黃曉梅　王康瑋　唐萬(wàn)娜　趙祝香　趙子文　魏樹(shù)全

【摘要】目的 探討Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6（WISP-3/CNN6）與半胱氨酸蛋白酶-8（Caspase-8）共結(jié)合在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用與可能機(jī)制。方法 利用小干擾RNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染實(shí)現(xiàn)對(duì)人肺上皮Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6基因的沉默或過(guò)表達(dá)，分別將低表達(dá)或過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的Beas-2B細(xì)胞置高氧（95%O2和5%CO2）或空氣中處理0、24、48 h，通過(guò)蛋白免疫印跡法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Caspase-3及活性片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved 多聚ADP核糖聚合酶（PARP）的表達(dá)量及Caspase-8活性，通過(guò)免疫共聚焦和免疫共沉淀檢測(cè)WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白相互作用。結(jié)果 高氧刺激48 h，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3和cleaved PARP蛋白表達(dá)量均比0 h時(shí)增加（P均< 0.017），且Caspase-8的活性增高（P < 0.05）;過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量比0 h時(shí)減少（P < 0.017），cleaved Caspase-3和cleaved PARP的蛋白表達(dá)量在24 h時(shí)比0 h時(shí)升高、在48 h時(shí)比24 h時(shí)下降（P均< 0.017）。高氧刺激下，Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6蛋白和Caspase-8蛋白結(jié)合減少。結(jié)論 WISP-3/CCN6通過(guò)Caspase途徑參與高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的調(diào)控，其作用可能通過(guò)與Caspase-8蛋白結(jié)合方式實(shí)現(xiàn)。

【關(guān)鍵詞】高氧;細(xì)胞凋亡;Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6;半胱氨酸蛋白酶途徑;急性肺損傷

【Abstract】Objective To investigate the role and the molecular mechanism of WISP-3/CCN6 binding with Caspase-8 in the hyperoxia-induced apoptosis of the lung epithelial cells. Methods The silencing and overexpression of WISP-3/CCN6 in the human lung bronchial epithelial cells （Beas-2B） were performed by plasmid transfection and siRNA. The Beas-2B cells with silencing or overexpressing WISP-3/CCN6 were maintained in hyperoxia （95%O2 and 5%CO2） or air for 0， 24 and 48 h， respectively. The expression levels of key proteins of Caspase signaling pathway （Caspase-8， Caspase-3， cleaved Caspase-8， cleaved Caspase-3 and PARP） were detected with Western blot and the activity of Caspase-8 was determined with flow cytometry. The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was analyzed by immunoconfocal and immunocoprecipitation. Results After 48-h hyperoxia treatment， the expression levels of cleaved Caspase-8， cleaved Caspase-3 and cleaved PARP in the Beas-2B cells with silencing WISP-3/CCN6 were significantly up-regulated （all P < 0.017） and the activity of Caspase-8 was remarkably increased compared with those at 0 h （P < 0.05）. The expression of cleaved Caspase-8 in the Beas-2B cells with overexpressing WISP-3/CCN6 was significantly down-regulated than that at 0 h （P < 0.017）. The expression levels of cleaved Caspase-3 and cleaved PARP at 24 h were significantly up-regulated than those at 0 h， whereas the expression levels at 48 h were significantly down-regulated compared with those at 24 h （all P < 0.017）. The protein interaction between WISP-3/CCN6 and Caspase-8 was signigficantly decreased in the Beas-2B cells after hyperoxia. Conclusion WISP-3/CCN6 participates in the regulation of hyperoxia-induced apoptosis of lung epithelial cells via the Caspase signaling pathway， probably by binding with Caspase-8 protein.

【Key words】Hyperoxia;Cell apoptosis;WISP-3/CCN6;Caspase pathway;Acute lung injury

高濃度氧療對(duì)危重癥患者的危害已經(jīng)引起了國(guó)內(nèi)外呼吸危重癥領(lǐng)域的關(guān)注，但國(guó)內(nèi)相關(guān)研究仍然較少。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)高氧可以引起肺上皮細(xì)胞凋亡[1]。有研究顯示，Wnt-1誘導(dǎo)信號(hào)通路蛋白3/調(diào)節(jié)蛋白6（WISP-3/CCN6）作為一種信號(hào)傳導(dǎo)因子在高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡中具有保護(hù)性作用，但其機(jī)制仍然不清楚。本文將在前期研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究WISP-3/CCN6在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制，為未來(lái)防治高氧性肺損傷提供基礎(chǔ)依據(jù)。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

人肺上皮細(xì)胞株（Beas-2B細(xì)胞）購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。細(xì)胞采用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37℃含5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

