慢病毒載體介導(dǎo)的IRX1基因沉默對宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響

陳曉潔　郭玲宇　張萍

【摘要】目的 觀察慢病毒載體介導(dǎo)的易洛魁家族同源盒1（IRX1）基因沉默對宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響。方法 培養(yǎng)宮頸癌SiHa細胞并分為3組：其中未做任何處理的SiHa細胞為Control組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SiHa細胞為sh-NC組、轉(zhuǎn)染IRX1短發(fā)夾RNA（shRNA）重組慢病毒載體質(zhì)粒的SiHa細胞為sh-IRX1組。實時定量PCR和蛋白免疫印跡法分別在IRX1 mRNA和蛋白表達水平上鑒定轉(zhuǎn)染效果，CCK-8法和克隆形成試驗檢測轉(zhuǎn)染后SiHa細胞增殖能力變化，流式細胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后SiHa細胞周期和細胞凋亡的變化，蛋白免疫印跡法檢測SiHa細胞中增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、B淋巴細胞瘤（BCL）關(guān)聯(lián)X蛋白（BAX）和BCL-2蛋白表達水平。結(jié)果 與Control組和sh-NC組比較，sh-IRX1組SiHa細胞中IRX1 mRNA和蛋白表達水平均下調(diào)，SiHa細胞活性和克隆形成能力均降低，G0/G1期細胞比例增多，S期和G2/M期細胞比例減少，細胞凋亡率升高，細胞中PCNA、Cyclin D1和BCL-2蛋白表達水平下調(diào)，BAX蛋白表達水平上調(diào)（P均< 0.05）。結(jié)論 慢病毒載體介導(dǎo)IRX1基因沉默可抑制人宮頸癌SiHa細胞增殖，并促進細胞凋亡。

【關(guān)鍵詞】易洛魁家族同源盒1基因;宮頸癌SiHa細胞;增殖;凋亡

【Abstract】Objective To observe the effect of lentiviral vector-mediated Iroquois homeobox 1 （IRX1） gene silencing on the proliferation and apoptosis of cervical cancer SiHa cells. Methods Primary Cervical cancer SiHa cells were cultured and divided into three groups. In the control groups， cervical cancer SiHa cells were untreated. In the sh-NC group， cervical cancer SiHa cells were transfected with empty plasmid. In the sh-IRX1 group， human cervical cancer SiHa cells were transfected with the IRX1 shRNA recombinant lentiviral vector. The transfection efficiency of IRX1 expression at the mRNA and protein levels was evaluated by real-time PCR and Western blot， respectively. The changes in the proliferation of SiHa cells after transfection were detected by CCK-8 assay and colony formation assay. The cell cycle and apoptosis of SiHa cells were detected by flow cytometry. The expression levels of PCNA， Cyclin D1， BAX and BCL-2 proteins in SiHa cells were measured by Western blot. Results After transfection of IRX1 shRNA lentiviral vector， the expression levels of IRX1 mRNA and protein in SiHa cells were significantly down-regulated compared with those in the control and sh-NC groups （both P < 0.05）. After IRX1 gene silencing， SiHa cell activity and clone formation ability were significantly decreased. The G0/G1 phase cell ratio was significantly increased， whereas the S phase and G2/M phase cell ratios were dramatically decreased. The cell apoptosis rate was remarkably elevated. The expression levels of PCNA， Cyclin D1 and BCL-2 proteins were significantly down-regulated， whereas that of BAX protein was significantly up-regulated （all P < 0.05）. Conclusion Lentiviral vector-mediated IRX1 gene silencing can inhibit the proliferation of human cervical cancer SiHa cells and promote cell apoptosis.

