畢亞玲，戴玲玲，谷 剛，李君君

(1.安徽科技學院 農(nóng)學院，安徽 鳳陽 233100； 2.安徽科技學院 資源與環(huán)境學院，安徽 鳳陽 233100)

日本看麥娘(Alopecurusjaponicus)是冬小麥田主要的惡性雜草之一[1]，生產(chǎn)上主要使用精噁唑禾草靈和甲基二磺隆來防治日本看麥娘[2-3]。近年來，由于長期單一地使用精噁唑禾草靈，多個地區(qū)小麥田日本看麥娘對其產(chǎn)生較高的抗藥性。甲基二磺隆對部分抗乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)抑制劑類除草劑的日本看麥娘具有較好的防除效果[4]，但近年來已有日本看麥娘等禾本科雜草對其產(chǎn)生抗性的報道[5-7]。雜草的抗藥性主要是由靶標和非靶標2個方面的因素產(chǎn)生[8-9]。靶標抗性主要是指植株體內(nèi)除草劑作用靶標的某個位點發(fā)生突變導致的抗藥性[10]。王凌越[11]研究發(fā)現(xiàn)，6種氨基酸突變會導致日本看麥娘對精噁唑禾草靈產(chǎn)生抗藥性，并對相同作用機理的其他ACCase抑制劑產(chǎn)生抗性。非靶標抗性主要是指雜草通過提高體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)和細胞色素P450氧化酶等代謝酶的活性，導致到達靶標位點的藥劑減少，從而形成抗性[12-15]。韓瑞娟等[16]、裴濤[17]研究發(fā)現(xiàn)，GSTs活性增強可導致日本看麥娘對除草劑產(chǎn)生抗性。

目前安徽、江蘇、河南等省稻茬麥田日本看麥娘對精噁唑禾草靈和甲基二磺隆的敏感性明顯下降，主要表現(xiàn)為田間施用劑量明顯上升，但防治效果不好[7，18]。為從源頭上了解抗性發(fā)生的原因，建立針對性的抗性雜草治理策略，延緩雜草抗藥性的發(fā)展，本試驗擬擴增和比對ACCase和乙酰乳酸合成酶(ALS)基因在日本看麥娘抗性、敏感種群的序列差異，明確靶標抗性機理；通過測定比較日本看麥娘敏感種群與抗性種群中GSTs活性，探究日本看麥娘抗性種群的非靶標抗性機理；研究日本看麥娘抗性種群對多種ACCase和ALS抑制劑的交互抗性，評價其對不同除草劑的敏感性，為抗性日本看麥娘的綜合治理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試雜草種子：抗性種群AFT采自安徽省六安市壽縣安豐塘鎮(zhèn)約有12 a精噁唑禾草靈和7 a甲基二磺隆用藥歷史的冬小麥田。敏感種群AH-7為本實驗室已報道的日本看麥娘敏感種群[19]，采自安徽省滁州市鳳陽縣非麥田。試驗前期使用整株水平測定法[20]測定抗性種群AFT對精噁唑禾草靈和甲基二磺隆的抗性倍數(shù)，分別為44.33和34.43。

試劑：Tris-HCl，上海試劑公司；十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate，SDS)、乙二胺四乙酸二鈉(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na)，無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；二硫蘇糖醇(DTT)、交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)、聚乙烯比咯烷酮(PVP-40)，上海麥克林生化科技有限公司；還原型谷胱甘肽(GSH)，湖北弘景化工有限公司；2，4-二硝基氯苯(CDNB)，上海浩然生物技術(shù)有限公司。

試驗所用除草劑：60 g·L-1精噁唑禾草靈(fenoxaprop-P-ethyl)水乳劑，浙江天豐生物科學有限公司；30 g·L-1甲基二磺隆(mesosulfuron-methyl)可分散油懸浮劑，浙江天一生物科技有限公司；15%炔草酯(clodinafop-propargyl)可濕性粉劑，瑞士先正達作物保護有限公司；86.5%烯草酮(clethodim)原藥，山東濱農(nóng)科技有限公司；5%唑啉草酯(pinoxaden)乳油，瑞士先正達作物保護有限公司；70%氟唑磺隆水分散粒劑，浙江天一生物科技有限公司；240 g·L-1甲咪唑煙酸(imazapic)水劑，美豐農(nóng)化有限公司；100 g·L-1雙草醚(bispyribac-sodium)懸浮劑，浙江天豐生物科學有限公司。