二、高氧模型的建立

參考本課題組前期研究建立高氧模型[2-3]。

三、WISP-3/CCN6質(zhì)粒及siRNA轉(zhuǎn)染

通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和小干擾RNA（siRNA）技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)Beas-2B細(xì)胞中WISP-3/CCN6基因的過(guò)表達(dá)及沉默，選用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，詳細(xì)步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。

四、蛋白免疫印跡檢測(cè)

分別把沉默或過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6基因的Beas-2B細(xì)胞置于高氧中培養(yǎng)0、24、48 h，以空氣環(huán)境為對(duì)照（control）。提取各組細(xì)胞蛋白，蛋白免疫印跡法檢測(cè)半胱氨酸蛋白酶（Caspase）途徑凋亡相關(guān)蛋白Caspase-8、Caspase-3和活化片段cleaved Caspase-8、cleaved Caspase-3以及cleaved-多聚ADP核糖聚合酶（PARP）表達(dá)量。WISP-3/CCN6、β-actin抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。采用Image J軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

五、流式細(xì)胞儀檢測(cè)Caspase-8蛋白活性

采用美國(guó)BD公司的Caspase-8蛋白活性檢測(cè)試劑盒和BD公司的流式細(xì)胞儀檢測(cè)空氣環(huán)境及高氧刺激0、48 h時(shí)WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8的活性。

六、免疫熒光-激光共聚焦試驗(yàn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6在高氧刺激肺上皮細(xì)胞的作用方式，利用免疫熒光-激光共聚焦和免疫共沉淀法檢測(cè)WISP-3/CCN6蛋白與細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白的結(jié)合變化。其中免疫熒光-激光共聚焦采用美國(guó)Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體、美國(guó)Santa Cruz公司的抗Caspase-8抗體和德國(guó)Leica公司的激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。步驟為：①24孔板中放置圓形玻片，將Beas-2B細(xì)胞接種于玻片上;②放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞密度約50% ～ 60%，把細(xì)胞分別置于高氧（95%O2和5%CO2）和空氣中處理24 h;

③用鑷子輕輕取出玻片置于操作臺(tái)上，趁玻片未干時(shí)向玻片滴入磷酸鹽緩沖液（PBS），然后負(fù)壓吸干，洗滌3次;④在玻璃片上滴入4%多聚甲醛，固定30 min后，負(fù)壓吸干，固定細(xì)胞;⑤滴入0.5% Triton-X-100覆蓋整個(gè)玻片，室溫放置1 h（細(xì)胞膜打孔）;⑥然后用PBS洗滌3次，滴入5%牛血清白蛋白，室溫放置2 h;⑦把玻片放回24孔板，加入1∶100的一抗（Caspase-8抗體和WISP-3/CCN6抗體）4 ℃過(guò)夜孵育;⑧次日取出，用PBS洗滌3次后加入熒光抗體（紅色為Caspase-8抗體，綠色為WISP-3/CCN6抗體），避光孵育10 min;⑨取出玻片，自然晾干后倒扣于載玻片上，周?chē)弥讣子头膺叀Ｗ詈笤诩す夤簿劢癸@微鏡下觀察空氣環(huán)境和高氧環(huán)境下Caspase-8與WISP-3/CCN6的結(jié)合情況。

七、免疫共沉淀試驗(yàn)

采用美國(guó)Abcam公司的細(xì)胞裂解液RIPA緩沖液、美國(guó)Sigma公司的抗WISP-3/CCN6抗體進(jìn)行檢測(cè)。步驟為：①把Beas-2B細(xì)胞接種于6孔板，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到細(xì)胞密度約50% ～ 60%，把細(xì)胞分別置于高氧（95%O2和5%CO2）、空氣中處理4 h;②取出細(xì)胞置于冰上，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細(xì)胞2次后，加入細(xì)胞裂解液RIPA buffer（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min;③4℃，18 000轉(zhuǎn)/分離心30 min后，把上清液轉(zhuǎn)移到新的EP管，取少量樣品以備蛋白免疫印跡分析;④在樣品中加入1 μl的興趣蛋白抗體，4℃搖床緩慢搖晃孵育過(guò)夜;⑤次日取10 μl的Protein A 瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3 次，每次3000轉(zhuǎn)/分離心3 min;⑥將預(yù)處理過(guò)的10 μl

的Protein A 瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的樣品中，4℃搖床緩慢搖晃孵育2 ～ 4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠充分偶聯(lián);⑦4℃，3000轉(zhuǎn)/分

離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底，將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 ml裂解緩沖液洗滌3 ～ 4次，洗滌時(shí)用手指輕彈;⑧最后加入15 μl的2倍SDS 上樣緩沖液，沸水煮5 min，免疫印跡檢測(cè)目的蛋白。本研究的興趣蛋白為WISP-3/CCN6，目的蛋白為Caspase-8。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0分析結(jié)果，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用方差分析，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩兩比較采用Bonferroni法，即P < 0.05/3 = 0.017為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、環(huán)境對(duì)WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白的影響

