任 麗,王 佳，馬文麗，宋曉東

(內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 011500)

本研究根據(jù)GB/T 6437—2018《飼料中總磷的測定 分光光度法》，結(jié)合JJF 1059.1—2012《測量不確定度評定與表示》，對測定結(jié)果進行不確定度進行分析評定，找出檢測結(jié)果的主要影響因素，為評定分光光度法測定飼料中總磷含量的不確定光度提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

分光光度計，日立U-1900;磷酸二氫鉀;磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液50 μg/ml。

1.2 檢測方法

依據(jù)GB/T 6437—2018《飼料中總磷的測定 分光光度法》測定。

1.3 樣品前處理及測定

1.3.1樣品前處理

稱取2.0～5.0 g試樣，置于坩堝中，在電熱板上小心碳化，再放入高溫爐，在550℃灼燒3 h，取出冷卻，加鹽酸溶液10 ml，硝酸數(shù)滴，小心煮沸10 min，冷卻后用水轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，為試樣溶液。

1.3.2繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)儲備液0、1、2、5、10、15 ml(0、50、100、250、500、750 μg)于50 ml容量瓶中，分別加入10 ml釩鉬酸銨顯色劑，用水稀釋至刻度，搖勻，常溫放置10 min以上，以0 ml磷標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比，用1 cm比色皿，在400 nm波長下用分光光度計測各溶液的吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1.3.3樣品測定步驟

準(zhǔn)確吸取1.00～10.0 ml試樣溶液(含磷量為50～750 μg)于50 ml容量瓶中，加入10 ml釩鉬酸銨顯色劑，用水稀釋至刻度，搖勻，常溫放置10 min以上，用1 cm比色皿，在400 nm波長下用分光光度計測定試樣溶液的吸光度，通過工作曲線計算試樣溶液的磷含量(同時做空白)，若試樣溶液濃度超過工作曲線范圍，樣液應(yīng)進行稀釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 被測樣品的數(shù)學(xué)模型

(1)

式中,y為試樣中磷的含量；m為試樣質(zhì)量，g；m1為通過工作曲線計算出試樣溶液中磷的含量，μg；V為試樣溶液的總體積，ml；V1為試樣測定時移取試樣溶液的體積，ml；106為換算系數(shù)。

2.2 實驗過程使用的儀器設(shè)備、計量器具、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相關(guān)信息

1 ml分度吸量管A級，最大容量允差±0.008 ml；2 ml分度吸量管A級，最大容量允差±0.012 ml；5 ml分度吸量管A級，最大容量允差±0.025 ml；10 ml分度吸量管A級，最大容量允差±0.05 ml；50 ml單標(biāo)線容量瓶A級，最大容量允差±0.02 ml；100 ml單標(biāo)線容量瓶A級，最大容量允差±0.08 ml；電子天平，0～210 g，最大允差為±0.000 2 g；分光光度計，波長準(zhǔn)確度1.8 nm。

磷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，相對擴展不確定度(k=2)為0.5%。

2.3 測量結(jié)果計算

對同一飼料樣品重復(fù)測量2次，分別將每次測出的樣品質(zhì)量、通過工作曲線計算出的試樣溶液中磷含量、試樣總體積、試樣測定時移取試樣溶液的體積代入公式(1)，具體數(shù)據(jù)及結(jié)果見表1。

表1 測量數(shù)據(jù)

2.4 不確定度分量的識別、分析、量化

按照“2.1被測樣品的數(shù)學(xué)模型”，不確定度來源有5個：

①總重復(fù)性u(r)；

②質(zhì)量m的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m);

③移取體積V1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V1);

④定容體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V);

⑤通過工作曲線計算出試樣溶液中磷的含量m1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m1)。

2.4.1總重復(fù)性u(r)

在重復(fù)性條件下，對同一試樣從取樣開始重復(fù)測量10次，用貝塞爾公式計算該測量列的實驗標(biāo)準(zhǔn)差s。

總重復(fù)性u(r)為測量結(jié)果y的標(biāo)準(zhǔn)差。典型的重復(fù)性數(shù)據(jù)見表2。

表2 重復(fù)性數(shù)據(jù)

2.4.2質(zhì)量m的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)

證書提供的精密天平線性誤差為±0.000 2 g，矩形分布，k=31/2，

2.4.3體積V1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V1)

包括刻度管校準(zhǔn)u1(V1)、溫度影響u2(V1)2項。

2.4.3.1刻度管校準(zhǔn)不確定度u1(V1)

5 ml刻度管的最大允許誤差±0.025 ml，服從三角分布，k=61/2。

標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量：

2.4.3.2溫度影響不確定度u2(V1)

2.4.3.3體積V1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u(V1)

u(V1)=(u12+u22)1/2

=(0.010 22+0.003 032)1/2

=0.010 6 ml；

2.4.4體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V)

