李園成，孫 宏，吳逸飛，姚曉紅，沈 琦，湯江武

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)與微生物研究所，浙江 杭州 310021)

我國(guó)作為產(chǎn)棉大國(guó)，每年產(chǎn)生的棉籽數(shù)量巨大。棉籽脫殼后的棉籽仁中蛋白質(zhì)含量約為40%，粗脂肪約占28%。此外，棉籽仁還富含B族維生素和有機(jī)磷等，是優(yōu)良的動(dòng)物飼料資源[1-2]。但其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)不均衡，且含有棉酚等有毒物質(zhì)，這極大地限制了棉籽仁的飼料化應(yīng)用，易造成資源浪費(fèi)[3-4]。

微生物固態(tài)發(fā)酵是改善飼料原料品質(zhì)的有效手段[5]。研究發(fā)現(xiàn)，采用微生物固態(tài)發(fā)酵能改善棉籽粕[6]、豆粕[7]等植物蛋白原料的品質(zhì)，可有效減少或去除發(fā)酵底物中的抗?fàn)I養(yǎng)因子。同時(shí)，發(fā)酵底物中存留有許多酶類和促生長(zhǎng)因子，能改善動(dòng)物的腸道健康[7-9]。但目前相關(guān)研究主要集中在棉籽粕的脫毒和品質(zhì)改良上[10-12]，以棉籽仁為直接研究對(duì)象的報(bào)道還較少?？紤]到棉籽仁的營(yíng)養(yǎng)成分中含有較高的脂肪含量，若能直接使用，可同時(shí)提供蛋白和能量，特采用酵母菌、芽孢桿菌對(duì)棉籽仁進(jìn)行混合固態(tài)發(fā)酵，研究發(fā)酵前后其營(yíng)養(yǎng)成分和抗氧化活性的變化，以期為增強(qiáng)棉籽仁的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值提供新的實(shí)現(xiàn)途徑，也為發(fā)酵棉籽仁的推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌種

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)Yn和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)B1均為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種。

1.1.2 試驗(yàn)原料和試劑

棉籽仁購(gòu)自新疆泰昆集團(tuán)公司，含水率11.6%，粗蛋白含量40.9%，游離棉酚含量9 160 mg·kg-1，粗脂肪含量27.4%。

二丁基羥基甲苯(BHT)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，購(gòu)自Sigma公司；菲洛嗪、乙二胺四乙酸(EDTA)、3-氨基-1-丙醇、鐵氰化鉀、維生素C(VC)均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司。其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

芽孢桿菌B1的培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基；酵母菌Yn采用YPD培養(yǎng)基，參照胡永娜等[8]的方法配置。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵種子液制備

參照孫宏等[13]的方法制備種子液。取芽孢桿菌B1和酵母菌Yn斜面各刮取一環(huán)分別接種于裝有20 mL LB和YPD液體培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中，于30 ℃、180 r·min-1條件下分別搖床培養(yǎng)18 h和24 h，取出備用。

1.2.2 發(fā)酵棉籽仁制備

取棉籽仁100 g于500 mL廣口瓶中，料水比1∶0.45攪拌均勻，于115 ℃處理25 min，取出放涼后分別接種1%(體積質(zhì)量比)的B1種子液和1.5%(體積質(zhì)量比)的Yn種子液，菌體終濃度分別是8×106CFU·g-1和2×106g-1，自然pH條件下混合均勻后放置于30 ℃培養(yǎng)箱發(fā)酵30 h，其間翻料2次，同時(shí)在24、30 h取樣，-20 ℃保存?zhèn)溆?。發(fā)酵完畢后，于50 ℃烘至恒重，粉碎過(guò)60目篩待測(cè)。

1.2.3 發(fā)酵棉籽仁中棉籽肽的提取與制備

參照He等[14]的方法提取發(fā)酵后棉籽仁中的棉籽肽。取5 g發(fā)酵棉籽仁樣品于100 mL離心管中，加入75 mL去離子水，置于搖床上振蕩提取30 min，經(jīng)離心、真空過(guò)濾、超濾、脫鹽，及真空冷凍干燥，得到棉籽肽粗提物(以下簡(jiǎn)稱為棉籽肽)，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分分析測(cè)定

粗蛋白含量采用凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—2003測(cè)定；灰分含量參照GB 5009.4—2010測(cè)定；粗脂肪含量采用索氏提取法，參照GB/T 14772—2008測(cè)定；酸溶蛋白質(zhì)含量采用福林酚法測(cè)定；氨基酸含量由華測(cè)檢測(cè)技術(shù)有限公司檢測(cè)。

1.2.5 抗氧化活性測(cè)定

將棉籽肽配制成質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、8.0 mg·mL-1的溶液，參照Ajibola等[15]的方法測(cè)定羥自由基清除能力，參照孫宏[16]的方法測(cè)定總還原能力，參照Z(yǔ)hang等[17]的方法測(cè)定DPPH自由基清除能力，參照Foh等[18]的方法測(cè)定金屬離子螯合能力。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差分析，對(duì)有顯著(P<0.05)差異的，組間進(jìn)行T檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵前后棉籽仁的營(yíng)養(yǎng)成分變化