無(wú)論是高氧刺激還是空氣環(huán)境下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化（P均> 0.05）?？諝猸h(huán)境下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)變化（P均> 0.05）。高氧刺激下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量在24 h和48 h升高（總體比較F = 13.590、P = 0.006，與0 h比較P均< 0.017），cleaved Caspase-3僅在48 h表達(dá)上調(diào)（總體比較F = 86.24、 P < 0.001，與0 h和24 h比較P均< 0.017）。WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中cleaved PARP表達(dá)量在高氧刺激（F = 728.90，P < 0.001）及空氣環(huán)境（F = 39.19，P < 0.001）24 h和48 h均升高（與0 h比較，P均< 0.017），高氧刺激下cleaved PARP表達(dá)量在WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中升高趨勢(shì)較空氣環(huán)境更明顯（與24 h比較，P < 0.017），見(jiàn)圖1A ～ C。高氧刺激48 h下，WISP-3/CCN6沉默的Beas-2B細(xì)胞中的Caspase-8活性比0 h時(shí)升高，見(jiàn)圖1D。

二、環(huán)境對(duì)WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中Caspase途徑凋亡相關(guān)蛋白的影響

無(wú)論是高氧刺激還是空氣環(huán)境下，WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中Caspase-8、Caspase-3蛋白表達(dá)量均無(wú)明顯變化（P均> 0.05）?？諝猸h(huán)境下，WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)量在48 h時(shí)升高（總體比較F = 202.55、 P < 0.001，與0 h和24 h比較P均< 0.017，cleaved PARP蛋白表達(dá)量隨時(shí)間延長(zhǎng)而升高（總體比較F = 155.53、P < 0.001，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均<0.017）。高氧刺激下，WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的Beas-2B細(xì)胞中cleaved Caspase-8隨時(shí)間延長(zhǎng)而均減少（總體比較F = 21.79、P = 0.002，3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均< 0.017），cleaved Caspase-3 （F = 105.10，P < 0.001）和cleaved PARP（F = 320.00，P < 0.001）蛋白表達(dá)量在24 h比0 h升高，48 h時(shí)均下降（3個(gè)時(shí)間點(diǎn)兩兩比較P均< 0.017），見(jiàn)圖2。

三、環(huán)境對(duì)肺上皮細(xì)胞中WISP-3/CCN6和Caspase-8蛋白的相互作用影響

與空氣環(huán)境相比，高氧刺激24 h時(shí)Beas-2B細(xì)胞WISP-3/CCN6與細(xì)胞內(nèi)凋亡關(guān)鍵蛋白Caspase-8結(jié)合的熒光信號(hào)減少（圖3A）。把WISP-3/CCN6作為感興趣蛋白，與空氣環(huán)境相比，高氧刺激24 h時(shí)與其結(jié)合的Caspase-8蛋白減少（P < 0.001，圖3B）。

討論

高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是異常復(fù)雜的，其確切的機(jī)制仍然不清楚。在凋亡通路中，Caspase家族發(fā)揮重要的作用。Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡效應(yīng)因子，控制下游的凋亡共同通路，它的活化標(biāo)志著凋亡進(jìn)入不可逆的階段，因此Caspase-3及其活性片段也被稱(chēng)為凋亡的生物標(biāo)志物[4]。

本研究中，肺上皮細(xì)胞中WISP-3/CCN6沉默后再接受高氧刺激48 h，細(xì)胞的cleaved Caspase-3活性片段表達(dá)增加，表明沉默WISP-3/CCN6可以促進(jìn)Caspase-3的激活。Caspase-3是凋亡外源性和內(nèi)源性途徑的共同效應(yīng)蛋白，它的激活可以進(jìn)一步活化下游的凋亡因子，如PARP[5-7]。多種凋亡刺激因子可以啟動(dòng)Caspase-3活化，Caspase-3蛋白酶原被切割成有活性的片段cleaved Caspase-3，活化的Caspase-3又進(jìn)一步作用于下游的不同底物，導(dǎo)致蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6與Caspase-3的關(guān)系，本研究在Beas-2B細(xì)胞中過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6，與

0 h時(shí)相比，過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6的細(xì)胞在高氧刺激下，Caspase-3蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化，cleaved Caspase-3的蛋白表達(dá)量先升高，后下降。因此，WISP-3/CCN6可能控制著Caspase-3的活化，進(jìn)而調(diào)控高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。

