葉青，吳子健，，侯惠靜，趙培

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700）

二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）屬于ω-3 系列多不飽和脂肪酸，是人體必需脂肪酸之一。眾多研究表明，EPA 對(duì)人體有著重要的調(diào)節(jié)功能，具有抑制血小板的凝集、降血脂及防動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤抑癌、抗炎癥、抑制肥胖等作用[1-6]。目前EPA 主要來(lái)源于魚(yú)油和海洋微藻[7]，其中魚(yú)油作為EPA 的傳統(tǒng)來(lái)源存在諸多問(wèn)題，如：魚(yú)油的脂肪酸成分復(fù)雜，EPA 往往與其它的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFA）共存，難以分開(kāi)，因此從魚(yú)油中提取EPA的工藝復(fù)雜、成本高，且得率低，復(fù)雜的工藝也影響EPA 產(chǎn)品的穩(wěn)定性[8-10]。而海洋微藻是多不飽和脂肪酸的初級(jí)生產(chǎn)者，通常產(chǎn)生EPA 的藻株細(xì)胞不產(chǎn)生二十二碳六烯酸（docosahexenoic acid，DHA）等多不飽和脂肪酸，EPA 含量也遠(yuǎn)高于魚(yú)油，且產(chǎn)EPA 的海洋微藻的脂肪酸組成簡(jiǎn)單、產(chǎn)EPA 的得率高、純化工藝也簡(jiǎn)單[11-13]。EPA 結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 EPA 分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 Molecule structure of EPA

小球藻（Chlorella）為綠藻門(mén)、小球藻屬的一類海洋微藻[14-15]，其中小球藻C95 和小球藻C97 的EPA 含量很高，占總脂肪酸28%以上[16]。小球藻的生長(zhǎng)不僅受溫度、光照、pH 值等的影響，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)鹽組成以及濃度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)具有顯著影響[17-18]。而且眾多研究發(fā)現(xiàn)[16，19]，通常處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期時(shí)小球藻的EPA 含量最高，可通過(guò)優(yōu)化小球藻生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)加快藻種收獲期的到來(lái)提高EPA 的產(chǎn)量。目前已有的普通基礎(chǔ)培養(yǎng)基雖可適合大部分微藻的培養(yǎng)，但是難以準(zhǔn)確應(yīng)對(duì)不同小球藻株系間的生長(zhǎng)繁殖差異性，因而需要對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化。

本研究在f/2 培養(yǎng)基[15]的基礎(chǔ)上，利用正交法優(yōu)化適合于小球藻C95 和小球藻C97 生長(zhǎng)繁殖的培養(yǎng)基，且進(jìn)行了15 L 規(guī)模培養(yǎng)，測(cè)定了所收獲的干藻粉的EPA 含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小球藻C95 和C97 均來(lái)自中國(guó)海洋大學(xué)微藻種質(zhì)庫(kù)（Microalgae Culture Center，MACC）。

EPA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品：Sigma 公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

CCA-1112A 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海愛(ài)朗儀器有限公司；LRH-250-Ⅱ微電腦控制生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；SPX-100B-D 型振蕩培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JA4103A 電子天平：上海精天電子儀器有限公司；AIR TECH 型潔凈工作臺(tái)：蘇凈集團(tuán)安泰公司；FDU-810 型EYELA 冷凍干燥機(jī)：日本東京理化公司；HVE-50 高壓蒸汽滅菌鍋：日本Hirayama 公司；YS100 尼康雙目光學(xué)顯微鏡：日本Nikon 公司；AOC-20i 氣相色譜儀：日本SHIMADZU 公司；DF-101S 集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鞏義市英峪高科儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵：河南省予華儀器有限公司；UV5 紫外分光光度計(jì)：METTLER TOLEDO；A-vanti J-E 多用途高效離心機(jī)：美國(guó)Beckman 公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 f/2 培養(yǎng)基的配制