【Key words】Iroquois homeobox 1 gene;Cervical cancer SiHa cells;Proliferation;Apoptosis

宮頸癌是女性第二高發(fā)惡性腫瘤，也是女性惡性腫瘤死亡的第三大原因[1]。根據(jù)近年我國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，女性中宮頸癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2-3]。目前，宮頸癌的治療方式主要有手術(shù)、放射治療和化學(xué)治療，但患者的生存率仍未能明顯提高[4-5]。隨著分子生物學(xué)及醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展，基因治療在包括宮頸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中取得突破性的進展[6-8]。腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一種涉及多因素、多步驟的繁雜過程，其中促癌基因和抑癌基因的異常表達均可參與惡性腫瘤的發(fā)病[9-12]。易洛魁家族同源盒1（IRX1）基因與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、胚胎發(fā)育等密切相關(guān)[13-14]。研究顯示，IRX1通過介導(dǎo)腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15-16]。亦有研究顯示IRX1在宮頸癌中呈高表達，且與宮頸癌的臨床分期密切相關(guān)[17]。然而，IRX1在宮頸癌中的功能及作用機制鮮有報道。因此，本研究探究IRX1對宮頸癌SiHa細胞增殖和凋亡的影響，以期為宮頸癌的基因治療提供作用靶點。

材料與方法

一、材 料

人宮頸癌細胞株SiHa細胞株（美國標準生物品收藏中心），DMEM培養(yǎng)基（美國Sigma公司），胎牛血清、胰蛋白酶、Opi-MEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司），CCK-8試劑（日本TaKaRa公司），IRX1短發(fā)夾RNA（shRNA）重組慢病毒載體質(zhì)粒及空載質(zhì)粒（上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司），細胞蛋白提取試劑盒（美國Pierce公司），BCA蛋白濃度檢測試劑盒、電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑及蛋白免疫印跡法檢測所需試劑（上海碧云天生物技術(shù)研究所），鼠抗人IRX1、增殖細胞核抗原（PCNA）、細胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）、B淋巴細胞瘤（BCL）關(guān)聯(lián)X蛋白（BAX）和BCL-2蛋白抗體及山羊抗鼠二抗（美國Cell Sigaling Technology公司）。

二、方 法

1. 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌SiHa細胞株用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，置于5%CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱中。待細胞貼壁生長融合度達90%后，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)期的SiHa細胞進行后續(xù)研究。

2. 細胞慢病毒轉(zhuǎn)染和分組

對數(shù)生長期的SiHa細胞以胰酶消化，計數(shù)后以1×105/孔接種到6孔板中，將細胞分為3組：其中未做任何處理的SiHa細胞為Control組、轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的SiHa細胞為sh-NC組、轉(zhuǎn)染IRX1 shRNA重組慢病毒載體質(zhì)粒的SiHa細胞為sh-IRX1組。轉(zhuǎn)染過程嚴格參照慢病毒轉(zhuǎn)染及Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書，轉(zhuǎn)染后篩選并收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的SiHa細胞。

3. IRX1基因表達水平的檢測

使用實時定量PCR法。分別收集轉(zhuǎn)染48 h后的各組SiHa細胞，利用Trizol試劑裂解并提取細胞中總RNA，以分光光度計對提取RNA的純度和濃度進行鑒定。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行加樣和擴增，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成第一鏈模板DNA，并以GAPDH為內(nèi)參基因，使用SYBR premix Ex Taq Kit試劑盒行實時定量PCR檢測。反應(yīng)體系包括2倍SYBR premix 10 μl、模板DNA 2 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl、DEPC水6 μl。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s，95℃變性30 s、60℃退火20 s共40個循環(huán)，72℃延伸30 s。待反應(yīng)結(jié)束后，分析熔鏈曲線確定產(chǎn)物的特異性，并獲得Ct值，-△△CT=目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，以相對定量2-△△CT法分別計算各組SiHa細胞中IRX1 mRNA相對表達量。IRX1上游引物序列5-AGTTAAAGTCGCCCTTCCAG-3，下游引物序列5-CCCCGCAAAAGTAAAAGAAGAC-3，產(chǎn)物長度120 bp;GAPDH上游引物序列5-GATAC ACGGAGCACCAGGTT-3，下游引物序列5-CAGG TCACATACACGGTTGC-3，產(chǎn)物長度158 bp。

