冉雯儀，項(xiàng) 琦，潘云云，姚長(zhǎng)洪，張永奎

四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，四川成都 610065

微藻是一類(lèi)廣泛存在于海洋和陸地上的、低等的、可利用光合作用的藻類(lèi)微生物總稱(chēng)[1]。微藻通過(guò)光合作用固定CO2生產(chǎn)各種細(xì)胞內(nèi)代謝物如淀粉(碳水化合物)，脂質(zhì)和蛋白，并且由于光合效率高，固定CO2能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng)模式靈活可控和不占用耕地等特點(diǎn)被認(rèn)為是生物煉制的可持續(xù)原料來(lái)源[2]。

微藻可以在光合自養(yǎng)條件下通過(guò)營(yíng)養(yǎng)限制、高光強(qiáng)等方式積累大量淀粉，在制取生物乙醇、生物丁醇等生物質(zhì)能源方面有潛在的應(yīng)用前景[3]。但目前制約其產(chǎn)業(yè)化的主要因素在于生物質(zhì)和淀粉產(chǎn)率過(guò)低，使微藻培養(yǎng)、采收和后續(xù)加工的成本過(guò)高。提高生物質(zhì)產(chǎn)量(培養(yǎng)液中微藻濃度，g·L-1)和產(chǎn)率(單位時(shí)間生產(chǎn)的生物質(zhì)量，g·L-1·d-1)有利于降低微藻培養(yǎng)和采收成本，而目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量和含量(占干重的百分比)的提高則有利于微藻的后續(xù)加工和煉制[4]。因此，微藻淀粉積累的調(diào)控需要同時(shí)考慮淀粉含量、生物質(zhì)和淀粉的產(chǎn)量和產(chǎn)率。

應(yīng)用各種化學(xué)物質(zhì)調(diào)控細(xì)胞代謝已被證明是一種提高微藻儲(chǔ)能物質(zhì)(主要是脂質(zhì))積累的有效方法[5]。近年來(lái)，植物激素、抗氧化劑和相關(guān)通路的激活劑/抑制劑對(duì)微藻脂質(zhì)積累的促進(jìn)作用得到了廣泛的研究[3]。然而，關(guān)于改進(jìn)微藻淀粉生產(chǎn)的化學(xué)調(diào)節(jié)劑的研究進(jìn)展很少。γ-氨基丁酸(GABA)是一種存在于植物、動(dòng)物、細(xì)菌和微藻中的四碳非蛋白氨基酸[6]。GABA被認(rèn)為是一種信號(hào)分子，以調(diào)節(jié)植物應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫的生長(zhǎng)代謝，比如鹽度異常、干旱、內(nèi)澇、冷熱和缺氧[7-10]。最近有文獻(xiàn)報(bào)道，在鎘脅迫下，外源添加2.5 mmol/L的GABA可以增加產(chǎn)油微藻Monoraphidiumsp. QLY-1的生物質(zhì)和脂質(zhì)生產(chǎn)，進(jìn)一步證明了GABA對(duì)微藻代謝調(diào)節(jié)的有效性[11]。然而，利用GABA調(diào)控微藻淀粉積累并未見(jiàn)報(bào)道。

亞心形四爿藻是一種海洋綠藻，在缺氮條件下該藻具有潛在的淀粉生產(chǎn)能力[12]。為了在提高淀粉產(chǎn)量的同時(shí)進(jìn)一步提高淀粉含量，本研究分析了缺氮培養(yǎng)條件下，GABA對(duì)亞心形四爿藻細(xì)胞生長(zhǎng)、生物質(zhì)積累、淀粉生產(chǎn)和光合作用的調(diào)節(jié)作用，以證明利用外源添加GABA調(diào)控微藻淀粉生產(chǎn)的可行性。

1 材料和方法

1.1 藻株和實(shí)驗(yàn)條件

海洋綠藻亞心形四爿藻(Tetraselmissubcordiformis), 分離于大連附近海域, 經(jīng)過(guò)本實(shí)驗(yàn)室純化, 并保存在中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)(Freshwater Algae Culture Collection at the Institute of Hydrobiology, FACHB-collection), 編號(hào)為FACHB-1751。

微藻藻種在人工海水(ASW)中培養(yǎng)[13]，添加0.81 g·L-1的Tris和0.33 mL·L-1冰乙酸。在生長(zhǎng)指數(shù)后期收集藻細(xì)胞，用缺N的人工海水(ASW-N)洗滌兩次后重懸于ASW-N中，調(diào)整細(xì)胞初始接種密度(ICD)OD750為3.5。在缺N培養(yǎng)模式下添加GABA最終濃度為10 mmol/L，并以未添加GABA(0 mmol/L)的藻在相同條件下培養(yǎng)做對(duì)照。

