豬鏈球菌2型滅活疫苗對小鼠的免疫效果評價(jià)

段倩倩，毛天驕，韓業(yè)芹，韓雪姣，魏建忠，孫 裴，李 郁

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036)

豬鏈球菌(Streptococcussuis，SS)是一類重要的人獸共患病原菌，不僅可引起豬的關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、敗血癥、心肌炎和突發(fā)性死亡，還能感染相關(guān)人員，引起人腦膜炎、感染性休克、甚至死亡，威脅公共衛(wèi)生及食品安全。根據(jù)細(xì)胞壁莢膜多糖抗原特性的不同可將其分為35個(gè)血清型(1-34型和1/2型)，其中1、2、7、9型為致病型，且以豬鏈球菌2型(Streptococcussuisserotype 2，SS2)的致病性最強(qiáng)，在我國的流行范圍最廣，且易與其他細(xì)菌或病毒混合感染，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。

豬鏈球菌的防治主要依靠疫苗接種[2]。臨床上常用的豬鏈球菌病疫苗包括滅活疫苗、弱毒疫苗和基因工程亞單位疫苗。弱毒疫苗免疫效果強(qiáng)且持久，但是運(yùn)輸、保存條件要求高，毒力易返祖，安全性差；基因工程亞單位疫苗抗原性差。滅活疫苗具有安全性強(qiáng)、研制周期短、易于保存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中被廣泛使用[3]。本研究在前期篩選出2株毒力強(qiáng)、抗原性好、遺傳穩(wěn)定的SS2疫苗菌株(HF2、HF3株)并分別制成滅活疫苗(采用ISA 201 VG礦物油佐劑)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步與商品化滅活疫苗(HA9801株，鋁膠佐劑)同步免疫小鼠，進(jìn)行免疫效果評價(jià)，從而為豬鏈球菌病的防控和聯(lián)合疫苗的研制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗

豬鏈球菌2型滅活疫苗(HF2、HF3疫苗)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室制備。疫苗所用菌株是由本實(shí)驗(yàn)室自臨床病例分離鑒定并通過致病性、抗原性、穩(wěn)定性試驗(yàn)篩選出的2株毒力強(qiáng)、抗原性好、遺傳穩(wěn)定的SS2菌株(HF2、HF3株)，佐劑為ISA 201 VG礦物油佐劑。HF2株對昆明鼠和斑馬魚的半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)分別為5.01×108、0.6×102CFU·mL-1，HF3株對昆明鼠和斑馬魚的LD50分別為3.24×108、2.34×103CFU·mL-1[4]。商品化豬鏈球菌2型滅活疫苗(HA9801株，鋁膠佐劑)購自廣東永順生物制藥股份有限公司(生產(chǎn)批號：2018003)。

1.1.2 攻毒菌株

BZ1株由本實(shí)驗(yàn)室分離自臨床患急性敗血癥病豬，經(jīng)鑒定為SS2強(qiáng)毒株，對昆明鼠和斑馬魚的LD50分別為3.31×108、0.9×102CFU·mL-1。國內(nèi)強(qiáng)毒參考株HA9801、ZY05719對斑馬魚的LD50分別為3.42×105、3.58×105CFU·mL-1[5]。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量18～22 g SPF級雌性昆明鼠購于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.1.4 主要試劑

TMB顯色液、脫脂奶粉購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體購自美國博士德生物工程有限公司；細(xì)胞因子ELISA檢測試劑盒(IL-4、IL-10、IFN-γ、TFN-β、MCP-1)購自美國RB公司；流式細(xì)胞抗體試劑盒購自美國BD公司；胰酪胨大豆酵母浸膏瓊脂(TSA-YE)、純化瓊脂粉均購自紹興天恒生物科技有限公司；甲醛溶液購自上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

取200只小鼠隨機(jī)分為4組(編號為A、B、C、D)，試驗(yàn)組(A-C)各40只，對照組(D)80只。A、B、C組分別頸部皮下注射HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗，每只注射0.2 mL，D組注射等體積生理鹽水。免疫2次，間隔14 d。