儀器：生化培養(yǎng)箱SHP-250，上海坤肯生物化工有限公司；HCL-2000行走式噴霧塔，昆山恒創(chuàng)力科技有限公司；ABI 2720 PCR儀，美國Applied Biosystems公司；H1650R高速冷凍離心機，上海翼悾機電有限公司；JY600E電泳儀，北京君意東方電泳設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)

選取種子健康狀況、成熟度、飽滿度等相對一致的日本看麥娘種子，75%乙醇清洗后無菌水漂洗3次，均勻撒在培養(yǎng)皿中無菌水潤濕的濾紙上，置于19 ℃生化培養(yǎng)箱中催芽。種子露白后，將其播種到裝有壤土的直徑為12 cm的塑料花盆中，每盆均勻播種15粒。然后置于溫室內(nèi)培養(yǎng)[20 ℃～25 ℃/10 ℃～15 ℃，12 h/12 h(L/D)]，相對濕度65%～75%，自然光照強度。于一葉一心期間苗，每盆留10株株高相近、生長狀況良好的幼苗繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 日本看麥娘種群ACCase和ALS基因克隆

日本看麥娘的質(zhì)體ACCase和ALS基因片段沒有內(nèi)含子，故直接以DNA為模板進行擴增。將日本看麥娘培養(yǎng)至三葉一心期，剪取抗性、敏感種群植株的幼嫩葉片，-80 ℃保存。采用SDS法提取DNA[21]。根據(jù)NCBI中GenBank登記的日本看麥娘Alopecurusjaponicus質(zhì)體型ACCase基因序列(JQ068820.1)和ALS基因序列(AJ437300)分別設計ACCase和ALS基因的擴增引物，進行PCR擴增，擴增引物如表1所示。凝膠電泳鑒定后將PCR產(chǎn)物送往公司測序，對測序結(jié)果進行分析。

1.2.3 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測定

日本看麥娘三葉一心期時，使用HCL-2000行走式噴霧塔分別進行精噁唑禾草靈(有效成分含量62.1 g·hm-2)、甲基二磺隆(有效成分含量9.0 g·hm-2)莖葉噴霧處理，噴霧量450 L·hm-2。藥劑用蒸餾水配制成母液，以噴施等量清水作為對照處理，每處理4次重復。施藥后繼續(xù)置于溫室內(nèi)培養(yǎng)，藥后第0、1、3、5、7和12天剪取植株地上部分，置于-80 ℃冰箱保存。

表1 擴增日本看麥娘質(zhì)體型ACCase和ALS基因引物

Table 1 Primers used to amplifyACCaseandALSgene ofA.japonicus

引物Primers序列Sequence(5′-3′)擴增長度Length/bp退火溫度Annealingtemperature/℃ACC-FTTTCCCAGCGGCAGACAGAT143755.0ACC-RTCCCTGGAGTCTTGCTTTCAALS-FTCACCAACCACCTTTTCCG165956.0ALS-RCACATTGCACCTTTAGGTCT

GSTs粗酶液提取：取植株組織0.5 g，在液氮中研磨成粉，加入Tris-Hcl緩沖液，參照文獻[16]的方法提取GSTs粗酶液。

GSTs活性測定：根據(jù)吳進才等[22]的方法，在3 mL 0.1 mol·L-1Tris-Hcl緩沖液中加入0.1 mol粗酶液，25 ℃條件下保溫10 min，加入13 mmol·L-1的2，4-二硝基氯苯(CDNB)，反應10 min，測量340 nm處的吸光度D值。以未加粗酶液的處理為對照，檢測數(shù)據(jù)為處理的D值減去對照的D值。按照如下公式計算GSTs活性。