藻細(xì)胞在YAO等人[14]描述的工作體積為500 mL (直徑為50 mm, 高度為400 mm) 的600 mL的玻璃泡柱光生物反應(yīng)器中進(jìn)行自養(yǎng)培養(yǎng)。通入空氣流量0.4 vvm, CO2含量2%, 培養(yǎng)溫度(25±2) ℃。連續(xù)單排照光, 光照強(qiáng)度150 μmol·m-2·s-1。所有實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)的測(cè)定

在分光光度計(jì)(AOE, UV/Vis A-360, 上海, 中國(guó)) 750 nm 處測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)的光密度[12]。細(xì)胞干重(DW, g·L-1)根據(jù)YAO[14]的方法測(cè)定。

1.3 光合活性分析

應(yīng)用快速熒光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)(OJIP-test)對(duì)微藻的光合性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。光合系統(tǒng)Ⅱ(PhotosystemⅡ, PSⅡ)最大光化學(xué)量子產(chǎn)量Fv/Fm, 在J-step(Vj)和I step(Vi)的相對(duì)可變熒光和單位 PSⅡ 捕光截面的能量耗散DIo/CS0用葉綠素?zé)晒鈨xOs30p+(Opti-sciences, USA)測(cè)定葉綠素a熒光進(jìn)行評(píng)估。各項(xiàng)參數(shù)Fv/Fm, DIo/CS0,Vj和Vi根據(jù)STRASSERF和SRIVASTAVA[15]進(jìn)行如下計(jì)算:

Fv/Fm=(Fm-F0)/Fm

DIo/CS0=F0(1-Fv/Fm)

Vj=(Fj-F0)/(Fm-F0)

Vi=(Fi-F0)/(Fm-F0)

Fv表示飽和脈沖誘導(dǎo)的最大熒光Fm與初始熒光F0之間的葉綠素?zé)晒庾兓現(xiàn)j和Fi分別為J和I時(shí)期的熒光。

1.4 生化成分分析

Ps=(DWtCst-DW0Cs0)/t

式中:DWt和DW0分別是t時(shí)刻和初始時(shí)刻的干重，Cst和Cs0分別是t時(shí)刻和初始時(shí)刻的淀粉含量。蛋白質(zhì)的提取參照YAO[13]的方法，用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白含量(碧云天，中國(guó))。

1.5 鏡檢觀察細(xì)胞淀粉積累

以1/1 (v/v)的海藻懸浮液/碘溶液 (0.2% I2, 2% KI) 比例染色，并在光學(xué)顯微鏡(BMC303-IPL, 上海, 中國(guó))下觀察藻細(xì)胞中的淀粉積累。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值±SD表示。采用SPSS 16.0 軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。兩組比較采用雙尾分布student配對(duì)t檢驗(yàn)。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 GABA對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

為了評(píng)價(jià)添加GABA是否能提高脅迫條件下微藻淀粉的積累，研究在N缺乏的條件下添加10 mmol/L GABA于亞心形四爿藻，并與未添加GABA(0 mmol/L)的藻作對(duì)比。雖然藻細(xì)胞在缺氮下受到脅迫，但細(xì)胞可以利用內(nèi)源性氮增殖，細(xì)胞密度在4 d內(nèi)達(dá)到最大，之后停止生長(zhǎng)。從培養(yǎng)的第0 d到第4 d，無(wú)添加(0 mmol/L) GABA的細(xì)胞密度增長(zhǎng)了66%，而添加10 mmol/L GABA的藻細(xì)胞密度增長(zhǎng)了54%(圖1a)，表明GABA添加對(duì)細(xì)胞分裂有一定的抑制作用。在培養(yǎng)5 d時(shí)，添加10 mmol/L GABA的細(xì)胞密度為未添加GABA(0 mmol/L)的89.7%。然而，添加GABA對(duì)細(xì)胞生物質(zhì)積累沒(méi)有顯著影響，缺氮培養(yǎng)4 d，與未添加組同樣細(xì)胞干重大約增加了40.6%，均達(dá)到4.5 g·L-1(圖1b)。這些結(jié)果與高等植物的情況不一致，比如添加外源GABA于玉米可以在幼苗長(zhǎng)度和生物質(zhì)積累方面改善幼苗生長(zhǎng)[17]，說(shuō)明GABA可能在亞心形四爿藻中發(fā)揮不同的作用。

