楊春霞，李彩虹，楊靜，牛艷，王曉靜，王曉菁

（寧夏農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，寧夏 銀川 750002）

枸杞是茄科枸杞屬的一種落葉灌木植物，是一種名貴的中藥材，被國家衛(wèi)生部規(guī)定為藥食同源的品種，其主要具有抗腫瘤、降血壓、抗衰老、降血脂，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等多種藥理活性[1]。酚類是一類含有酚羥基的植物次生代謝產(chǎn)物，包括酚酸、黃酮和花色苷類，具有抗氧化[2]、抗癌、抗衰老[3]等生理作用?，F(xiàn)代藥理學研究表明：枸杞具有抑菌、抗突變、清除自由基、抗氧化等藥理作用主要與其酚類成分有密切關(guān)系。隨著人們的保健意識和食品安全意識增強，其藥理作用和營養(yǎng)價值越來越被人們追捧。研究者對于其總酚、酚酸化合物成分的關(guān)注度越來越高，對其生物活性及應用的研究成為熱點。枸杞主要含有多糖、黃酮、苷類、類胡蘿卜素、酚酸等多類化合物。目前，對枸杞的研究多集中在多糖和黃酮[4-6]，酚酸類化合物的研究較少。王曉中等[7]以綠原酸為對照品，采用亞鐵氰化鉀顯色，比色法對寧夏中寧、惠農(nóng)、農(nóng)科院、新疆精河、甘肅蘭州五地的枸杞總酚酸含量測定，含量在8.33%～9.24%，以中寧種植的枸杞含量最高。張自萍等用高效液相色譜法測定了寧夏枸杞中綠原酸的含量[8-9]。譚亮等[10]對青海人工及野生的紅果、黃果、黑果枸杞子中5 種酚酸化合物含量進行測定。同時，對內(nèi)蒙古、甘肅、新疆、寧夏的枸杞中酚酸化合物含量進行比較。劉少靜等[11]對黑果枸杞中綠原酸、咖啡酸、表兒茶素和阿魏酸的含量測定，建立了反相高效液相色譜法（rerersed-phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC） 同時測定4種酚酸的方法。本文采用福林酚法，對寧夏4 個不同產(chǎn)區(qū)種植的4 個品種枸杞中總酚含量測定，確定了枸杞中總酚的提取方法。比較不同產(chǎn)區(qū)不同品種枸杞間總酚含量的差異性，為枸杞的質(zhì)量控制提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

1#、5#、7#、9#4 個品種枸杞，均采集于銀川園林場枸杞種植基地、賀蘭百瑞源枸杞基地、中寧璽贊枸杞生態(tài)莊園、中寧長山頭百瑞源枸杞基地、中寧舟塔鄉(xiāng)枸杞種植地、固原正杞紅枸杞基地。不同品種夏果和秋果枸杞，在同一條件下烘干處理，冷凍粉碎，與干燥器中保存待用。

福林酚試劑（Folin-phenol）：BR，國藥集團上海試劑公司；沒食子酸（純度≥98%）：北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；無水乙醇、無水碳酸鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；試驗用水為去離子水。

1.2 儀器

722S 風光光度計：上海精密科學儀器有限公司；KQ5200DE 數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超生儀器有限公司；LD5-2A 型高速冷凍離心機：北京醫(yī)用離心機廠；Mili-Q/Element 超純水機：美國 Millipore 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液配制

沒食子酸標準儲備液配制：精確稱取12.5 mg 沒食子酸標準品于25 mL 棕色容量瓶中，用甲醇定容稀釋至刻度，4 ℃保存待用，即濃度為0.5 mg/mL。

沒食子酸標準系列濃度配制：分別吸取沒食子酸標準儲備液0.0、0.125、0.25、0.375、0.50、0.625、0.75、1.50、2.00、3.00、5.00 mL 置于 25 mL 棕色容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，待用。

1.3.2 枸杞中總酚的最佳提取條件研究

準確稱取一定量的枸杞樣品，采用超聲波輔助提取法，。以 70%乙醇作為提取劑，料液比 1∶30（g/mL），提取時間為90 min，提取液在6 500 r/min，4 ℃下離心10 min，樣液待用。