GSTs活性(nmol·min-1·mg-1)=D×1000/(c×9.5)。

式中：D為吸光度，c為粗酶液的蛋白質(zhì)濃度(mg·mL-1)。GSTs相對活性為施藥組GSTs活性與同日空白對照組GSTs活性的比值。

1.2.4 AFT種群對不同除草劑的交互抗性測定

測定種群AFT和AH-7對炔草酯、烯草酮、唑啉草酯、甲咪唑煙酸、氟唑磺隆、雙草醚的敏感性和抗性倍數(shù)。日本看麥娘培養(yǎng)至三葉一心期，使用HCL-2000行走式噴霧塔分別進行除草劑噴霧處理，施藥方法參照1.2.3節(jié)，除草劑使用劑量見表2，以等量蒸餾水處理為空白對照，各處理3次重復。施藥后21 d剪取日本看麥娘植株地上部分，于80 ℃烘箱中烘干至質(zhì)量不再發(fā)生變化，稱干質(zhì)量，計算干質(zhì)量抑制率。以劑量對數(shù)值(x)和干質(zhì)量抑制率(y)建立回歸方程，分別計算各除草劑對抗性種群和敏感種群的有效中量GR50，計算AFT種群對不同除草劑的抗性倍數(shù)。

干質(zhì)量抑制率(%)=[(對照雜草干質(zhì)量-處理雜草干質(zhì)量)/對照雜草干質(zhì)量]×100；

2 結(jié)果與分析

2.1 AFT種群中ACCase和ALS的基因突變

表2 除草劑的有效成分用量

Table 2 Active ingredients doses used for determining the sensitivity ofAlopecurusjaponicusto different herbicides g·hm-2

處理Treatments炔草酯Clodinafop-propargylAFTAH-7烯草酮ClethodimAFTAH-7唑啉草酯PinoxadenAFTAH-7甲咪唑煙酸ImazapicAFTAH-7氟唑磺隆Flucarbazone-NaAFTAH-7雙草醚Bispyribac-sodiumAFTAH-7處理145.001.8072.002.8845.001.8024.008.0031.501.9510.003.00Treatment 1處理2225.009.00360.0014.40225.009.0072.0024.00126.007.8030.0010.00Treatment 2處理31125.0045.001800.0072.00900.0045.00360.0072.00504.0031.50150.0030.00Treatment 3

在種群AFT和AH-7中擴增ACCase基因的CT區(qū)，將測序結(jié)果與大穗看麥娘(Alopecurusmyosuroides)的ACCase基因序列進行比對。結(jié)果(表3、表4)表明，敏感種群AH-7的ACCase基因CT區(qū)2027位氨基酸為色氨酸(TGG)，抗性種群AFT的該位置為半胱氨酸(TGC)；敏感種群AH-7在ALS基因的574位氨基酸為色氨酸(TGG)，抗性種群AFT在該位置為精氨酸(CGG)。

2.2 精噁唑禾草靈、甲基二磺隆對日本看麥娘GSTs活性的影響

圖1-A顯示，精噁唑禾草靈藥劑處理1 d，抗性種群AFT的GSTs活性開始增強，處理3～7 d GSTs活性增加較快，并在第7天達到最高，表明此時抗性植株體內(nèi)的代謝反應水平被精噁唑禾草靈誘導至最高。處理12 d抗性植株GSTs活性下降，可能是由于植株體內(nèi)對精噁唑禾草靈的代謝趨于完成，代謝反應水平開始恢復為正常水平。敏感種群AH-7在藥后第1～5 d GSTs活性變化平緩，藥后5～7 d GSTs活性增強，隨后又開始減弱，可能是受到藥劑影響或者外界環(huán)境脅迫引起的應激反應。

表3 日本看麥娘抗性種群質(zhì)體型ACCase第2027位的氨基酸突變序列分析

Table 3 Sequence alignment and derived amino acids around position 2027 of the plastidicACCasegene from resistantA.japonicuspopulation

