商 軍，華賢輝，張浩然，田 愷，張亦菲，徐 汀

(上海市獸藥飼料檢測所，上海 201103)

磷是動物必須的常量元素，其作為骨骼的組成元素，在骨骼中的含量僅次于鈣，對動物健康和生長有著不可缺少的作用。動物所需的磷元素主要來源于飼料，只有在飼料的加工過程中添加足量的含磷物質(zhì)才能保證不影響動物的生長，其含量也是作為評價飼料營養(yǎng)品質(zhì)的重要指標(biāo)[1-3]。磷的測定方法已有許多研究，如氣相色譜法[4]、X射線熒光光譜法[5-6]、等離子體原子發(fā)射光譜法[7]等，但這些方法多數(shù)需要特定的儀器設(shè)備，測定方法較繁瑣，應(yīng)用還不廣泛。分光光度法是測定磷元素最廣泛的分析方法，已應(yīng)用于飼料、食品、土壤、水質(zhì)、肥料等試樣中磷含量的測定[8-12]。

目前飼料中總磷含量測定執(zhí)行的是新發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2018《飼料中總磷的測定 分光光度法》，由于原國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2002使用了多年，根據(jù)使用情況的反饋，有必要進行修訂。為此，按照全國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會的要求，承擔(dān)了對原國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 6437—2002的修訂(國家標(biāo)準(zhǔn)項目計劃編號：20140321-T-469)，主要增修訂內(nèi)容為：(1)增加了方法的檢出限和定量限；(2)增加了磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液保存期；(3)刪除干灰化法中“不適用于含磷酸二氫鈣(Ca(H2PO4)2)的飼料”的內(nèi)容；(4)修訂了標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍(由原標(biāo)準(zhǔn)的0～16 μg/ml修改為0～15.00 μg/ml)。上述增修訂內(nèi)容經(jīng)試驗驗證，修訂后方法更為準(zhǔn)確可靠，適用性更強，結(jié)果令人滿意。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計，帶1 cm石英比色皿，島津企業(yè)管理(中國)有限公司；AB135-S電子天平，精度為0.01 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司；M104箱式馬弗爐，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；ED56電熱干燥箱，德國Binder公司；SLK 2紅外線加熱板，維根技術(shù)(北京)有限公司；Molatom 1810A純水機，中國重慶摩爾水處理設(shè)備有限公司。

硝酸、高氯酸、鹽酸、磷酸：分析純，永華科技(江蘇)有限公司；磷酸二氫鈣：按無水物計，Ca(H2PO4)2的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為92%，磷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24.4%，Merck公司；鹽酸溶液：1+1(V1+V2)；50 μg/ml磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液：取105℃干燥至恒重的磷酸二氫鉀，置干燥器中，冷卻后，精密稱取0.219 5 g，溶解于水，定量移入1 000 ml容量瓶中，加硝酸3 ml，加水稀釋至刻度，搖勻，即得，置聚乙烯瓶中4℃下可儲存1個月；釩鉬酸銨顯色劑：稱取偏釩酸銨1.25 g，加水200 ml加熱溶解，冷卻后再加入250 ml硝酸，另稱取鉬酸銨25 g，加水400 ml加熱溶解，在冷卻的條件下，將2種溶液混合，用水稀釋至1 000 ml，避光保存，若生成沉淀，則不能繼續(xù)使用；試驗用水：GB/T 6682中規(guī)定的三級水；飼料樣品來自于市場收集。

1.2 試驗方法

1.2.1試樣前處理

1.2.1.1干灰化法

稱取試樣(2～5)g，精確到1 mg，置于坩堝中，在電爐上小心炭化，再放入高溫爐，在550℃灼燒3 h(或測粗灰分繼續(xù)進行)，取出冷卻，加鹽酸溶液10 ml和硝酸數(shù)滴，小心煮沸約10 min，冷卻后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，為試樣溶液。

1.2.1.2濕法消解法

稱取試樣(0.5～5)g，精確到1 mg，置于凱氏燒瓶中，加入硝酸30 ml，小心加熱煮沸至黃煙逸盡，稍冷，加入高氯酸10 ml，繼續(xù)加熱至高氯酸冒白煙(不得蒸干)，溶液基本無色，冷卻，加水30 ml，加熱煮沸，冷卻后用水轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，為試樣溶液。