星號(hào)(*)代表與0 mmol/L GABA對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)
圖1 缺N條件下GABA對(duì)亞心形四爿藻

2.2 GABA對(duì)淀粉積累的影響

與細(xì)胞生長(zhǎng)和生物質(zhì)積累的情況不同，GABA可以促進(jìn)亞心形四爿藻淀粉的積累。在培養(yǎng)的第1 d，未添加GABA的藻細(xì)胞淀粉呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖2a)，這是由于細(xì)胞利用內(nèi)源性N進(jìn)行細(xì)胞分裂，藻細(xì)胞降解淀粉為細(xì)胞分裂和細(xì)胞骨架(比如蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì))的生物合成提供能量和碳骨架[18]；而添加10 mmol/L GABA的藻在培養(yǎng)的第1 d淀粉含量幾乎保持不變，且細(xì)胞分裂也受到抑制(圖1a)。藻細(xì)胞從第2 d起開(kāi)始積累淀粉，且添加10 mmol/L GABA的藻細(xì)胞淀粉含量比未添加GABA的對(duì)照組的淀粉含量高。在培養(yǎng)的第4 d，添加10 mmol/L GABA的藻細(xì)胞淀粉含量達(dá)到39%DW，而未添加GABA的藻細(xì)胞淀粉含量?jī)H為28%DW，表明添加GABA后淀粉含量顯著性提高了39%(P<0.05)(圖2a)。

通過(guò)碘染色的藻細(xì)胞也反映出添加GABA后淀粉含量的增加。如圖3所示，在缺氮培養(yǎng)的第4 d，添加GABA的藻液與碘染色后在顯微鏡下觀察顏色呈現(xiàn)褐色且比未添加GABA的藻細(xì)胞顏色更深，表明GABA促進(jìn)了微藻細(xì)胞的淀粉積累，結(jié)論與圖2中的淀粉生產(chǎn)情況相一致。

此外，從圖4可以看出，在培養(yǎng)的第2 d，添加10 mmol/L GABA的微藻中蛋白含量為20% DW，比未添加GABA的對(duì)照組蛋白含量降低了13%。這些結(jié)果表明，GABA可能通過(guò)抑制細(xì)胞分裂降低淀粉的降解，且改變了光合碳流的分配，即從蛋白質(zhì)合成更多地轉(zhuǎn)換到淀粉的合成，促使藻細(xì)胞的淀粉含量提高。

淀粉合成的提高可以減小蛋白和油脂合成過(guò)程的CO2釋放[19,20]，提高光合碳固定效率。因此，盡管GABA的添加抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(圖1a)，但淀粉合成提高所帶來(lái)的碳儲(chǔ)存效率的增加導(dǎo)致生物質(zhì)積累并不受影響(圖1b)。由于GABA有利于淀粉含量的升高，因此GABA的添加也有利于淀粉產(chǎn)率的提高。如圖2b所示，在培養(yǎng)第4 d，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉產(chǎn)量達(dá)到最大值1.72 g·L-1，比未添加GABA的對(duì)照組顯著提高了39%(P<0.05)。同樣地，添加10 mmol/L GABA的微藻淀粉產(chǎn)率在第4 d達(dá)到最大值0.36 g·L-1·d-1，而0 mmol/L GABA的對(duì)照組淀粉產(chǎn)率為0.24 g·L-1·d-1，提高了50%(P<0.05)(圖2c)。

2.3 GABA對(duì)光合活性的影響

星號(hào)(*)代表與0 mmol/L GABA對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)圖2 缺N條件GABA對(duì)亞心形四爿藻

0 mmol·L-1

10 mmol·L-1

圖4 缺氮條件下GABA對(duì)亞心形四爿藻蛋白含量的影響

3 結(jié)論

GABA在缺氮培養(yǎng)模式下可以促進(jìn)亞心形四爿藻淀粉積累。GABA可以調(diào)控亞心形四爿藻細(xì)胞分裂和代謝，產(chǎn)生適度的額外脅迫，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，阻礙淀粉降解，促使細(xì)胞將碳流更多地分配到淀粉積累，從而導(dǎo)致藻細(xì)胞的淀粉含量、淀粉產(chǎn)量和淀粉產(chǎn)率提高。在N缺乏條件下添加10 mmol/L GABA，可以使亞心形四爿藻淀粉含量、淀粉產(chǎn)量和淀粉產(chǎn)率分別提高39%、39%和50%。添加GABA是提高微藻淀粉生產(chǎn)的有效途徑，可能為淀粉基生物燃料和生物基化學(xué)品的生產(chǎn)提供可持續(xù)的綠色原料。