參照江懷真的方法[15]并做調(diào)整。人工海水（配置試劑及其濃度為：0.664 g/L KCl、0.003 g/L NaF、0.026 g/L H3BO3、3.917 g/L Na2SO4、1.102 g/L CaCl2、0.096 g/L KBr、0.024 g/L SrCl2·6H2O、4.981 g/L MgCl2·6H2O、0.192 g/L NaHCO3、23.476 g/L NaCl）中依次加入 6 種營(yíng)養(yǎng)鹽（營(yíng)養(yǎng)鹽濃度為：微量元素母液1 mL/L、維生素母液1 mL/L、NaH2PO4·2H2O 5.72 g/L、Na2SiO3·9H2O 11 g/L、NaNO374.8 g/L、FeC6H5O7·5H2O 3.9 g/L），1 L 海水中加每種營(yíng)養(yǎng)鹽母液1 mL，混勻備用。

1.3.2 藻種培養(yǎng)

藻種按照10%（體積分?jǐn)?shù)）比例接種于f/2 培養(yǎng)基中，連續(xù)光照培養(yǎng)（22 ℃，光照強(qiáng)度 3 500 lx～4 500 lx），每天搖瓶3 次，每次搖動(dòng)約100 下。

1.3.3 最佳培養(yǎng)基的確定

以6 種營(yíng)養(yǎng)鹽（微量元素母液、維生素母液、NaH2PO4·2H2O、Na2SiO3·9H2O、NaNO3、FeC6H5O7·5H2O）為考察因素，各取三水平，進(jìn)行L18（37）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。按照不同水平配置培養(yǎng)基，藻種按照10%（體積分?jǐn)?shù)）比例接種于不同水平培養(yǎng)基中培養(yǎng)。按照方法1.3.2 進(jìn)行藻種培養(yǎng)并定時(shí)測(cè)定OD 值，以對(duì)數(shù)末期的細(xì)胞密度（104個(gè)/mL）為考察指標(biāo)，確定適合不同藻株的最佳培養(yǎng)基配方。

表1 L18（37）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 L18（37）Orthogonal designation

1.3.4 15L 規(guī)模培養(yǎng)及藻的收獲

將兩株藻種按照10%（體積分?jǐn)?shù)）比例分別接種于優(yōu)化后的培養(yǎng)基中，于20 L 廣口瓶中連續(xù)光照培養(yǎng)（22 ℃～25 ℃，光照強(qiáng)度 3 000 lx～4 000 lx，通氣），定時(shí)取樣，測(cè)定OD 值，換算成細(xì)胞密度。以時(shí)間（d）為橫坐標(biāo)，以細(xì)胞密度（104個(gè)/mL）為縱坐標(biāo)，繪制兩株小球藻的生長(zhǎng)曲線。當(dāng)生長(zhǎng)曲線顯示細(xì)胞密度趨于穩(wěn)定時(shí)（已到達(dá)對(duì)數(shù)末期）停止培養(yǎng)，所得小球藻藻液再于4 ℃下離心（6 000 r/min）20 min，收獲沉淀的藻泥進(jìn)行冷凍干燥，最終得到干藻粉。

1.3.5 游離脂肪酸的提取

參考Molina 等[20]的方法提取小球藻干藻粉中的游離脂肪酸：取1.00 g 干藻粉用乙醇（96%）-KOH 溶液（乙醇76 mL，1.6 g KOH）進(jìn)行處理，氮?dú)獗Ｗo(hù)下超聲破碎20 min，然后60 ℃下皂化1 h，抽濾取濾液，濾餅再用20.0 mL 乙醇（96%）洗滌兩次并抽濾，合并濾液；加20.0 mL 去離子水于濾液中，用正己烷（共200.0 mL）萃取 5 次去除不可皂化物質(zhì)；用 HCl 溶液（HCl∶水=1∶1，體積比）調(diào)節(jié)下相pH 值至1.0，再用200.0 mL 正己烷分五次萃取得到游離脂肪酸，最后減壓旋蒸除去正己烷。