1.2.2 血清中IgG抗體水平和細(xì)胞因子測定

小鼠一免14 d和二免7 d后，采集各組小鼠血清，參考文獻(xiàn)[6]方法測定血清中IgG抗體水平，使用試劑盒檢測小鼠血清中細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β、MCP-1)含量。

1.2.3 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群含量測定

于一免14 d和二免7 d后，經(jīng)斷尾處理采集小鼠外周血液，吸取100 μL抗凝血至2 mL無菌離心管，加入1.8 mL紅細(xì)胞裂解液，充分混勻，在4 ℃冰箱中靜置30 min，1 400 r·min-1離心5 min，去上清，加入1.8 mL PBS緩沖液(pH=7.2)反復(fù)吹洗，1 400 r·min-1離心10 s，棄去多余液體，保留約200～300 μL液體和沉淀于管底，吹打混勻，添加熒光標(biāo)記的抗鼠CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞單克隆抗體，將樣品混勻后置4 ℃冰箱避光孵育30 min，用無菌PBS緩沖液(pH 7.2)洗滌孵育后的樣品，2 500 r·min-1離心5 min，棄上清液，加入200～300 μL無菌PBS緩沖液(pH=7.2)，吹打混勻。將各組細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至流式管，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

1.2.4 小鼠攻毒試驗(yàn)

小鼠二免7 d后，A、B、C組各選10只小鼠作為試驗(yàn)組；D組隨機(jī)抽取20只，平均分為2組，分別是攻毒對照組(D1組)和陰性對照組(D2組)。用BZ1株對試驗(yàn)組和攻毒對照組小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，攻毒劑量為4.29×109CFU.mL-1；陰性對照組注射等體積生理鹽水。攻毒后，觀察各組小鼠的精神狀態(tài)、食欲及死亡情況，計(jì)算各組小鼠免疫保護(hù)率。攻毒7 d后，采集小鼠肺、肝、脾和腎臟樣品，置于1.5 mL離心管中，按比例加無菌PBS緩沖液研磨。將組織懸液稀釋至100、10-1、10-2后，分別取100 μL均勻涂布于TSA-YE固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18 h，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。攻毒7 d后，采集小鼠肺、肝、脾和腎臟樣品置于福爾馬林中進(jìn)行固定和保存，送至安徽醫(yī)科大學(xué)制作病理組織切片。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Graphpad Prime 7.0軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清中IgG抗體水平

由表1可知，一免14 d后，各試驗(yàn)組小鼠血清中IgG抗體效價(jià)分別為1∶6 400、1∶6 400、1∶12 800，A組和B組IgG抗體水平最高；二免7 d后，A、B、C組IgG抗體效價(jià)均有不同程度的上升，分別為1∶25 600、1∶12 800、1∶25 600，A組和C組IgG抗體水平最高。

2.2 血清中細(xì)胞因子含量

由圖1可知，二免7 d后，各試驗(yàn)組小鼠血清中細(xì)胞因子含量均顯著(P<0.05)高于對照組。HF2滅活疫苗免疫組(A組)小鼠血清中IL-4、IL-10含量顯著(P<0.05)高于HF3滅活疫苗免疫組(B組)和HA9801商品化滅活疫苗免疫組(C組)，且B組和C組間差異顯著(P<0.05)。A組IFN-γ含量顯著(P<0.05)高于B組，但與C組差異不顯著(P>0.05)。C組TNF-β含量顯著(P<0.05)高于A、B組，且A組和B組差異顯著(P<0.05)。B組MCP-1含量顯著(P<0.05)高于A、C組，但A組和C組差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果顯示，各疫苗組均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高水平的細(xì)胞因子，其中HF2滅活疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生細(xì)胞因子(IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β)的能力優(yōu)于HF3滅活疫苗。

2.3 外周血中T淋巴細(xì)胞亞群含量

表1 小鼠血清中IgG抗體水平

Table 1 Detection of serum IgG antibody in mice

組別一免14 d后二免7 d后Group14 days after the firstimmunization 7 days after the secondimmunizationA1∶64001∶25600B1∶64001∶12800C1∶128001∶25600