要驗(yàn)證WISP-3/CCN6通過(guò)Caspase-3調(diào)控細(xì)胞凋亡，仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證WISP-3/CCN6與其下游凋亡效應(yīng)因子的關(guān)系。本研究中Beas-2B細(xì)胞沉默和過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6基因后再接受高氧刺激48 h，結(jié)果顯示沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞中 cleaved PARP蛋白表達(dá)量增加，而WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的肺上皮細(xì)胞中的cleaved PARP蛋白表達(dá)量先升高，后隨時(shí)間延長(zhǎng)下降，也就是說(shuō)，WISP-3/CCN6可能影響著PARP的活化。WISP-3/CCN6對(duì)肺上皮細(xì)胞中Caspase-3和PARP活化的影響是同向的。那么在Caspase-3上游，凋亡啟動(dòng)蛋白是否也與WISP-3/CCN6有聯(lián)系呢？

Caspase-3和Caspase-8同屬于Caspase家族，在細(xì)胞凋亡的外源性途徑中，Caspase-8是關(guān)鍵的啟動(dòng)型蛋白，Caspase-8通過(guò)誘導(dǎo)接近模式活化后可以作用于底物Caspase-3引起下游的級(jí)聯(lián)反應(yīng)引起凋亡。在正常情況下，Caspase-8存在于胞漿中，當(dāng)細(xì)胞接受死亡刺激之后，Caspase-8可以與FADD結(jié)合，從而與細(xì)胞膜上的死亡受體發(fā)生間接結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)復(fù)合體，從而把死亡信號(hào)從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)化到細(xì)胞漿中去[8-9]。本研究在Beas-2B細(xì)胞中沉默和過(guò)表達(dá)WISP-3/CCN6后再接受高氧刺激24、48 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與0 h時(shí)相比，沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞中cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量增加，而WISP-3/CCN6過(guò)表達(dá)的肺上皮細(xì)胞中的cleaved Caspase-8蛋白表達(dá)量降低，也就是說(shuō)，WISP-3/CCN6也可能影響著Caspase-8的活化。進(jìn)一步研究顯示，沉默WISP-3/CCN6的肺上皮細(xì)胞在高氧刺激48 h時(shí)Caspase-8的活性增強(qiáng)，證實(shí)WISP-5/CCN6與Caspase-8活化有關(guān)。

在高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞模型當(dāng)中，WISP-3/CCN6與凋亡效應(yīng)蛋白Caspase-3以及其上游的凋亡啟動(dòng)蛋白Caspase-8和下游的凋亡效應(yīng)蛋白PARP均有聯(lián)系。由此推測(cè)，WISP-3/CCN6可能通過(guò)Caspase通路參與了高氧誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞凋亡。那么WISP-3/CCN6的作用靶點(diǎn)在哪里？根據(jù)Caspase凋亡通路的原理，推測(cè)其作用靶點(diǎn)在Caspase-8或其上游。為此，本研究通過(guò)蛋白的相互作用了解WISP-3/CCN6與Caspase-8的關(guān)系。目前檢測(cè)蛋白間的相互作用常用的方法是免疫共聚焦和免疫共沉淀。該研究采用的細(xì)胞仍然是Beas-2B細(xì)胞。高氧處理24 h后，經(jīng)細(xì)胞打孔和免疫熒光染色，并通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果顯示，與空氣環(huán)境相比，高氧刺激24 h后，WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結(jié)合熒光信號(hào)減少。同時(shí)，我們把WISP-3/CCN6設(shè)為興趣蛋白，用免疫共沉淀的方法把WISP-3/CCN6及其相結(jié)合的蛋白沉淀，進(jìn)一步用蛋白免疫印跡法檢測(cè)WISP-3/CCN6與Caspase-8的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空氣環(huán)境相比，高氧刺激使WISP-3/CCN6和Caspase-8的蛋白結(jié)合減少。這兩項(xiàng)試驗(yàn)的結(jié)果表明，高氧環(huán)境中，肺上皮細(xì)胞中的WISP-3/CCN6蛋白可能通過(guò)某種機(jī)制大量丟失，其丟失導(dǎo)致WISP-3/CCN6與Caspase-8的蛋白結(jié)合減少，進(jìn)而導(dǎo)致Caspase-8激活，Caspase-8的活化引起其下游的一系列凋亡因子級(jí)聯(lián)激活，啟動(dòng)經(jīng)典的Caspase凋亡途徑，使肺上皮細(xì)胞大量凋亡。

綜上所述，WISP-3/CCN6可能是高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要調(diào)控蛋白，也可能是防治高氧性肺損傷的一個(gè)潛在的作用靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。然而高氧誘導(dǎo)肺上皮細(xì)胞凋亡的機(jī)制是異常復(fù)雜的，WISP-3/CCN6僅為其中的一個(gè)關(guān)鍵蛋白，是否存在其他的機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-12-19）

（本文編輯：林燕薇）