1.3.6 脲素包埋法

參考吳明一等[21]的方法：將1.3.5 得到的游離脂肪混合物溶于脲素甲醇溶液（4.00 g 脲素，15 mL 甲醇），于65 ℃～70 ℃下攪拌溶解直至清澈，所得溶液于28 ℃下過(guò)夜結(jié)晶，過(guò)濾去除結(jié)晶，得到含有多不飽和脂肪酸的溶液。

1.3.7 脂肪酸甲酯化

參考Cao 等[22]方法并做調(diào)整：將試驗(yàn)1.3.6 制備得到的多不飽和脂肪酸溶液移至25 mL 具塞定糖管中，加入2 mL 硫酸甲醇溶液（4%，體積比），于75 ℃下甲酯化反應(yīng)1 h。反應(yīng)結(jié)束后分別加入2 mL 生理鹽水和2 mL 正己烷，振蕩，靜置分層后取上層正己烷相，加入無(wú)水硫酸鈉（預(yù)先105 ℃恒重），離心（6 000 r/min，10 min），并定容至10 mL，置于棕色瓶中-20 ℃下保存。

1.3.8 氣相色譜測(cè)定EPA 含量

將1.3.7 得到的脂肪酸甲酯進(jìn)行氣相色譜分析測(cè)定EPA 含量。

參考Cao 等[22]方法并做調(diào)整：色譜柱：CBP20-25-50 毛細(xì)管柱（50 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為 180 ℃保持 1 min，6 ℃/min 升至 240 ℃，保持20 min；進(jìn)樣口溫度：280 ℃，檢測(cè)器溫度：FID 280 ℃，檢測(cè)器流速為1 mL/min，壓強(qiáng)為173.4 kPa，毛細(xì)管柱流速1.00 mL/min，總流速14.0 mL/min；載氣：高純氮?dú)?，流?30 mL/min，進(jìn)樣量為 1 μL；分流比為 5∶1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 進(jìn)行圖的繪制，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)助手專業(yè)版v3.1 軟件進(jìn)行分析極差及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化培養(yǎng)基的結(jié)果

培養(yǎng)基的組成對(duì)海洋微藻的生長(zhǎng)以及收獲的生物量有著重要的影響，即培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)鹽的組成是微藻光合作用、合成有機(jī)物的物質(zhì)基礎(chǔ)，其適宜的濃度可以促進(jìn)微藻的生長(zhǎng)，比如：江懷真的研究[15]發(fā)現(xiàn)不同濃度的氮、磷元素對(duì)小球藻的生長(zhǎng)速度和生物量影響是不同的；張麗君等[23]的研究發(fā)現(xiàn)鎂離子濃度在1.0 g/L時(shí)最有利于小球藻的生長(zhǎng)，所以生長(zhǎng)培養(yǎng)基的適當(dāng)優(yōu)化有利于小球藻收獲生物量的提高。

以藻密度為考察指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，兩種小球藻的方差分析表見(jiàn)表3 和表4。

由表2 極差RC95值可知，各因素對(duì)小球藻C95 生長(zhǎng)過(guò)程中藻密度的影響程度的大小順序?yàn)镃＞B＞A＞D＞F＞E，即NaH2PO4·2H2O 對(duì)藻密度的影響最大，依次為維生素母液、微量元素母液、Na2SiO3·9H2O、FeC6H5O7·5H2O、NaNO3。通過(guò)表2、表3 分析可得出各因素理論上的最佳組合為A1B3C3D1E1F1，即微量元素母液0.8 mL/L，維生素母液 2.4 mL/L，NaH2PO4·2 H2O 6.0 g/L，Na2SiO3·9H2O9.0 g/L，NaNO360.0 g/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 3.0 g/L，其中微量元素母液、維生素母液、NaH2PO·42 H2O 的濃度對(duì)藻密度有顯著影響。

表2 L18（37）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of L18（37）orthogonal experiments

