牛骨骼肌肌鈣蛋白T單克隆抗體的制備及其特性鑒定

劉靜靜，李玉靜，王振華，張靜，吳萌，杜順豐，張巖，李春生，

（1.河北省科學(xué)院生物研究所，河北 石家莊 050081；2.河北交通職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河北 石家莊 050035；3.河北科星藥業(yè)有限公司，河北 石家莊 050200；4.秦皇島市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，河北 秦皇島 066001；5.河北省食品檢驗(yàn)研究院，河北 石家莊 050227）

肉類是餐桌上最受歡迎的食材之一，營養(yǎng)豐富，味道鮮美，是百姓食譜中不可缺少的營養(yǎng)食材。隨著社會(huì)發(fā)展、生活水平的提高，肉類食品的種類和數(shù)量與日俱增，摻雜摻假行為屢見不鮮。例如一些不法商家為了追求利益，用價(jià)格便宜的雞、鴨肉冒充牛、羊肉[1]；在清真肉品中摻加豬肉更是嚴(yán)重冒犯了伊斯蘭教消費(fèi)者，影響民族團(tuán)結(jié)[2]。這些摻假行為極大地?fù)p害了消費(fèi)者的利益，也成為了政府監(jiān)管和民生關(guān)注的焦點(diǎn)，質(zhì)檢“十三五”規(guī)劃綱要明確指出要重點(diǎn)加強(qiáng)開展食品摻假鑒別技術(shù)研究。

目前，肉類的鑒別方法主要有顯微鏡觀察法，通過肉類食品的紋理、色澤、味道等進(jìn)行判別[3]；蛋白質(zhì)檢測法，如等電聚焦電泳法、免疫分析法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[4-6]；DNA 檢測法，如核酸探針雜交、限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction-fragmentlength polymorphism，PCR-RFLP） 分析、DNA 指紋分析和PCR 特異擴(kuò)增[7-10]。顯微鏡鑒別方法需要豐富的經(jīng)驗(yàn)，主觀性比較強(qiáng)。對(duì)于熟肉制品，由于在熱加工過程中，DNA 會(huì)發(fā)生降解，在120 ℃左右時(shí)就會(huì)銳減到600 bp 以下[11]，高溫對(duì)遺傳物質(zhì)有一定的破壞，利用DNA 方法無法準(zhǔn)確判斷肉類的來源。免疫學(xué)方法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定、適用范圍寬及費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)，已成為食品安全檢測中最為廣泛應(yīng)用的方法之一[12]，與此同時(shí)，耐熱性標(biāo)志蛋白的研究發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步促進(jìn)了該方法在肉源成分鑒定上的應(yīng)用價(jià)值[13-14]。Fur-Chi Chen 等獲得了一株針對(duì)豬的肌肉熱穩(wěn)定蛋白的特異性單抗，并建立了間接ELISA 方法，可以用于生肉、熟肉中添加豬肉的檢測[15]。20 世紀(jì)60年代研究發(fā)現(xiàn)，原肌球蛋白溶液中一種未知的蛋白質(zhì)，即使在原肌球蛋白經(jīng)過等電點(diǎn)沉淀處理之后仍舊存在，后來被命名為肌鈣蛋白[16]。肌鈣蛋白是一個(gè)結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定的復(fù)合體，主要由肌鈣蛋白 C（troponin C，TnC）、肌鈣蛋白 I（troponin I，TnI）和肌鈣蛋白 T（troponin T，TnT）3 種不同的亞型組成[17-18]。本研究以牛骨骼肌肌鈣蛋白T（skeletal muscle troponin T，sTnT）為標(biāo)志蛋白，制備其單克隆抗體，并對(duì)抗體的效價(jià)、特異性等進(jìn)行鑒定，為食品中牛肉源性成分免疫學(xué)鑒別方法的建立奠定了基礎(chǔ)，為實(shí)現(xiàn)肉類食品的快速鑒定、加強(qiáng)市場監(jiān)管提供有利保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

丙烯酰胺（Acr）、亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、HAT Media Supplement（50×）Hybri-MaxTM、HT Media Supplement（50×）Hybri-MaxTM、福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑、聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、免疫球蛋白亞型試劑盒：Sigma 公司；四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）：美國 BBI 公司；細(xì)胞培養(yǎng)板、DMEM 培養(yǎng)基：GIBCO 公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記羊抗小鼠IgG：北京中杉金橋生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；Balb/c 小鼠：河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 儀器與設(shè)備

4710 型超聲破碎儀：Cole-Parmer Instrument 公司；Heraus Multifuge 高速冷凍離心機(jī)、ND2000 超微量核酸蛋白測定儀、1510 型酶標(biāo)儀：德國Thermo 公司；MCO-15AC 二氧化碳培養(yǎng)箱：日本SANYO 公司；SWCJ-2FD 型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；CKX41SF 倒置顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。