4. IRX1、PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2蛋白表達水平的檢測

使用蛋白免疫印跡法。轉(zhuǎn)染48 h后各組SiHa細胞以胰酶消化，離心收集細胞，使用蛋白提取試劑盒提取各組SiHa細胞中總蛋白。加入適量上樣緩沖液與蛋白混勻，加熱變性，取30 μg蛋白進行加樣，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后采用半干法將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。在5%脫脂奶粉的封閉液中封阻2 h。TBST緩沖液洗膜，分別加入相應(yīng)一抗，一抗按照使用說明書進行稀釋，4℃過夜雜交，TBST洗膜后加入1∶2000稀釋的二抗，室溫雜交1 h。TBST洗膜后以ECL顯色，于暗室中使用凝膠成像系統(tǒng)成像拍照。以GAPDH進行標定，使用Quantity One軟件分析各蛋白條帶灰度值。分別計算各組SiHa細胞中目的蛋白相對表達水平。

5. IRX1對SiHa細胞增殖能力影響的檢測

采用CCK-8法。對數(shù)生長期的SiHa細胞接種到96孔板中，接種密度為1×103/孔，在37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長密度達50%左右時按前述方法進行分組和轉(zhuǎn)染，在轉(zhuǎn)染24、48、72 h時分別向每孔細胞加入100 μl CCK-8溶液，37℃繼續(xù)孵育4 h，使用多功能酶標儀測定450 nm波長處細胞吸光度（OD）值。

6. IRX1對SiHa細胞增殖影響的檢測

采用克隆形成試驗。各組處于對數(shù)生長期SiHa細胞以胰酶消化，離心收集細胞并制成細胞懸液，計數(shù)后分別以8×102/孔接種到6孔板中，將接種好的細胞放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)約14 d，

直至大部分細胞克隆數(shù)大于50時結(jié)束培養(yǎng)，取出6孔板，向各孔細胞中加入1 ml多聚甲醛固定1 h，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后再向細胞中加入500 μl Giemsa染色液，染色20 min，清水洗滌3次，對各組細胞克隆數(shù)進行計數(shù)。

7. IRX1對SiHa細胞周期及凋亡影響檢測

采用流式細胞術(shù)。轉(zhuǎn)染后的各組SiHa細胞以胰酶消化，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液終止消化，離心收集細胞，調(diào)整細胞懸液密度為3×105/ml，加入預(yù)冷的70%的乙醇對細胞進行固定。離心棄上清，加入預(yù)冷的PBS 200 μl洗滌細胞2次。向細胞中加入20 μl RNA酶，置37 ℃下孵育30 min，再加入400 μl 碘化丙啶（PI）染液，置于冰上，避光反應(yīng)15 min，流式細胞儀檢測細胞周期比例。另收集轉(zhuǎn)染后的各組SiHa細胞，加入100 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，再向細胞懸液中加入異硫氰酸熒光素Annexin V-FITC和PI各5 μl，

混勻后避光孵育30 min，1 h內(nèi)上流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以表示，所有試驗均重復(fù)3次。多組間差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、慢病毒載體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染建立穩(wěn)定沉默IRX1基因的SiHa細胞株

sh-IRX1組SiHa細胞中IRX1 mRNA和蛋白相對表達水平均低于Control組和sh-NC組（P < 0.05），而Control組和sh-NC組IRX1 mRNA和蛋白相對表達水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），見圖1、表1。

二、IRX1對SiHa細胞增殖的影響

從轉(zhuǎn)染48 h開始，sh-IRX1組SiHa細胞OD值均低于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組SiHa細胞在各個時間點OD值比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05）。另外，sh-IRX1組SiHa細胞克隆形成數(shù)均少于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組SiHa細胞克隆形成數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見表2。

三、IRX1對SiHa細胞周期的影響

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，sh-IRX1組G0/G1期細胞百分比均高于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），S期和G2/M期細胞百分比均低于sh-IRX1組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組各時期細胞百分比比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），見表3。

四、IRX1對SiHa細胞凋亡的影響

sh-IRX1組SiHa細胞凋亡率為（21.94± 3.24）%，均高于Control組的（3.36±0.55）%和sh-NC組的（3.82±0.57）%，P均< 0.05。Control組和sh-NC組SiHa細胞凋亡率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），見圖2。

五、IRX1對SiHa細胞中蛋白表達水平的影響

sh-IRX1組SiHa細胞中PCNA、Cyclin D1和BCL-2蛋白表達水平均低于Control組和sh-NC組（P均< 0.05），其BAX蛋白表達水平高于Control組和sh-IRX1組（P均< 0.05），而Control組和sh-NC組SiHa細胞中PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2蛋白表達水平比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均> 0.05），見表4、圖3。