1.2.1.3鹽酸溶解法(適用于微量元素預(yù)混料)

稱取試樣(0.2～1)g，精確到1 mg，置于100 ml燒杯中，緩緩加入鹽酸溶液10 ml，使其全部溶解，冷卻后轉(zhuǎn)入100 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，為試樣溶液。

1.2.2磷標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

準(zhǔn)確移取磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液0、1、2、5、10、15 ml于50 ml容量瓶中(即相當(dāng)于含磷量為0、50、100、250、500、750 μg)，于各容量瓶中分別加入釩鉬酸銨顯色劑10 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，常溫下放置10 min以上，以0 ml磷標(biāo)準(zhǔn)溶液為參比，用1 cm比色皿，在400 nm波長下用分光光度計測各溶液的吸光度。以磷含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。

1.2.3試樣測定

準(zhǔn)確移取試樣溶液(1～10)ml(含磷量(50～750)μg)于50 ml容量瓶中，加入釩鉬酸銨顯色劑10 ml，用水稀釋至刻度，搖勻，常溫下放置10 min以上，用1 cm比色皿，在400 nm波長下用分光光度計測定試樣溶液的吸光度，通過工作曲線計算試樣溶液的磷含量。若試樣溶液磷含量超過磷標(biāo)準(zhǔn)工作曲線范圍，應(yīng)對試樣溶液進行稀釋。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測波長的選擇

按“1.2.2”項下制備成的磷標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別選擇在400、420、430、440 nm處用分光光度計測各溶液的吸光度。以磷溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，吸光度值(y)為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線。得出不同波長下測得的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性參數(shù)，結(jié)果見圖1。由圖1可知，測定時選擇吸收波長400 nm，標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)性最好且吸光度值較大，靈敏度高，選擇400 nm為檢測波長是適宜的。

圖1 不同檢測波長處測定的磷標(biāo)準(zhǔn)曲線比較圖

2.2 磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液保質(zhì)期的確定

取在冰箱中4℃保存的磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液(50 μg/ml)，按“1.2.2”項下分別制備成1.0 、5.0和15.0 μg/ml標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別在0、1、7、14、21、28、35、40、50 d測定由磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液制備成的上述標(biāo)準(zhǔn)工作液3個濃度點吸光度值隨放置天數(shù)的變化情況，結(jié)果見圖2。試驗結(jié)果表明，制備的標(biāo)準(zhǔn)工作液3個濃度點吸光度值隨放置天數(shù)的變化情況為：0～35 d內(nèi)，3個濃度點的吸光度值基本變化不大，但35 d后，吸光度值有顯著變化，考慮到方法的普適性，故確定磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液(5.0 μg/ml)在4℃冰箱中保存的時間為1個月是較為適宜的。

圖2 磷標(biāo)準(zhǔn)貯備液的穩(wěn)定性試驗圖

2.3 待測試樣和標(biāo)準(zhǔn)溶液放置穩(wěn)定性的確定

在400 nm 吸收波長下，選擇試樣溶液(含磷量5.6 μg/ml)和磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(含磷量5.0 μg/ml)，在(0～120)min進行時間掃描試驗，繪制時間-吸光度曲線，結(jié)果見圖3。試驗結(jié)果表明，隨著靜置時間的延長，試樣溶液(含磷量5.6 μg/ml)和磷標(biāo)準(zhǔn)溶液(含磷量5.0 μg/ml)吸光度值變化較小，放置10 min后，在110 min內(nèi)吸光度基本穩(wěn)定，表明顯色反應(yīng)所生成的絡(luò)合物較為穩(wěn)定。

圖3 待測溶液放置時間-吸光度曲線圖

2.4 磷酸二氫鈣對干灰化法測定飼料中總磷的影響

2.4.1飼料中添加磷酸二氫鈣回收率試驗結(jié)果

為了考察磷酸二氫鈣對干灰化法測定飼料中總磷的影響，按“1.2.1.1干灰化法”對不同飼料樣品進行了加標(biāo)回收率試驗，其中玉米稱樣量約為5.0 g，豆粕、畜配合飼料和畜濃縮飼料約為2.5 g，水產(chǎn)配合飼料約為2.0 g，畜禽用復(fù)合預(yù)混合飼料約為1.0 g，采用添加磷酸二氫鈣(按無水物計)3個不同濃度水平(折算成磷的濃度為：2.32、4.64和9.28 μg/ml)進行試驗，每個水平平行測定5次，結(jié)果見圖4。試驗結(jié)果表明，回收率為95.2%～106.3%，RSD為0.4%～3.2%，添加磷酸二氫鈣對飼料產(chǎn)中總磷測定無影響。