1.3.3 Folin-Ciocalteu 法測定枸杞中總酚含量

分別吸取沒食子酸標系列濃度1.00 mL 于25 mL刻度試管中，加入6.00 mL 去離子水，1 mL Folin-phenol試劑，搖勻，放置6 min，再各加入1.0 mol/L 的碳酸鈉溶液 3 mL，搖勻，20 ℃～25 ℃下靜置 60 min，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，在760 nm 處測定吸光度。取稀釋至一定倍數(shù)的樣品溶液1 mL 同上法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 軟件進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果及分析

2.1 標準曲線建立

以沒食子酸的濃度（x，mg/L）為橫坐標，對吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 The regression equation of gallic acid

結(jié)果顯示：沒食子酸的吸光度與濃度呈良好的線性關(guān)系（r=0.999 7），方法具有較寬的線性范圍（0～100 mg/L）。

2.2 提取條件優(yōu)化

2.2.1 乙醇濃度對總酚提取量的影響

乙醇濃度對枸杞中總酚提取的影響見圖2。

圖2 乙醇濃度對枸杞中總酚提取的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction of total phenols from Lycium barbarum L.

由圖2 可知，隨著乙醇濃度的增加，總酚提取量呈先增加后降低趨勢。當乙醇濃度為70%時，提取量最大，總酚含量達到了10.6 mg/g。在乙醇濃度在70%～90%間，提取量降低。試驗選擇濃度為70%的乙醇作為提取劑。

2.2.2 料液比對總酚提取量的影響

在其他條件一定時，考察料液比對總酚提取率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對枸杞中總酚提取的影響Fig.3 Effect of material-liquid ratio on extraction of total phenols from Lycium barbarum L.

隨著溶劑體積的增大，枸杞總酚的提取量呈上升趨勢，當料液比為1∶30（g/mL）時總酚提取量達到較大，之后提取量趨于穩(wěn)定。試驗選擇1∶30（g/mL）的料液比作為最佳的提取體積。

2.2.3 提取時間對總酚提取量的影響

提取時間對總酚提取量的影響見圖4。

圖4 提取時間對枸杞中總酚提取的影響Fig.4 Effect of extraction time on extraction of total phenols from Lycium barbarum L.

由圖4 可知，隨著提取時間的增加，總酚的提取量呈先增加后減少的趨勢，提取90 min 后呈下降趨勢，這可能是因為提取過程中超聲溫度增加，多酚發(fā)生氧化的緣故。試驗確定提取時間為90 min。

2.3 枸杞中總酚含量分析

對銀川、賀蘭百瑞源、中寧、固原枸杞種植基地的不同品種枸杞中總酚含量分析，枸杞1#、5#、7#、9#干果中總酚含量在4.53 mg/g～16.07 mg/g，其中夏果總酚含量在4.53 mg/g～14.57 mg/g，秋果總酚含量在11.60 mg/g～16.07 mg/g，秋果中總酚含量明顯高于夏果，是夏果的1.1～2.6 倍。夏果枸杞中以賀蘭百瑞源枸杞種植基地的5#、銀川園林場枸杞種植基地的1#和5#、固原正杞紅枸杞種植基地的1#總酚含量較高，分別達到11.57、10.36、14.57、9.874 mg/g。其它各地不同品種枸杞總酚含量低于7.852 mg/g。不同品種秋果枸杞中總酚含量在11.60 mg/g 以上，各品種之間總酚含量差異不明顯。固原無秋果枸杞。

2.4 同一產(chǎn)地、不同品種枸杞中總酚含量分析

對銀川園林場、賀蘭百瑞源、中寧和固原枸杞種植基地主栽的 1#、5#、7#、9# 枸杞中總酚含量比較分析。

2.4.1 賀蘭百瑞源枸杞種植基地不同品種枸杞間總酚含量比較分析

賀蘭百瑞源枸杞種植基地不同品種枸杞間總酚含量比較分析見圖5。

圖5 賀蘭百瑞源不同品種枸杞（夏、秋果）中總酚含量比較圖Fig.5 The picture of comparison of total phenol content in different varieties of Lycium barbarum L.（summer and autumn fruit）from Helan Bairuiyuan