包括容量瓶校準(zhǔn)u1(V)和溫度影響u2(V)兩項。

2.4.4.1校準(zhǔn)不確定度u1(V)

2.4.4.2溫度影響不確定度u2(V)

定容時容量瓶及溶液的溫度與校準(zhǔn)時的溫度(20 ℃)不同。與液體相比，容量瓶的體積膨脹可忽略。實驗室全年溫度只能控制在20±5℃，矩形分布，k=31/2；水的體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4ml/℃。

2.4.4.3體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量u(V)

u(V)=(u12+u22)1/2=(0.032 62+0.060 62)1/2=0.063 9 ml；

2.4.5試樣溶液中磷的含量m1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m1)

檢測樣液在工作曲線所讀的濃度值的不確定度，由標(biāo)準(zhǔn)溶液的不確定度和曲線擬合的不確定度組成。

2.4.5.1標(biāo)準(zhǔn)溶液

2.4.5.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心提供的數(shù)據(jù)，磷標(biāo)準(zhǔn)品的相對擴展不確定度(k=2)為0.5%。故由磷標(biāo)準(zhǔn)品引入的相對不確定度:

2.4.5.1.2稱量過程

天平的最大允許誤差為±0.000 2 g。最大容許誤差包括了天平校準(zhǔn)、稱量變動性引起的最大允許誤差。按照均勻分布計算，則

天平重復(fù)稱量由天平引起的相對不確定度為：

2.4.5.1.3稀釋過程

稀釋過程中需要6個50 ml容量瓶，1個10 ml分度吸量管，1個5 ml分度吸量管，1個2 ml分度吸量管，1個1 ml分度吸量管。

玻璃量具容量允差引起的不確定度見表3；溫度變化引起的不確定度見表4。

表3 玻璃量具容量允差引起的不確定度

表4 溫度變化引起的不確定度

由表中數(shù)據(jù)計算標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋體積的相對不確定度如下：

2.4.5.2曲線擬合[4-5]

制備好的磷標(biāo)準(zhǔn)溶液c，每個濃度用分光光度計測定2次，得到相應(yīng)的吸光度A，用最小二乘法擬合，獲得直線方程A=a+b×c，線性相關(guān)系數(shù)r，列于見表5。

表5 磷標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度c和吸光度A以及最小二乘法擬合直線方程

對樣品測定液進行了10次測定，由直線方程求得平均濃度為：cx=452.901 μg/ml。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合帶來的標(biāo)準(zhǔn)不確定度公式如下：

式中，b為斜率；a為截距;P為樣品測試次數(shù)；N為測試工作曲線的次數(shù)；Cx為樣品溶液中磷的含量,μg；Cs為不同濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的平均值,μg；Ci為標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度,μg；Ai為與標(biāo)液Ci對應(yīng)的吸光值；i為獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線的測量順序號。

表6 殘差標(biāo)準(zhǔn)偏差計算表

表7 離均差平方和計算表

經(jīng)計算得出：u(curve)=2.04 μg。

2.4.5.3試樣溶液中磷的濃度c的不確定度

=0.007 4

2.5 計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ux(y)

2.5.1計算相對合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度ucrel(y)

ucrel(y)= [urel2(r)2+urel2(m) +urel2(V1)+urel2(V)+urel2(m1)]1/2=[0.001 12+0.000 0402+0.002 12+0.000 642+0.007 42]1/2=0.010。

2.5.2計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc(y)

uc(y)=ucrel(y)×y=0.010×0.30%

=0.003 0%。

2.6 計算y的擴展不確定度U(y)

取包含因子k=2，擴展不確定度為：

U(y)=k×uc(y)= 2×0.0030=0.01%。

2.7 結(jié)果表示

用分光光度法測定飼料中的總磷含量，平行測定2次，取其平均值報告結(jié)果，則被測飼料的磷含量y=0.30%，擴展不確定度：

U(y)=0.01 %(k=2)。

3 結(jié)論

通過對分光光度法測定飼料中總磷含量的不確定度來源進行分析，并評定各個不確定度分量，得出該分析方法的擴展不確定度為0.01%,包含因子k=2;同時可以得出,采用分光光度法測定飼料中總磷含量的不確定度來源主要是總重復(fù)性和通過工作曲線計算出試樣溶液中磷的含量m1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m1)[7]，而質(zhì)量m的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(m)、移取體積V1的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V1)、定容體積V的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(V)對導(dǎo)致的不確定度幾乎不影響。

從不確定度結(jié)果得出，采用對分光光度法測定飼料中總磷含量保證實驗具有良好的重復(fù)性[4-6]，準(zhǔn)確配制標(biāo)準(zhǔn)品和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，嚴(yán)格控制實驗反應(yīng)條件，這樣對于提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性具有重要意義。