圖4 樣品添加磷酸二氫鈣3個不同濃度水平的回收率試驗結(jié)果分布圖

2.4.2飼料中添加磷酸二氫鈣后不同稱樣量對總磷測定的影響

為了考察飼料中添加磷酸二氫鈣后不同稱樣量對總磷測定的影響，取添加磷酸二氫鈣(折算成磷的濃度為9.28 μg/ml)的玉米、水產(chǎn)配合飼料、畜濃縮飼料、畜禽用復(fù)合預(yù)混合飼料，分別稱取約2.0、2.5和5.0 g進行試驗，每個稱取水平平行測定3次，按“1.2.1.1干灰化法”對不同飼料樣品進行了測定，結(jié)果見圖5。試驗結(jié)果表明，飼料中添加磷酸二氫鈣后不同稱樣量對總磷的測定無影響

圖5 飼料中添加磷酸二氫鈣后不同稱樣量對總磷測定的影響

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1線性范圍

按“1.2.2”制備成的0、1.00、2.00、5.00、10.00和15.00 μg/ml的磷系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，在400 nm處用分光光度計測定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度值。以磷溶液濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度值(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，試驗結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為(0～15.00)μg/ml時，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999 9。

2.5.2檢出限(LOD)和定量限確定(LOQ)

以扣除空白值后的吸光度為0.01相對應(yīng)的濃度值為檢出限，以3.3倍檢出限濃度作為定量限，其測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)約為15%[13]。

式中，a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；V為試樣的體積。

定量限確定=3.3×LOD。按不同時間段測的標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算檢出限和定量限，結(jié)果見表1。由表1可知，不同時間段繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算的檢出限和定量限分別為(0.001 08～0.001 33)μg/ml和(0.003 56～0.004 39)μg/ml；當(dāng)取樣量5 g，定容至100 ml時，檢出限和定量限分別為(10.8～13.3)mg/kg和(35.6～43.9)mg/kg，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)在實際使用中的考慮，將檢出限定為20 mg/kg，定量限定為60 mg/kg是合理的。

表1 檢出限和定量限測定結(jié)果

2.5.3精密度試驗

取磷含量不同的飼料樣品按“1.2.1試樣前處理”和“1.2.3試樣測定”處理，分別測定5次，測定結(jié)果見表2。由表2可知，試樣中磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)≤0.5%時，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.0%～2.9%，試樣中磷質(zhì)量分?jǐn)?shù)>0.5%時，RSD在0.8%～1.2%，方法的精密較好，符合飼料檢驗對精密度的要求。

表2 方法精密度的試驗結(jié)果(n=5)

2.5.4回收率試驗

為了考察方法準(zhǔn)確度，分別按“1.2.1試樣前處理”對不同飼料樣品進行了加標(biāo)回收率試驗，其中雞肉骨粉、豆粕、畜配合飼料、畜濃縮飼料稱樣量為2.5 g，畜禽用復(fù)合預(yù)混合飼料約為1.0 g，畜禽用微量元素預(yù)混合飼料約為1.0 g，采用3個不同水平的添加量，每個水平平行測定3次，結(jié)果見表3。由表3可知，回收率為94.6%～98.2%，RSD為1.8%～4.1%，方法具有較好的準(zhǔn)確度。

表3 方法的加標(biāo)回收率試驗結(jié)果(n=3)

2.6 試樣測定

為了考察方法適用性，按修訂后的方法對各類飼料產(chǎn)品中總磷的含量進行了測定，每個平行測定3份。RSD為0.1%～2.9%，均小于3%，結(jié)果見表4。

表4 各類飼料產(chǎn)品中總磷的測定結(jié)果(n=3)

續(xù)表

3 結(jié)論

修訂后的方法，經(jīng)試驗驗證，方法的線性范圍、回收率、測定的精密度、檢出限和定量限等技術(shù)指標(biāo)均較好，應(yīng)用于實際各類飼料產(chǎn)品中總磷含量的測定，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、具有很高的穩(wěn)定性。