討論

既往研究顯示，IRX1在多種腫瘤中起抑癌基因或促癌基因的作用[18]。Liu等[19]研究表明，蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5（PRMT5）作為IRX1的主要上游調(diào)節(jié)劑通過誘導(dǎo)IRX1的表觀遺傳沉默促進胃癌細胞的致瘤性和轉(zhuǎn)移。IRX1 mRNA在原發(fā)性肝癌組織中的表達量顯著高于相應(yīng)癌旁組織，IRX1基因的異常高表達可促進肝癌細胞凋亡，抑制細胞生長[20]。以上這些研究顯示出IRX1基因的抑癌作用。然而，在Lu等[21]的研究中，IRX1在人骨肉瘤細胞系和臨床骨肉瘤組織中過表達，體外研究顯示，IRX1通過上調(diào)CXCL14/NF-κB信號傳導(dǎo)通路促進細胞體外遷移和侵襲。另一項研究顯示，IRX1在膠質(zhì)瘤組織中的表達高于正常腦組織及癌旁組織，且與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)[22]。

Zhang等[23]報道指出，在膠質(zhì)瘤組織和U373、LN229和T98G細胞中IRX1的表達升高，其表達量與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的總體存活率呈正相關(guān)，提示基因可能在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表現(xiàn)出致癌作用。這些研究顯示出IRX1基因的促癌作用，并提示IRX1在不同腫瘤中發(fā)揮不同作用可能與其表達量有關(guān)。何楊等[17]指出，IRX1在宮頸癌組織和細胞株中的表達顯著升高，提示IRX1可能促進宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展?；谝酝芯拷Y(jié)果，本研究通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染IRX1 shRNA至宮頸癌SiHa細胞，探究沉默IRX1基因?qū)iHa細胞增殖和凋亡的影響。

本研究顯示，宮頸癌SiHa細胞中IRX1 mRNA和蛋白表達水平均降低，表明穩(wěn)定沉默IRX1基因的SiHa細胞株構(gòu)建成功。CCK-8和克隆形成試驗顯示，沉默IRX1基因能夠抑制SiHa細胞增殖能力。這與Yu等[24]關(guān)于IRX1能夠調(diào)節(jié)牙釉質(zhì)外上皮和肺泡Ⅱ型上皮細胞增殖和分化的研究類似。PCNA是增殖細胞核抗原，僅存在于增殖細胞和腫瘤細胞中，與細胞中DNA合成密切相關(guān)，且能夠啟動細胞增殖，是反映細胞處于增殖狀態(tài)的良好指標[25]。Cyclin D1是一類細胞周期蛋白，其在進化上高度保守，能夠促進細胞增殖，且在細胞周期調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用[26]。本研究顯示，沉默IRX1基因后SiHa細胞中PCNA和Cyclin D1蛋白表達下調(diào)，提示沉默IRX1對SiHa細胞增殖抑制作用可能與下調(diào)PCNA和Cyclin D1的表達有關(guān)。此外流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，沉默IRX1基因能夠阻滯細胞周期進程并促進細胞凋亡。BAX和BCL-2屬于BCL-2蛋白家族，在細胞凋亡過程中扮演重要角色[27]。BAX是主要的凋亡促進因子，其編碼的BAX蛋白可與BCL-2結(jié)合形成異二聚體，當(dāng)BAX含量增多時可阻抑BCL-2對細胞的保護作用誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡[28]。本研究顯示，沉默IRX1基因能夠上調(diào)SiHa細胞中BAX的表達，下調(diào)BCL-2的表達，表明沉默IRX1基因可能通過上調(diào)BAX的表達及下調(diào)BCL-2的表達促進SiHa細胞凋亡。

綜上所述，本研究表明沉默IRX1基因能夠抑制宮頸癌SiHa細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，其潛在作用機制可能與調(diào)控PCNA、Cyclin D1、BAX和BCL-2的表達有關(guān)。然而，IRX1在宮頸癌中的確切作用機制尚不清楚，仍有待進一步探究。隨著對IRX1的不斷深入了解，相信IRX1有可能成為宮頸癌診斷和治療的潛在作用靶點。

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（收稿日期：2019-11-25）

（本文編輯：林燕薇）