA1和乳酸雙歧桿菌BDBB2對C2BBe1細(xì)胞的黏附能力與CaCo-2細(xì)胞相似[26]。LAPARRA[27]等評估腸道菌對腸上皮細(xì)胞體外模型的黏附能力，實(shí)驗(yàn)表明腸道中的益生菌如鼠李糖乳桿菌GG(LactobacillusrhamnosusGG) 和動物雙歧桿菌乳酸亞種Bb12(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactisBb12) 、潛在的致病菌大腸桿菌(E.coli) 和單核細(xì)胞增生李斯特菌(L.monocytogenes) 等對HT29-MTX及CaCo-2都體現(xiàn)了明顯的黏附。GAGNON[28]等采用CaCo-2 細(xì)胞黏附模型篩選出了能抑制腸出血性大腸桿菌的人源性雙歧桿菌。體外細(xì)胞黏附模型雖然可以直觀得出菌體的黏附情況，但與動物腸道環(huán)境相差較大，腸上皮細(xì)胞的黏液層作用不能體現(xiàn)，因此還需要其他評估模型進(jìn)行協(xié)助研究。

2.2 黏液蛋白黏附模型

乳酸菌在動物腸道內(nèi)，首先與腸上皮細(xì)胞的黏液層接觸，實(shí)現(xiàn)黏附。因此宿主的腸上皮細(xì)胞表面的黏液蛋白也可作為黏附模型基礎(chǔ)，反應(yīng)乳酸菌在動物腸道內(nèi)的黏附能力。

在早期的相關(guān)研究中，KIRJAVAINEN等[29]利用人類糞便及腸道，獲取了腸黏液蛋白，并以此建立了黏液蛋白黏附模型，為后續(xù)研究提供有力參考。CHATTERJEE[30]等人采用了體外黏液蛋白黏附模型探索發(fā)酵乳桿菌表面的結(jié)合蛋白(MucBP)及其對病原菌黏附抑制作用。在實(shí)際運(yùn)用中，動物腸道黏液蛋白也被用于黏附模型，并能較好的反應(yīng)乳酸菌黏附情況以及其對致病菌的抑制作用[31,32]。該模型的黏液蛋白由宿主提供，可以有效的證實(shí)菌體在該類型是否黏附，但也存在不能完全反應(yīng)宿主腸道環(huán)境的局限性。

3 黏附的影響因素

3.1 pH

現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乳酸菌黏附于腸上皮細(xì)胞，就必須適應(yīng)腸道不同部位的pH值的影響。乳酸菌無論對CaCo-2細(xì)胞還是對粘液的黏附，都存在pH依賴性[33]。例如， GRANATO D[34]等人利用重組La1 Ef-Tu蛋白，確定約氏乳酸桿菌NCC533(LactobacillusjohnsoniiNCC533)與腸細(xì)胞和粘蛋白的結(jié)合是依賴于酸堿度的。GREENE[35]的研究顯示，低pH對CaCo-2細(xì)胞自身產(chǎn)生影響，并顯著提升乳酸桿菌對CaCo-2細(xì)胞的黏附能力。在探究青春型雙歧桿菌對大鼠腸上皮細(xì)胞株IEC-6黏附的相關(guān)因素的研究中[36]，結(jié)果顯示，菌體黏附能力隨著環(huán)境pH的降低而增強(qiáng)，當(dāng)pH由7.4下降至4.0時，雙歧桿菌黏附數(shù)也由最初的298±27升高至713±44。這表明酸性環(huán)境下，乳酸菌能夠更好地黏附定殖。

3.2 表面疏水性

乳酸菌的表面蛋白具有一定的疏水性，在黏附過程中起著重要的作用。在VADILLO-RODRGUEZ[37]的研究中，嗜酸乳桿菌ATCC4356(L.acidophilusATCC4356)和干酪乳桿菌ATCC393(L.caseiATCC393)的疏水性與其黏附能力具有相關(guān)性，但也受黏附環(huán)境的離子強(qiáng)度影響。SHAKIROVA[38]在研究益生性乳酸雙歧桿菌Bb12 (BifidobacteriumlactisBb12) 和嗜酸乳桿菌La5 (LactobacillusacidophilusLa5)的表面疏水性時發(fā)現(xiàn)，疏水性可作為菌體表面特性，可預(yù)測益生性乳酸菌對環(huán)境的耐受力，反應(yīng)其黏附特性。劉東方等人[39]的研究顯示，菌株LV108、N4和XJH301的表面疏水性較高，分別為54%、47%、44%，對應(yīng)的黏附菌體數(shù)均超過14個/細(xì)胞，與同期其他菌株相比，黏附數(shù)明顯升高，這表明高黏附性的乳酸菌其表面疏水性明顯高于其他菌株。

3.3 鈣離子濃度

目前已有的研究成果表明，鈣離子濃度能夠影響乳酸菌對腸上皮細(xì)胞的黏附過程。蔣建軍等[40]在探究影響乳酸菌腸道定殖的不同因素時，表明當(dāng)Ca2+濃度為2 mmol /L時，乳酸菌在豬腸上皮細(xì)胞中定殖效果最佳。葉桂安[41]利用鈣熒光探針法，比較益生菌雙歧桿菌及致病性大腸桿菌對體外腸上皮細(xì)胞Lovo細(xì)胞株黏附時，Ca2+信號傳遞機(jī)制的差異性。結(jié)果表明雙歧桿菌黏附導(dǎo)致的Lovo細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度梯度升高與時間呈正相關(guān)，這一結(jié)果是因?yàn)榧?xì)胞外的Ca2+內(nèi)流，可作為益生菌與腸上皮細(xì)胞良好共生的基礎(chǔ)。通過向缺乏鈣離子的乳酸菌中添加鈣離子，觀察其黏附功能的改變。結(jié)果顯示，植物乳桿菌Q47 (L.plantarumQ47 )、約氏乳桿菌NCC 533 (L.johnsoniiNCC 533)和羅伊氏乳桿菌DSM 12246 (L.reuteriDSM 12246) 等黏附能力明顯提升[42]。

4 結(jié) 語

乳酸菌的黏附是實(shí)現(xiàn)其在腸道定殖的基礎(chǔ)，也是評價該乳酸菌能否成為優(yōu)勢菌、充分發(fā)揮益生菌功能的關(guān)鍵。乳酸菌在腸上皮細(xì)胞的定殖黏附機(jī)制，與乳酸菌自身?xiàng)l件、腸道環(huán)境等因素存在復(fù)雜關(guān)聯(lián)。目前已有的體外黏附評估模型可以很好的促進(jìn)定殖黏附方面的研究深入，我們可依據(jù)黏附機(jī)制，通過物理化學(xué)等方式改善腸道環(huán)境促進(jìn)乳酸菌的定殖黏附，為促進(jìn)動物腸道微生態(tài)健康、改善機(jī)體機(jī)能提供研究基礎(chǔ)。