表3 小球藻C95 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal experiment for Chlorella C95 medium optimized

由表2 極差RC97值可知，各因素對(duì)小球藻C97 生長(zhǎng)過(guò)程中藻密度的影響程度的大小順序?yàn)镋＞A＞F＞C＞D＞B，即NaNO3對(duì)小球藻C97 的密度影響最大，依次為 微 量 元 素 母 液 、FeC6H5O7·5H2O、NaH2PO4·2H2O、Na2SiO·39H2O、維生素母液。通過(guò)表2、表4 分析可得出各因素理論上的最佳組合為A2B3C1D2E3F1，即微量元素母液1.6 mL/L，維生素母液2.4 mL/L，NaH2PO4·2 H2O 4.0 g/L，Na2SiO3·9H2O 11.0 g/L，NaNO380.0 g/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 3.0 g/L，其中微量元素母液、NaNO3的濃度對(duì)藻密度有顯著影響。由表2 極差RC95值和極差RC97值可知，NaH2PO·42H2O、NaNO3分別對(duì)小球藻 C95、小球藻C97 藻密度的影響最大，說(shuō)明氮、磷元素對(duì)這兩株小球藻的生長(zhǎng)至關(guān)重要，這與李荷芳等[24]的研究結(jié)果一致。

對(duì)得出的分別適合小球藻C95 和小球藻C97 生長(zhǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基組合條件進(jìn)行驗(yàn)證，最終測(cè)得小球藻C95 的藻細(xì)胞密度為 1.371×107個(gè)/mL，小球藻 C97 的藻細(xì)胞密度為1.263×107個(gè)/mL，藻細(xì)胞密度大于其他培養(yǎng)基組合藻細(xì)胞密度，說(shuō)明正交優(yōu)化得到的小球藻C95 和小球藻C97 最優(yōu)培養(yǎng)基組合適合于小球藻的培養(yǎng)。

表4 小球藻C97 培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal experiment for Chlorella C97 medium optimized

2.2 兩株小球藻的生長(zhǎng)曲線

按照1.3.2 試驗(yàn)方法培養(yǎng)兩種小球藻，以為時(shí)間（d）橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度（104個(gè)/mL）為縱坐標(biāo)制作生長(zhǎng)曲線，如圖2。從繪制的生長(zhǎng)曲線不難發(fā)現(xiàn)兩種小球藻的生長(zhǎng)大致都分為3 個(gè)階段，其中C95 在第1 天就開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在第5 天到達(dá)對(duì)數(shù)末期并開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期；而小球藻C97 也是第1 天開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，而其對(duì)數(shù)末期是在第6 天并開(kāi)始進(jìn)入穩(wěn)定期。

圖2 小球藻C95 與小球藻C97 的藻種培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth curve of algae culture of Chlorella C95 and Chlorella C97

2.3 兩株小球藻15L規(guī)模培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線

研究發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)時(shí)期對(duì)小球藻脂肪酸含量和脂肪酸組成具有一定的影響。陳煒等[25]研究發(fā)現(xiàn)，小球藻在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)EPA 含量達(dá)到最高，占總脂肪酸的17.92%。所以按照1.3.4 試驗(yàn)方法15L 規(guī)模培養(yǎng)兩種小球藻，并分別繪制生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖3。

圖3 小球藻C95 與小球藻C97 15L 培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線Fig.3 15L culture growth curve of Chlorella C95 and Chlorella C97