1.3 方法

1.3.1 抗原的提取

取牛的骨骼肌去除脂肪和結(jié)締組織，研磨混勻，稱取 40 g 加入 0.15 mol/L 的 NaCl 溶液（1∶2，質(zhì)量體積比）；進(jìn)一步混勻后，超聲提取 5 min（50 W，20 KHz），煮沸 20 min 后，2 000 g 離心 30 min；去除沉淀，取一半上清過濾后為檢測原。另一半上清經(jīng)121 ℃高壓30 min 后，5 000 g 離心 30 min；取上清用 Whatman 1 號(hào)濾紙過濾，濾液加入 90%乙醇（1∶3.74，體積比），靜置2 h；混合液7 000 g 離心20 min，取沉淀烘干，作為免疫原提取物，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）后切膠用于免疫。

1.3.2 SDS-PAGE 鑒定

選擇分離膠濃度為12%，濃縮膠為5%，對(duì)抗原進(jìn)行SDS-PAGE 鑒定。

1.3.3 動(dòng)物免疫

免疫原提取物切膠于Balb/c 小鼠頸背部注射，每隔2 周加強(qiáng)一次免疫。3 次免疫后7 d～10 d 斷尾取血，間接ELISA 檢測血清抗體效價(jià)。選取免疫效果最佳的小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.3.4 單克隆抗體的制備

采用PEG 法融合。融合7 d 后，細(xì)胞集落約顯微鏡下1/3～1/2 視野大小時(shí)換用HT 培養(yǎng)基。上清液用間接ELISA 方法檢測，進(jìn)行陽性雜交瘤細(xì)胞篩選。檢測為陽性的孔，盡量挑選出陽性較高的單個(gè)克隆，通過有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，直至建立單一分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。小鼠體內(nèi)誘生腹水，辛酸-硫酸銨沉淀的方法純化。

1.3.5 單克隆抗體特性鑒定

1.3.5.1 單克隆抗體效價(jià)測定

采用間接ELISA 法進(jìn)行抗血清效價(jià)測定，具體步驟如下：檢測原濃度為5 μg/mL，96 孔酶標(biāo)板每孔100 μL，4℃包被過夜；包被板恢復(fù)至室溫（24 ℃），傾去包被液，洗3 次～4 次，拍干；封閉，每孔加含10%明膠的洗液作為封閉液，37 ℃孵育2 h；洗滌，拍干；將單抗以1 000 倍開始倍比稀釋，每孔加入100 μL，并且設(shè)置空白對(duì)照孔（0.01 mol/L，pH7.4 的磷酸鹽緩沖液）和陰性孔（陰性血清），37 ℃孵育 45 min；洗滌，拍干；每孔加入 100 μL 的 1∶10 000（體積比）稀釋的 HRP 酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，37 ℃孵育30 min；洗滌，拍干；每孔加底物顯色液100 μL，37 ℃避光反應(yīng)15 min；每孔加入50 μL 終止液，終止反應(yīng)；450 nm 測定吸光度值，陰性對(duì)照孔吸光度值為N，陽性為P，以P/N≧2.1，為陽性結(jié)果。

1.3.5.2 單克隆抗體亞型測定

用Sigma 公司的免疫球蛋白亞型試劑盒進(jìn)行測定。

1.3.5.3 單克隆抗體特異性的測定

用間接ELISA 測定單克隆抗體與牛、羊、雞、鴨、魚的骨骼肌提取物的交叉反應(yīng)。牛、羊、雞、鴨、魚的骨骼肌提取物的制備方法同1.3.1 中抗原的提取方法。

1.3.5.4 免疫印跡

SDS-PAGE 電泳后轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜后經(jīng)封閉、洗膜，加入稀釋的辛酸-硫酸銨純化的抗體，洗膜后加入稀釋的HRP 酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，洗膜后加入顯色液拍照。

1.3.5.5 單克隆抗體親和力測定

采用間接ELISA 法測定親和常數(shù)Ka。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗原的提取

牛骨骼肌提取后，得到固體物質(zhì)90.5 mg，得率為0.45 %，蛋白質(zhì)含量經(jīng)考馬斯亮藍(lán)G-250 法測定為67.5%。檢測原濃度用超微量核酸蛋白測定儀測定為8.8 mg/mL。

2.2 SDS-PAGE鑒定結(jié)果

檢測原和免疫原的SDS-PAGE 結(jié)果見圖1。

圖1 提取物的SDS-PAGE 的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification results of SDS-PAGE of extracts

從圖1 中可見，帶形清晰，顏色較深的有3 條，對(duì)應(yīng)的分子量約為37、24、17 kDa，與文獻(xiàn)中報(bào)道的骨骼肌肌鈣蛋白 T、I、C 亞基相符[19-21]。選取 37 kDa（sTnT）用于免疫。免疫原提取物與檢測原相比，17 kDa 處無明顯條帶，可能是經(jīng)過高壓的處理后被沉淀了。

