唐純明，何自力，李軍

湖南師范大學第一附屬醫(yī)院 湖南省人民醫(yī)院，長沙431000

肝癌具有生長迅速、侵襲轉(zhuǎn)移能力強、惡性度高、預后差等特點[1]，尋找治療肝癌的有效藥物迫在眉睫。山慈菇為常用抗腫瘤中藥之一，是蘭科植物中的干燥假鱗莖聚生，具有燥濕化痰、消腫和軟堅散結(jié)等作用[2～4]。近年來多項研究顯示，山慈菇有廣泛的抗腫瘤、抗炎、抑制血管生成以及抑制瘢痕增生等作用，但其抗肝腫瘤作用機制尚未完全闡明[3]。炎癥因子TNF、IL-1β、IL-6、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)可調(diào)節(jié)細胞周期、增殖和凋亡，參與腫瘤的發(fā)病[5～7]。IL-1β和IL-6在正常情況下表達水平較低，腫瘤狀態(tài)下可誘導其高表達[8,9]。2017年6月～2019年3月，本研究觀察了山慈菇提取物對肝癌SMMC-7721細胞增殖及TNF-α、IL-1β、IL-6表達的影響，從炎癥反應角度探討山慈菇提取物的抗腫瘤機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要實驗材料 人肝癌SMMC-7721細胞購自中國科學院細胞庫，編號TCHu52。山慈菇購于北京同仁堂藥店。山慈菇提取物的配制參照文獻[10]，將山慈菇水煎劑配制成1.5 g/mL的儲備液，分裝后于4 ℃儲存待用。FBS和DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司。PBS、CCK-8試劑盒、青霉素-鏈霉素混合液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、結(jié)晶紫染色液、TRIzol試劑購自北京索萊寶科技有限公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。實驗所需引物由廣州艾基生物技術有限公司合成。TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒購自Elascience公司。CO2培養(yǎng)箱、MB-530酶標儀購自BIOBASE公司。奧林巴斯倒置顯微鏡購自上海普赫光電公司。Nanodrop2000型超微量分光光度計購自美國Thermo公司。Mx3000P型熒光定量PCR儀購自美國Agilent公司。

1.2 細胞增殖能力檢測 SMMC-7721細胞置于37 ℃、5%CO2條件培養(yǎng)箱中，在含10% FBS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的SMMC-7721細胞，在96孔板中分別加入含0、100、200、400、600、800、1 000 mg/L山慈菇提取物的完全培養(yǎng)液100 μL，分別于培養(yǎng)24、48、72 h后加入CCK-8試劑測算細胞增殖能力。0、100、200 mg/L的藥物作用24、48、72 h細胞增殖抑制率差異均無統(tǒng)計學意義。400、600、800、1 000 mg/L的藥物作用24、48、72 h細胞增殖抑制率高于0 mg/L者，600、800、1 000 mg/L的藥物作用24、48、72 h細胞增殖抑制率高于400 mg/L者(P均<0.05)。見表1。選取質(zhì)量濃度為400、600、800 mg/L的山慈菇提取物進行后續(xù)實驗。

表1 不同濃度山慈菇提取物對SMMC-7721細胞增殖的影響

注：與同時點0 mg/L組相比，*P<0.05；與同時點400 mg/L組相比，#P<0.05。

1.3 細胞克隆形成能力觀察 取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞，以5×102/孔接種于6孔板中，分為0 mg/L組、400 mg/L組、600 mg/L組、800 mg/L組，分別加入0、400、600、800 mg/L的山慈菇提取物處理24 h，更換常規(guī)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)14 d。用PBS洗滌6孔板中細胞2次，100%的甲醇固定15 min，0.1%結(jié)晶紫液染色15 min，PBS洗去染色液，拍照，觀察克隆形成情況，計算克隆形成率。

1.4 細胞形態(tài)觀察 取對數(shù)生長期SMMC-7721細胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后，按“1.3”方法分組并處理。培養(yǎng)24 h后，光學倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.5 細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA檢測 將SMMC-7721細胞接種于6孔板中，待培養(yǎng)后，按“1.3”方法分組并處理，收集細胞，用TRIzol法收集細胞總RNA，并測定濃度。TNF-α mRNA上游引物序列為5′-GCTGCACTTTGGAGTGATCG-3′、下游引物序列為5′-GAGGGTTTGCTACAACATGGG-3′，長度140 bp；IL-1β mRNA上游引物序列為5′-AGAAGTACCTGAGCTCGCCA-3′、下游引物序列為5′-CTGGAAGGAGCACTTCATCTGT-3′，長度106 bp；IL-6 mRNA上游引物序列為5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′、下游引物序列為5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′，長度149 bp；內(nèi)參GAPDH上游引物序列為5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′、下游引物序列為5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′，長度258 bp。嚴格按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.6 細胞培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-6、TNF-α檢測 對數(shù)生長期SMMC-7721細胞接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，按“1.3”方法分組并處理，24 h后收集各組細胞培養(yǎng)液上清，采用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1 各組SMMC-7721細胞克隆形成能力比較 0、400、600、800 mg/L組克隆形成率分別為100%、76.12%±8.12%、43.43%±6.54%、27.69%±3.38%。400、600、800 mg/L組細胞克隆形成率低于0 mg/L組，600、800 mg/L組克隆形成率低于400 mg/L組(P均<0.05)。