種群Population各氨基酸的位置和堿基及相應的氨基酸序列Amino acid position, relative sequence of nucleotide and derived amino acid2021202220232024202520262027202820292030大穗看麥娘CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTCAlopecurus myosuroidesLeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPheAH-7(S)CTGTTCATACTTGCTAACTGGAGAGGCTTCLeuPheIleLeuAlaAsnTrpArgGlyPheAFT(R)CTGTTCATACTTGCTAACTGCAGAGGCTTCLeuPheIleLeuAlaAsnCysArgGlyPhe

氨基酸位數(shù)以大穗看麥娘的質(zhì)體型ACCase全長序列為標準。

Amino acid positions correspond to the full-length plastidicACCaseinA.myosuroides.

表4 日本看麥娘抗性種群ALS第574位氨基酸突變序列分析

Table 4 Sequence alignment and derived amino acids around position 574 of theALSgene from resistantA.japonicuspopulation

種群Population各氨基酸的位置和堿基及相應的氨基酸序列The amino acid position, relative sequence of nucleotide and derived amino acid573574575576577578579580581582擬南芥Arabidopsis thalianaCAATGGGAAGATCGGTTCTACAAAGCTAACGlnTrpGluAspArgPheTyrLysAlaAsnAH-7 (S)CAGTGGGAGGACAGGTTTTACAAGGCCAATGlnTrpGluAspArgPheTyrLysAlaAsnAFT (R)CAGCGGGAGGACAGGTTTTACAAGGCCAATGlnArgGluAspArgPheTyrLysAlaAsn

氨基酸位數(shù)以模式植物擬南芥的ALS全長序列為標準。

Amino acid positions correspond to the full-lengthALSinArabidopsisthaliana.

圖1-B顯示：甲基二磺隆藥劑處理后1～3 d抗性種群AFT的GSTs活性緩慢增強，說明抗性植株體內(nèi)代謝反應水平開始被誘導升高；藥后3～7 d GSTs活性增加較快，并在第7 d達到最大，表明在此時植株體內(nèi)的代謝反應水平被甲基二磺隆誘導至最高；藥后7～12 d，抗性種群AFT的GSTs活性開始減弱，可能是由于植株體內(nèi)對甲基二磺隆的代謝趨于完成，代謝反應水平恢復至正常水平。甲基二磺隆藥劑處理后1～3 d敏感種群AH-7的GSTs活性變化緩慢，藥后3 d GSTs活性開始減弱，隨后又有增強，在第7天達到最強，12 d又下降。這可能是由于藥劑或者外界環(huán)境脅迫引起的應激反應，導致GSTs活性出現(xiàn)波動，具體原因還需要進一步的研究。

綜合來看，經(jīng)精噁唑禾草靈和甲基二磺隆藥劑處理后，日本看麥娘抗性種群AFT的GSTs活性高于敏感種群AH-7，說明與敏感種群相比，抗性種群體的GSTs對精噁唑禾草靈和甲基二磺隆的代謝能力增強。

2.3 AFT種群對不同除草劑的交互抗性

表5結(jié)果顯示，AFT種群對炔草酯、烯草酮和氟唑磺隆的抗性倍數(shù)分別為27.90、34.43、10.30，表現(xiàn)出高水平的抗性；對唑啉草酯、甲咪唑煙酸、雙草醚的抗性倍數(shù)分別為5.49、6.42、5.01，表現(xiàn)為中等水平抗性。

同一種群無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。 Data marked without the same lowercase letter of the same populations indicated significant differences at P<0.05.圖1 精噁唑禾草靈(A)和甲基二磺隆(B)對日本看麥娘種群GSTs相對活性的影響Fig.1 Effect of fenoxaprop-P-ethyl (A) and mesosulfuron-methyl (B) on relative GSTs activity of Alopecurus japonicas

表5 AFT種群對不同除草劑的交互抗性

Table 5 Cross-resistance in resistant and susceptibleAlopecurusjaponicuspopulations to different herbicides