2.3 雜交瘤細(xì)胞株的篩選

融合后出現(xiàn)肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)，取上清進(jìn)行間接ELISA 檢測，取陽性孔經(jīng)過3 次～4 次克隆，直至全陽性。篩選出單克隆抗體細(xì)胞株2 株，分別命名為3A8、1B8。

2.4 單克隆抗體效價(jià)測定

單克隆抗體的濃度和效價(jià)檢測結(jié)果見表1。

表1 單克隆抗體部分性能的測定Table 1 Determination of monoclonal antibody performance

由表1 可知，純化后經(jīng)間接ELISA 測定效價(jià)，3A8 效價(jià)在 1∶1.0×106以上，1B8 效價(jià)較低，為 1∶3.2×104。用超微量核酸蛋白測定儀測定蛋白含量，3A8 為20.6 mg/mL，1B8 為 16.9 mg/mL。

2.5 單克隆抗體亞型測定

單抗3A8、1B8 亞型的測定結(jié)果見圖2。

圖2 單克隆抗體亞型的測定Fig.2 Determination of monoclonal antibody subtype

由圖2 可知，采用間接ELISA 方法測定2 株單克隆抗體的亞類。雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體與不同亞類的抗體顯色有明顯差異，其中3A8、1B8 與IgG1抗體的A450nm值最高，與IgM 的抗體A450nm值較低，在0.25 左右，而與 IgG2a、IgG2b、IgG3 和 IgA 抗體反應(yīng)為陰性，所以3A8、1B8 分泌的抗體類型以IgG1 為主。

2.6 單克隆抗體特異性的測定

單抗3A8、1B8 與牛、羊、雞、鴨、魚骨骼肌提取物的間接ELISA 檢測結(jié)果見圖3。

由圖3 可知，3A8 與牛、羊骨骼肌提取物的效價(jià)1∶1×106，與雞、鴨、魚骨骼肌提取物的效價(jià)低于 1∶1×104，特異性較好；1B8 與牛、羊、雞、鴨、魚骨骼肌提取物的效價(jià)都比較低，抗體性能較差。經(jīng)過篩選，3A8 特異性較好，可用于下一步試驗(yàn)。

圖3 單抗交叉反應(yīng)結(jié)果Fig.3 Results of cross reaction of monoclonal antibody

2.7 免疫印跡

單抗3A8 的免疫印跡結(jié)果見圖4。

圖4 3A8 與骨骼肌提取物特異反應(yīng)的免疫印跡圖譜Fig.4 Immunoblot analysis of specific response of 3A8 to skeletal muscle extract

由圖4 可知，單抗3A8 分別與轉(zhuǎn)印有牛、羊、雞、鴨骨骼肌提取物的聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜反應(yīng)，顯色后僅在牛、羊骨骼肌提取物的37 kDa 條帶位置出現(xiàn)單一區(qū)帶，而與雞、鴨骨骼肌提取物無明顯條帶，初步證實(shí)3A8 能結(jié)合牛、羊骨骼肌提取物，主要結(jié)合骨骼肌肌鈣蛋白T 亞基，不與雞、鴨骨骼肌提取物結(jié)合。

2.8 單克隆抗體親和常數(shù)測定

單抗3A8 親和常數(shù)的測定結(jié)果見圖5。

圖5 單抗3A8 的親和力測定Fig.5 Determination of affinity of 3A8

由圖5 可知，以抗體濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，以A450nm值為縱坐標(biāo)，繪制S 型曲線，經(jīng)計(jì)算，親和常數(shù)為8.1×108L/mol，表明抗體的親和力較高。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)將牛骨骼肌粗提后，切膠免疫小鼠進(jìn)行融合，篩選高效價(jià)、高特異性的單克隆抗體，最后獲得穩(wěn)定分泌抗牛sTnT 抗體的細(xì)胞株2 株。通過小鼠體內(nèi)誘生腹水，用辛酸-硫酸銨沉淀的方法對(duì)其進(jìn)行了純化，制備出單克隆抗體。經(jīng)過鑒定，單抗3A8 特性較好，亞型為 IgG1 型，與牛、羊骨骼肌提取物的效價(jià) 1∶1×106，與雞、鴨、魚骨骼肌提取物的效價(jià)低于 1∶1×104，特異性好。親和常數(shù)為8.1×108L/mol，親和力較高。免疫印跡結(jié)果顯示單抗3A8 結(jié)合牛羊的sTnT 亞基，能夠區(qū)分牛羊和雞鴨的骨骼肌提取物，為食品中牛肉源性成分免疫學(xué)鑒別方法的建立奠定了基礎(chǔ)。