2.2 各組SMMC-7721細胞形態(tài)變化 0 mg/L組細胞排列緊密，呈梭形，形態(tài)飽滿，邊界清楚；而400、600、800 mg/L組隨著藥物濃度增大，細胞形態(tài)皺縮，貼壁差，細胞易脫落，尤以800 mg/L組最明顯。見圖1。

注：A、B、C、D分別為0、400、600、800 mg/L組。

圖1 山慈菇提取物對SMMC-7721細胞形態(tài)的影響

2.3 各組SMMC-7721細胞TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達比較 400、600、800 mg/L組細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達低于0 mg/L組，600、800 mg/L組TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達低于400 mg/L組(P均<0.05)。見表2。

表2 各組SMMC-7721細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表達比較

注：與0 mg/L組相比，*P<0.05；與400 mg/L組相比，#P<0.05。

2.4 各組SMMC-7721細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 400、600、800 mg/L組細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于0 mg/L組，600、800 mg/L組TNF-α、IL-1β、IL-6水平低于400 mg/L組(P均<0.05)。見表3。

表3 各組SMMC-7721細胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

注：與0 mg/L組相比，*P<0.05；與400 mg/L組相比，#P<0.05。

3 討論

山慈菇味辛苦，性微寒，普遍存在于自然界中。其獲取較容易，毒性小，常用于治療炎性水腫、燥熱型矽肺和急性痛風性關節(jié)炎，還具有抑制瘢痕增殖、防止組織粘連形成、提高機體免疫力和護肝等多種作用[2,11]。山慈菇對多種腫瘤如乳腺癌、甲狀腺癌、食管癌、胃癌和大腸癌等具有抑制作用[2,10,12,13]。關于山慈菇提取物抗肝癌細胞就增殖的作用及其具體機制尚未充分闡明。本研究以山慈菇提取物作用于肝癌SMMC-7721細胞，發(fā)現(xiàn)其能有效抑制SMMC-7721細胞的增殖活性，并且呈一定的時間和濃度依賴性。平板克隆形成實驗顯示，SMMC-7721細胞在不同濃度山慈菇提取物作用下，細胞克隆形成能力明顯降低。而且，SMMC-7721細胞在不同濃度山慈菇提取物作用后，細胞形態(tài)發(fā)生了顯著變化，包括細胞變圓、皺縮，貼壁能力差，細胞易脫落，而且藥物濃度越高，細胞脫落越明顯。這進一步說明山慈菇提取物具有抑制SMMC-7721細胞增殖的作用。

TNF-α是炎癥反應的啟動因子，生理狀態(tài)下有助于增強免疫力和抑制腫瘤生長，但當超過一定量時可增大和加重炎癥反應，引起多種病理損傷，促進腫瘤增殖[6]。研究表明，TNF-α參與人乳頭瘤病毒感染后的機體免疫防御，TNF-α高表達可能與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展和腫瘤細胞增殖有關[14]。李京濤等[15]觀察了益脾養(yǎng)肝方對肝癌前病變大鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響，發(fā)現(xiàn)該藥可抑制肝癌癌前病變大鼠病情進展，可能是通過降低TNF-α和IL-6的表達水平來實現(xiàn)的。還有研究發(fā)現(xiàn)，肝癌化療后患者血清中TNF-α、IL-6水平低于確診未治的肝癌患者[16]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)山慈菇提取物作用后，SMMC-7721細胞中TNF-α mRNA表達下調(diào)，細胞分泌TNF-α減少，提示山慈菇提取物可能抑制了TNF-α的表達與分泌。

腫瘤微環(huán)境主要是由腫瘤細胞、免疫細胞、細胞因子、炎癥因子等相互作用而形成的，受多階段、多因素調(diào)控[17]。IL-1家族中，IL-1β與腫瘤發(fā)生發(fā)展關系最為密切，是機體調(diào)控炎癥反應與免疫應答的重要因子[18]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β作為腫瘤免疫重要因子之一，其在肝癌、胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤中高水平表達[19,20]。IL-1β可能通過啟動腫瘤增殖和抗凋亡等途徑參與多種惡性腫瘤的疾病進程。IL-6也是一種促炎細胞因子，是連接腫瘤與炎癥的關鍵炎癥因子[21,22]。在致癌物誘導的小鼠肝癌模型中，血清IL-6水平升高，而薏苡仁提取物能明顯降低血清IL-6水平，并且能有效抑制成瘤率。也有研究發(fā)現(xiàn)，辣椒堿對SMMC-7721細胞增殖具有明顯抑制作用，有可能與其抑制細胞中IL-6的表達與分泌有關[23]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)山慈菇提取物作用后，SMMC-7721細胞中IL-1β、IL-6 mRNA表達和IL-1β、IL-6分泌水平均明顯降低，提示山慈菇提取物的增殖抑制作用可能與抑制IL-1β、IL-6的表達和分泌有關。

綜上所述，山慈菇提取物對SMMC-7721細胞增殖具有顯著抑制作用，還可抑制細胞中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達與分泌。山慈菇提取物可能通過抑制炎癥因子分泌，調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，從而起到抑制腫瘤細胞增殖的作用。通過山慈菇提取物干預TNF-α、IL-1β、IL-6的表達與分泌有望成為肝癌等腫瘤疾病治療的新策略。關于山慈菇提取物對腫瘤細胞增殖及炎癥因子表達抑制作用所涉及的具體信號通路，還有待進一步探索。