由圖5 可知，賀蘭百瑞源枸杞種植基地主栽的1#、5#、7#、9# 枸杞中夏果總酚含量順序依次為 5#＞9#＞7#＞1#，秋果中總酚含量高低順序為 1#＞7#＞5#＞9#，且秋果中總酚含量顯著高于夏果，最高含量可達16.07 mg/g。不同品種夏果與秋果枸杞中總酚含量存在顯著差異。不同品種夏果枸杞間含量差異顯著，而不同品種秋果枸杞間總酚含量差異不顯著；對于秋果枸杞總酚含量高于夏果，主要是因為夏果每茬成熟期短，秋果成熟周期長，一般只采摘一茬，營養(yǎng)成分累積充分。

2.4.2 銀川園林場枸杞種植基地不同品種枸杞間總酚含量比較分析

圖6 為銀川園林場枸杞種植基地主栽的1#、5#、7#、9#干枸杞中夏果和秋果總酚含量比較圖。

圖6 銀川園林場不同品種枸杞（夏、秋果）中總酚含量比較圖Fig.6 The picture of comparison of total phenol content in different varieties of Lycium barbarum L.（summer and autumn fruit）from Yinchuan Garden

由圖6 可知，夏果中以5#含量最高，7#含量最低，1#和9#次之，總酚最高含量為14.57mg/g，4 個品種間含量呈顯著性差異。秋果中總酚含量普遍高于夏果，且4 個品種間含量無顯著性差異，以7#和9#最高，分別達到15.65 mg/g 和16.07 mg/g；以5#枸杞含量最低，達到11.60 mg/g。

2.4.3 中寧枸杞種植基地不同品種枸杞間總酚含量比較分析

圖7 為中寧地區(qū)（舟塔鄉(xiāng)潘營村、鴻盛枸杞基地、璽贊生態(tài)枸杞莊園、長山頭百瑞源枸杞種植基地）主栽的1#、5#、7#、9#枸杞總酚含量比較圖。

圖7 中寧枸杞種植基地不同品種枸杞干果（夏、秋果）中總酚含量比較圖Fig.7 The picture of comparison of total phenol content in different varieties of Lycium barbarum L.（summer and autumn fruit）from Zhongning planting base

由圖7 可知，夏果枸杞中以長山頭百瑞源枸杞種植基地的9#和鴻盛枸杞基地種植的5#含量高，含量分別達到7.852 mg/g 和7.070 mg/g；璽贊生態(tài)枸杞莊園種植的7#含量最低，含量為4.591 mg/g；另外，舟塔鄉(xiāng)潘營村種植的1#和長山頭百瑞源枸杞種植基地的7#次之，含量分別為4.624 mg/g 和5.472 mg/g。秋果各品種總酚含量普遍高于夏果，各品種間含量高低規(guī)律與夏果一致，含量在11.60 mg/g～16.07 mg/g 之間，是夏果的 2.5 倍～2.1 倍。

2.4.4 固原正杞紅枸杞種植基地不同品種枸杞間總酚含量比較分析

對固原正杞紅枸杞種植基地不同品種枸杞中總酚含量分析比較，結(jié)果見圖8。

圖8 固原正杞紅枸杞種植基地不同品種枸杞間總酚含量比較圖Fig.8 The picture of comparison of total phenol content in different varieties of Lycium barbarum L.from Guyan planting base

各品種間總酚含量差異明顯，含量順序依次為1#＞7#＞5#＞9#，含量在 4.526 mg/g～9.874 mg/g 之間。該地區(qū)氣溫低，降雨多，無秋果。

2.4.5 同一產(chǎn)地、不同品種枸杞中總酚含量比較

通過各地區(qū)、不同品種枸杞間總酚含量的比較，發(fā)現(xiàn)1#、5#、7#以銀川地區(qū)種植的含量最高，9#以中寧長山頭百瑞源枸杞基地種植的含量最高，同一品種在不同地區(qū)呈現(xiàn)顯著差異。這與當?shù)氐耐寥罈l件、田間管理、氣候因素以及成熟期有很大的關(guān)系。

3 結(jié)論

試驗優(yōu)化確定了枸杞中總酚提取的最佳條件，即：70%乙醇、料液比1∶30（g/mL），提取時間為 90 min。對寧夏產(chǎn)區(qū)的1#、5#、7#、9#枸杞中總酚含量分析比較，枸杞中總酚含量在4.53 mg/g～16.07 mg/g 之間，秋果中總酚含量明顯高于夏果，是夏果的1.1～2.6 倍。同一品種在不同地區(qū)呈現(xiàn)顯著差異，4 個品種在不同種植區(qū)總酚含量變化規(guī)律無一致性。