不同柱上無相同小寫字母的表示差異顯著(P<0.05)。下同。 Bars marked without the same letters indicated significant (P<0.05) difference. The same as below.圖1 小鼠血清中細(xì)胞因子含量Fig.1 Determination of serum cytokine levels after immunization of mice

由圖2可知，一免14 d后，各試驗(yàn)組CD4+/CD3+、CD8+/CD3+均顯著(P<0.05)高于對照組。二免7 d后，各試驗(yàn)組CD8+/CD3+呈上升趨勢。其中，HA9801商品化滅活疫苗免疫組(C組)小鼠外周血中CD4+/CD3+顯著(P<0.05)高于HF2滅活細(xì)胞免疫組(A組)和HF3滅活疫苗免疫組(B組)，但A組和B組差異不顯著(P>0.05)；各試驗(yàn)組CD8+/CD3+呈上升趨勢，但組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 小鼠存活率

攻毒對照組(D1組)小鼠均死亡，陰性對照組(D2組)小鼠均存活。各試驗(yàn)組中，A、B、C組的免疫保護(hù)率均為100%。結(jié)果表明，HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗免疫小鼠均能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力。

2.5 內(nèi)臟組織荷菌數(shù)測定結(jié)果

由圖3可知，各試驗(yàn)組小鼠組織器官的細(xì)菌定植量均顯著(P<0.05)低于攻毒對照組(D1組)。HF2滅活疫苗免疫組(A組)小鼠肺臟的細(xì)菌定植量顯著(P<0.05)低于HF3滅活疫苗免疫組(B組)和HA9801商品化滅活疫苗免疫組(C組)。各試驗(yàn)組肝臟、腎臟的細(xì)菌定植量差異不顯著(P>0.05)。A、C組脾臟的細(xì)菌定植量均顯著(P<0.05)低于B組。結(jié)果表明，滅活疫苗免疫組小鼠均能有效清除SS2在體內(nèi)的定植。

圖2 小鼠外周血中CD4+、CD8+細(xì)胞亞群在總T細(xì)胞中所占百分比Fig.2 The percentage of CD4+， CD8+ T subsets in CD3+ T cells in peripheral blood of mice

2.6 病理組織學(xué)觀察結(jié)果

各處理組小鼠組織病理學(xué)觀察結(jié)果見圖4-7。攻毒對照組(D1組)病變最為顯著，表現(xiàn)為：肺臟充血，肺泡壁增厚，可見明顯的炎癥細(xì)胞浸潤；肝臟整體結(jié)構(gòu)異常，肝細(xì)胞排列紊亂，固縮壞死，肝竇間隙輕微增大；脾臟整體結(jié)構(gòu)異常，紅髓白髓分界不清，玻璃樣變；腎小管上皮細(xì)胞脫落水腫，組織間輕微瘀血，大量炎癥細(xì)胞浸潤。陰性對照組(D2組)無明顯病理變化。

圖3 攻毒小鼠各組織器官中的含菌量Fig.3 Bacterial survival in mouse blood and organs after infection

圖4 各組小鼠肺臟病理組織學(xué)變化(HE染色，10×20)Fig.4 Pathological changes of lung in mice of each group (HE staining， 10×20)

各試驗(yàn)組中，A、B、C組的肺、肝、脾、腎臟均有不同程度的病變。其中，A組肺、肝臟均有輕微充血，肝、脾、腎臟均可見少量炎癥細(xì)胞浸潤；B組肺、肝、脾、腎臟均可見不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤，肺臟輕微充血且肺泡壁輕微增厚，腎臟組織間輕微瘀血；C組肺、肝臟均輕微充血且有少量炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡壁輕微增厚，肝臟竇間隙輕微增寬，脾臟可見明顯中性粒細(xì)胞浸潤，腎臟組織間質(zhì)明顯瘀血，少量腎小管上皮細(xì)胞脫落水腫。