由圖3 可以看出，15L 規(guī)模培養(yǎng)時(shí)，小球藻C95 第1 天就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第4 天到達(dá)對(duì)數(shù)末期，然后進(jìn)入穩(wěn)定期。最高細(xì)胞密度達(dá)到9.53×107個(gè)/mL，于第4天收獲小球藻C95。小球藻C97 也第1 天就進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第5 天到達(dá)對(duì)數(shù)末期，然后進(jìn)入穩(wěn)定期。最高細(xì)胞密度達(dá)到8.91×107個(gè)/mL，于第5 天收獲小球藻C97。與彭愛(ài)紅等[26]利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化f/2 培養(yǎng)基，和丁麗歡等[27]利用單因子、正交試驗(yàn)優(yōu)化兼養(yǎng)培養(yǎng)基獲取的結(jié)果相比，其生物量要高于他們獲取的生物量，可能與優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成不同有關(guān)。Cao 等[28]對(duì)30 株海洋綠藻進(jìn)行研究時(shí)，其中包含C95 和C97 兩株小球藻，小球藻C95 與小球藻C97 的研究結(jié)果均低于本試驗(yàn)獲取的生物量的研究結(jié)果，可能與培養(yǎng)基是否優(yōu)化以及光照強(qiáng)度不同有關(guān)。

2.4 兩株小球藻EPA產(chǎn)量

將小球藻C95 與小球藻C97 甲酯化，用GC 法測(cè)定兩種小球藻EPA 含量，得到兩種小球藻EPA 甲酯與標(biāo)準(zhǔn)品EPA 甲酯的氣相色譜圖，見(jiàn)圖4。

圖4 兩株小球藻中不飽和脂肪酸甲酯和EPA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatogram of fatty acid methyl esters in two strains of Chlorella and EPA methyl ester standard

從圖4中（a）和（b）圖可以發(fā)現(xiàn)，EPA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)品在滯留時(shí)間5 min 附近有一個(gè)明顯的峰，為溶劑正己烷的峰，18.345 min 處為標(biāo)準(zhǔn)品EPA 甲酯的峰。對(duì)照EPA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)品的EPA 甲酯的峰，小球藻C95 滯留時(shí)間18.278 min 處及小球藻C97 滯留時(shí)間18.309 min處的峰為EPA 甲酯的峰。標(biāo)準(zhǔn)品的EPA 甲酯峰面積為 386 048.1；小球藻 C95 的 EPA 甲酯峰面積為759 248.7；小球藻C97 EPA 甲酯峰面積為112 844.6。標(biāo)準(zhǔn)品EPA 甲酯的濃度為974.878 31 mg/L，根據(jù)樣品的EPA 甲酯峰面積與EPA 甲酯標(biāo)準(zhǔn)樣品的峰面積計(jì)算兩株小球藻的EPA 含量，得出小球藻C95 的EPA含量占總脂肪酸的30.2%，小球藻C97 的EPA 含量占總脂肪酸的29.5%。本研究中小球藻C95 與小球藻C97 得到的高含量EPA 與曹春暉[16]對(duì)這兩株小球藻研究得到的高含量EPA 結(jié)果相一致且高于其研究結(jié)果，可能與優(yōu)化后培養(yǎng)基組成有關(guān)。

3 結(jié)論

本研究得出如下結(jié)論，適合小球藻C95 生長(zhǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：微量元素母液0.8 mL/L，維生素母液2.4 mL/L，NaH2PO·42H2O 6.0 g/L，Na2SiO·39H2O 9.0 g/L，NaNO360.0 g/L，F(xiàn)eC6H5O·75H2O 3.0 g/L；適合小球藻 C97生長(zhǎng)的優(yōu)化培養(yǎng)基的組成為：微量元素母液1.6 mL/L，維生素母液 2.4 mL/L，NaH2PO4·2 H2O 4.0 g/L，Na2SiO3·9H2O 11.0 g/L，NaNO380.0 g/L，F(xiàn)eC6H5O7·5H2O 3.0 g/L。在優(yōu)化的培養(yǎng)基條件下，小球藻C95 和小球藻C97 分別在第4 天和第5 天達(dá)到對(duì)數(shù)末期，其細(xì)胞密度分別為 9.53×107個(gè)/mL、8.91×107個(gè)/mL；其中小球藻 C95 的EPA 含量占總脂肪酸的30.2%，小球藻C97 的EPA 含量占總脂肪酸的29.5%，小球藻C95 的EPA 含量要高于小球藻C97 的含量。