藥劑Herbicide種群Population回歸方程Regression equationr有效中量GR5095%的置信區(qū)間95% confidence limit抗性倍數(shù)Resistance ratio炔草酯AFTy=3.2273+0.7097x0.9674310.28291.97～328.5927.90clodinafop-propargylAH-7y=3.6916+1.2568x0.990011.1210.76～11.481.00烯草酮AFTy=1.8733+1.1165x0.9993637.30595.12～679.4834.43clethodimAH-7y=2.9131+1.6581x0.997918.5117.19～19.831.00唑啉草酯AFTy=2.2586+1.5057x0.994966.4860.11～72.855.49pinoxadenAH-7y=3.4952+1.3662x0.959612.1111.80～12.421.00甲咪唑煙酸AFTy=1.6393+1.4826x0.9739184.06173.14～194.986.42imazapicAH-7y=2.3813+1.8020x0.974928.6526.24～31.061.00氟唑磺隆AFTy=1.8331+1.5898x0.986198.1788.47～107.8710.30flucarbazone-NaAH-7y=3.5739+1.4546x0.98519.538.56～10.501.00雙草醚AFTy=1.8561+1.5380x0.9980110.69100.58～120.805.01bispyribac-sodiumAH-7y=3.4924+1.1222x0.956522.1020.48～23.721.00

3 討論

目前研究表明，雜草的抗藥性主要與靶標酶基因突變有關(guān)。Guo等[23]報道，在多抗性看麥娘中同時檢測到了ACCase基因Ile-1781-Leu和ALS基因Trp-574-Leu 2種突變。本研究使用的抗性日本看麥娘種群AFT采自安徽省六安市壽縣安豐塘鎮(zhèn)，其對精噁唑禾草靈、甲基二磺隆的抗性均較高，屬于多抗性種群。經(jīng)試驗測定，多抗性日本看麥娘種群AFT的靶標酶基因中同時發(fā)現(xiàn)ACCase基因CT區(qū)基因和ALS基因2種突變類型，這可能是導致種群AFT對二者產(chǎn)生抗性的重要原因。前人研究表明，氨基酸位點突變可能會引起雜草對同一種作用機制的不同除草劑產(chǎn)生交互抗性[24-25]。本試驗中抗性種群AFT對其他除草劑產(chǎn)生了不同水平的交互抗性，對炔草酯、烯草酮、氟唑磺隆均產(chǎn)生了較高水平的抗性，對唑啉草酯、甲咪唑煙酸、雙草醚產(chǎn)生了中等水平抗性。

非靶標抗性也是導致雜草產(chǎn)生抗性的重要原因[26]。有報道證實了部分雜草的抗藥性源自植株內(nèi)細胞色素P450氧化酶系和GSTs活性增強，從而導致對除草劑的代謝增強[17，27-28]。精噁唑禾草靈和甲基二磺隆處理前，AH-7和AFT種群的GSTs活性差異不明顯；藥后7 d，抗性種群AFT的GSTs活性顯著強于敏感種群AH-7，說明經(jīng)除草劑誘導后抗性日本看麥娘種群基于GSTs代謝酶介導的代謝反應水平升高，加快了雜草植株對除草劑的代謝解毒反應，推測抗性種群AFT的多抗性可能與植株體內(nèi)GSTs代謝酶介導的代謝反應機制有關(guān)。本試驗只測定了GSTs活性，對于非靶標抗性方面還需要進行更深入的研究，比如測定P450氧化酶活性對種群AFT敏感性的影響等。

日本看麥娘種群抗藥性的發(fā)生除了與自身的生物學特性有關(guān)外，與發(fā)生地不合理的用藥習慣和種植制度也有很大關(guān)系。日本看麥娘種群的靶標抗性和非靶標抗性，以及對不同種類除草劑交互抗性的研究，對生產(chǎn)實踐中選用不同作用機理的藥劑，減小雜草抗藥性的發(fā)生具有指導意義。農(nóng)業(yè)管理部門應加強對種植戶的農(nóng)技培訓，科學合理使用農(nóng)藥，避免出現(xiàn)單一藥劑連續(xù)使用的情況，同時需要加強對不同作用機理藥劑的開發(fā)與推廣。