2.1.1 常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分

由表1可知，發(fā)酵棉籽仁相比發(fā)酵前游離棉酚含量顯著(P<0.05)降低，粗灰分和酸溶蛋白質(zhì)含量顯著(P<0.05)提高，粗蛋白、粗纖維和粗脂肪含量無(wú)顯著變化。

表1 發(fā)酵前后棉籽仁的營(yíng)養(yǎng)成分組成(風(fēng)干基礎(chǔ))

Table 1 Composition of cottonseed kernel before and after fermentation (air drying basis)

營(yíng)養(yǎng)成分Nutrient發(fā)酵前Beforefermentation發(fā)酵后Afterfermentation 粗蛋白Crude protein/%40.9±0.141.7±0.1粗纖維Crude fiber/%3.9±0.34.8±0.1粗脂肪Crude fat/%27.4±0.127.5±0.4粗灰分Crude ash?/%3.7±0.15.5±0.1游離棉酚Free gossypol?/(mg·kg-1)9 160±208373±41酸溶蛋白質(zhì)Acid soluble protein?/%2.23±0.106.92±0.15

標(biāo)*的表示該成分在發(fā)酵前后差異顯著(P<0.05)。下同。

Item marked with * indicated significant (P<0.05) difference before and after fermentation. The same as below.

2.1.2 氨基酸含量

由表2可知，發(fā)酵后的棉籽仁僅精氨酸含量顯著降低(P<0.05)，其他氨基酸及總氨基酸含量均無(wú)顯著變化。

2.2 棉籽肽的抗氧化活性

2.2.1 羥自由基清除能力

由圖1可知，不同處理時(shí)間(24、30 h)下，棉籽肽的羥自由基清除能力均隨著濃度增加而升高，其中，從發(fā)酵30 h的棉籽仁中提取的棉籽肽羥自由基清除率最高，達(dá)到(61.71 ± 1.59)%。

表2 發(fā)酵前后棉籽仁的氨基酸含量 %

Table 2 Amino acid content of cottonseed kernel before and after fermentation

氨基酸Amino acid發(fā)酵前Before fermentation發(fā)酵后After fermentation 天冬氨酸Asp3.63 ± 0.053.57 ± 0.03蘇氨酸Thr1.26 ± 0.031.34 ± 0.01絲氨酸Ser1.70 ± 0.021.70 ± 0.01谷氨酸Glu7.63 ± 0.117.61 ± 0.03甘氨酸Gly1.63 ± 0.031.62± 0.01丙氨酸Ala1.52 ± 0.031.54 ± 0.01胱氨酸Cys0.63 ± 0.020.63 ± 0.02纈氨酸Val1.53 ± 0.021.63 ± 0.01蛋氨酸Met0.39 ± 0.020.43 ± 0.01異亮氨酸Ile1.21 ± 0.021.29 ± 0.01亮氨酸Leu2.34 ± 0.042.41 ± 0.02酪氨酸Tyr1.09 ± 0.031.21 ± 0.02苯丙氨酸Phe2.10 ± 0.022.20 ± 0.01賴氨酸Lys1.80 ± 0.041.83 ± 0.01組氨酸His1.11 ± 0.021.12 ± 0.01精氨酸Arg?4.70 ± 0.063.91 ± 0.03脯氨酸Pro1.48 ± 0.021.55 ± 0.03總氨基酸Total amino acids35.76 ± 0.4635.90 ± 0.18

圖1 不同發(fā)酵時(shí)間棉籽肽質(zhì)量濃度對(duì)其羥自由基清除率的影響Fig.1 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on hydroxyl scavenging rate

2.2.2 DPPH自由基清除能力

由圖2可知，棉籽肽對(duì)DPPH自由基的清除能力隨著其質(zhì)量濃度的提高而上升。當(dāng)棉籽肽的質(zhì)量濃度為8 mg·mL-1時(shí)，24 h和30 h所提取的棉籽肽的DPPH自由基清除率分別達(dá)到最大值，分別為(65.37 ±1.87)%和(77.25±1.28)%。

2.2.3 金屬離子螯合能力

由圖3可知，棉籽肽的金屬離子螯合能力隨著其質(zhì)量濃度的增加而升高，其中，發(fā)酵30 h的棉籽肽，當(dāng)其質(zhì)量濃度為8 mg·mL-1時(shí)，對(duì)金屬離子的螯合能力最高，可達(dá)到(79.13±0.55)%。

圖2 不同發(fā)酵時(shí)間棉籽肽質(zhì)量濃度對(duì)其DPPH自由基清除率的影響Fig.2 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on DPPH scavenging rate

2.2.4 總還原能力

由圖4可知，發(fā)酵30 h的棉籽肽，當(dāng)其質(zhì)量濃度為8 mg·mL-1時(shí)，總還原能力最強(qiáng)，達(dá)到(0.69±0.02)。

圖3 不同發(fā)酵時(shí)間棉籽肽質(zhì)量濃度對(duì)其金屬離子螯合能力的影響Fig.3 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on metal chelating ability