3 討論

豬鏈球菌病是一種重要的人畜共患病，而豬鏈球菌(SS)是引起該病最主要的病原。在SS的35個(gè)血清型中，SS2最為常見，流行最廣且致病性最強(qiáng)。疫苗免疫接種是預(yù)防和控制豬鏈球菌病傳播的有效措施。滅活疫苗具有研制周期短、安全可靠、易于保存等優(yōu)點(diǎn)，因此在生產(chǎn)實(shí)際中使用最為廣泛。

圖5 各組小鼠肝臟病理組織學(xué)變化(HE染色，10×20)Fig.5 Pathological changes of liver in mice in each group (HE staining， 10×20)

圖6 各組小鼠脾臟病理組織學(xué)變化(HE染色，10×20)Fig.6 Pathological changes of spleen in mice of each group (HE staining， 10×20)

圖7 各組小鼠腎臟病理組織學(xué)變化(HE染色，10×20)Fig.7 Pathological changes of kidney in mice of each group (HE staining， 10×20)

滅活疫苗的免疫效果與其制苗菌株的免疫學(xué)特性密切相關(guān)。同一血清型的不同SS菌株生物學(xué)特性和致病力存在差異[7]，因此用其制備的滅活疫苗免疫效果也存在差異，從而導(dǎo)致生產(chǎn)實(shí)際中免疫失敗或免疫不確實(shí)。除此之外，滅活疫苗的免疫效果還與滅活佐劑類型有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)室自臨床病例分離鑒定43株SS2，通過毒力因子鑒定、溶血性測定、昆明鼠及斑馬魚致病性試驗(yàn)篩選出6株強(qiáng)毒株，進(jìn)一步通過菌株致病性試驗(yàn)、抗原性試驗(yàn)和穩(wěn)定性試驗(yàn)，篩選出2株毒力強(qiáng)、抗原性好、遺傳學(xué)上相對穩(wěn)定的疫苗菌株(HF2、HF3)，并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。為提高和保障制備的SS2滅活疫苗的良好抗原性，對疫苗菌株甲醛滅活條件和免疫佐劑進(jìn)行優(yōu)化、篩選，最終采用ISA 201 VG礦物油佐劑分別將其制備成滅活疫苗。為確定所研制的SS2滅活疫苗(HF2、HF3株，ISA 201 VG礦物油佐劑)的免疫效果，本研究將其與HA9801商品化滅活疫苗(HA9801株，鋁膠佐劑)同步免疫小鼠，進(jìn)行免疫效果評價(jià)。

體液免疫應(yīng)答是清除細(xì)胞外病原體的有效機(jī)制之一，也是評價(jià)疫苗免疫效果的一個(gè)重要指標(biāo)。IgG抗體是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，在機(jī)體抗感染過程中發(fā)揮主力作用[9-10]。本研究中，HF2滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗免疫小鼠后產(chǎn)生的IgG抗體效價(jià)均為1∶25 600，顯著高于HF3滅活疫苗，表明HF2滅活疫苗通過誘導(dǎo)IgG抗體來介導(dǎo)體液免疫的能力與HA9801商品化滅活疫苗相同，且優(yōu)于HF3滅活疫苗。