圖4 不同發(fā)酵時(shí)間棉籽肽質(zhì)量濃度對(duì)其總還原能力的影響Fig.4 Effect of concentration of cottonseed peptide extracted with different fermentation time on reducing power

3 討論

本研究表明，釀酒酵母Yn和枯草芽孢桿菌B1發(fā)酵處理，可顯著降低棉籽仁中游離棉酚的含量，降低其毒性，提高酸溶蛋白質(zhì)含量，改善棉籽仁的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。從中提取的棉籽肽具有較好的抗氧化活性，飼料應(yīng)用前景廣闊。

本研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后棉籽仁的游離棉酚含量較發(fā)酵前顯著降低。這與朱德偉等[2]的研究結(jié)果一致。游離棉酚含量的降低主要由發(fā)酵前原料的滅菌熱脫毒，及微生物發(fā)酵過(guò)程中的生物轉(zhuǎn)化作用引起[2，14]。同時(shí)，發(fā)酵后酸溶蛋白質(zhì)的含量較發(fā)酵前顯著提高，這與韓偉等[12]的研究結(jié)果一致。酸溶蛋白質(zhì)含量的增加主要與微生物產(chǎn)生的蛋白酶分解大分子蛋白有關(guān)[9，19]。研究表明，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物優(yōu)先利用糖類等能量物質(zhì)，間接導(dǎo)致發(fā)酵后物料中粗灰分含量提高[5，20]。Sun等[6]研究發(fā)現(xiàn)，固態(tài)發(fā)酵棉籽粕后，粗脂肪含量顯著下降，與本試驗(yàn)結(jié)果不同，主要原因可能是前述研究中所用的微生物能夠利用脂肪作為能量物質(zhì)來(lái)支持自身的生長(zhǎng)[5]，因而抵消了因能量損耗間接提高的粗脂肪含量。

韓偉等[12]在微生物固態(tài)發(fā)酵和酶解工藝處理棉籽粕的研究中發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵和酶解棉籽粕相比原棉籽粕，氨基酸總量沒(méi)有顯著改變，但精氨酸含量降低1.4%～14.3%。何濤[21]研究報(bào)道，棉籽粕經(jīng)過(guò)混菌發(fā)酵條件優(yōu)化后，精氨酸含量有所下降。上述結(jié)果均與本研究一致。但另一方面，王婷[22]研究表明，棉籽粕經(jīng)過(guò)混菌發(fā)酵后，各種氨基酸含量均有所增加，精氨酸提高了14.25%，與本研究的結(jié)果不同，這可能和2項(xiàng)研究所用的發(fā)酵微生物不同有關(guān)。發(fā)酵微生物的氨基酸利用偏好會(huì)直接影響發(fā)酵后的氨基酸含量變化[5]。

羥自由基是最具反應(yīng)活性的氧自由基之一，能夠造成動(dòng)物機(jī)體內(nèi)生物大分子的損傷，導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)微生物固態(tài)發(fā)酵處理后，棉籽仁中提取的棉籽肽具有羥自由基清除能力，同時(shí)其對(duì)羥自由基的清除能力會(huì)隨著發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)及其濃度增加而上升。此外，棉籽肽的DPPH清除能力、金屬離子螯合能力和總還原能力同樣與其發(fā)酵時(shí)間和使用濃度呈正相關(guān)。孫宏[16]、周向軍等[24]的研究結(jié)果表明，棉籽肽的體外抗氧化活性與其使用量和發(fā)酵時(shí)間均有關(guān)。高丹丹等[25]研究發(fā)現(xiàn)，從棉籽中提取出來(lái)的棉籽肽具有較高的抗氧化活性。

目前，棉籽肽的抗氧化活性主要通過(guò)體外化學(xué)手段進(jìn)行評(píng)價(jià)，動(dòng)物性評(píng)價(jià)研究相對(duì)較少。孫宏[16]研究表明，棉籽肽及其組分A-8可增強(qiáng)胞內(nèi)抗氧化酶的活性，抑制細(xì)胞氧化代謝物的產(chǎn)生，提高RAW264.7氧化損傷細(xì)胞的活性，減少細(xì)胞凋亡；同時(shí)，灌喂2%棉籽肽有助于緩解SD大鼠因飼喂高脂日糧產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，降低血清丙二醛(MDA)含量，提高其肝臟和血清中部分抗氧化酶的活力。Young等[26]研究報(bào)道，抗氧化肽對(duì)不同類別的抗氧化酶有不同的作用效果。張曉羊等[27]研究表明，飼喂6%的嗜酸乳桿菌發(fā)酵棉籽粕可顯著提高黃羽肉雞的平均日均增重，降低料肉比，同時(shí)能夠增強(qiáng)黃羽肉雞對(duì)蛋白質(zhì)、脂肪和Ca等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。以上試驗(yàn)結(jié)果提示，棉籽肽作為抗氧化肽具有一定的應(yīng)用價(jià)值。發(fā)酵棉籽仁飼料應(yīng)用前景廣闊，但是還需要進(jìn)一步開展動(dòng)物養(yǎng)殖試驗(yàn)，以評(píng)價(jià)其應(yīng)用效果。