細(xì)胞因子是一類具有多功能的蛋白分子，主要介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，因此細(xì)胞因子水平可反映機(jī)體的免疫功能狀態(tài)[11]。Th細(xì)胞是產(chǎn)生細(xì)胞因子的重要細(xì)胞，根據(jù)其分泌性質(zhì)及功能的差異，分為Th1和Th2細(xì)胞。Th1細(xì)胞可通過分泌IFN-γ、TNF-β等，介導(dǎo)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、遲發(fā)型超敏反應(yīng)T細(xì)胞的增殖分化，從而促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答。Th2細(xì)胞分泌的IL-4、IL-10等細(xì)胞因子與B細(xì)胞增殖、分化及抗體生成有關(guān)，因此可增強(qiáng)機(jī)體體液免疫應(yīng)答[12-14]。MCP-1可趨化單核巨噬細(xì)胞，既能介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，也能促進(jìn)細(xì)胞免疫應(yīng)答[15]。本研究中，二免7 d后HF2滅活疫苗組的IL-4、IL-10含量均顯著高于HA9801商品化滅活疫苗組，TNF-β含量顯著低于HA9801商品化滅活疫苗組。此外，HF2滅活疫苗組的IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-β細(xì)胞因子水平均顯著高于HF3滅活疫苗組，而MCP-1細(xì)胞因子水平顯著低于HF3滅活疫苗組。結(jié)果表明，HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗在通過誘導(dǎo)不同細(xì)胞因子來介導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答方面各有優(yōu)勢，單就HF2和HF3滅活疫苗而言，HF2滅活疫苗誘導(dǎo)Th1、Th2型免疫反應(yīng)的能力優(yōu)于HF3滅活疫苗。

T細(xì)胞是機(jī)體免疫應(yīng)答的核心細(xì)胞，基于其白細(xì)胞分化抗原的不同分為CD4+和CD8+兩大亞群[16]。CD4+T細(xì)胞可促進(jìn)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，誘導(dǎo)輔助性T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞成熟，釋放多種淋巴因子誘發(fā)炎癥，排除抗原。CD8+T細(xì)胞可抑制B細(xì)胞產(chǎn)生抗體和其他T細(xì)胞分化增殖，從而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，也可在免疫效應(yīng)階段識(shí)別并溶解靶細(xì)胞[3]。有研究表明，CD4+、CD8+T細(xì)胞與細(xì)胞免疫水平呈正相關(guān)。本研究中，HF2和HF3滅活疫苗組的CD4+T細(xì)胞比率均顯著低于HA9801商品化滅活疫苗組，而HF2與HF3滅活疫苗組間無顯著性差異，且HF2、HF3滅活疫苗組和HA9801商品化滅活疫苗組的CD8+T細(xì)胞比率無顯著性差異。結(jié)果表明，HA9801商品化滅活疫苗誘導(dǎo)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的能力優(yōu)于HF2和HF3滅活疫苗，而HF2滅活疫苗與HF3滅活疫苗誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力相同。

SS2是一種常見的豬呼吸道疾病病原體，常定植于扁桃體而不致病。當(dāng)機(jī)體抵抗力下降時(shí)，SS2從扁桃體向周圍淋巴組織擴(kuò)散，進(jìn)入血液，侵襲不同組織器官，進(jìn)而引起炎癥，使機(jī)體相應(yīng)部位發(fā)生病變，造成損失或死亡。本研究對二免14 d后小鼠進(jìn)行腹腔攻毒，通過測定攻毒保護(hù)率、組織荷菌數(shù)及分析病理組織學(xué)變化，評價(jià)SS2滅活疫苗的免疫保護(hù)效果。研究發(fā)現(xiàn)，HF2、HF3滅活疫苗和HA9801商品化滅活疫苗均能產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)力。攻毒后，HF2滅活疫苗免疫組小鼠肺臟的細(xì)菌定植量顯著低于HA9801商品化滅活疫苗免疫組，且肺、脾、腎臟的病理變化均較HA9801商品化滅活疫苗組輕微。此外，HF2滅活疫苗組小鼠肺、脾臟的組織荷菌數(shù)均顯著低于HF3滅活疫苗組，且HF3滅活疫苗組小鼠的肺、肝、脾臟均有不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤，腎臟組織輕微瘀血，較HF2滅活疫苗組的病理變化更明顯。結(jié)果表明，HF2滅活疫苗清除肺臟SS2定植且保護(hù)各臟器不受侵害的能力優(yōu)于HA9801商品化滅活疫苗和HF3滅活疫苗。

綜合上述，由SS2(HF2株)制備的ISA 201 VG佐劑滅活疫苗免疫小鼠后不僅可產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，還可完全抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。本研究為豬鏈球菌病滅活疫苗的優(yōu)化篩選及多聯(lián)、多價(jià)疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。