不同初始補(bǔ)液速率對(duì)內(nèi)毒素休克豬肺損傷的影響*

趙玉乾 胡 波 李 琪 史川川 項(xiàng) 輝 李建國(guó)

內(nèi)毒素性休克是由全身炎性反應(yīng)和失控宿主反應(yīng)導(dǎo)致以外周血管舒張為特征的休克類型，膿毒癥是其最常見(jiàn)的原因[1]。隨著休克情況的加重，機(jī)體各個(gè)臟器會(huì)出現(xiàn)不同程度的損傷，而肺是最常見(jiàn)也是最先受損的器官之一[2]。早期恰當(dāng)充分的液體復(fù)蘇是內(nèi)毒素性休克治療的基石，但過(guò)量的液體輸注又與臨床不良結(jié)局相關(guān)[3]。因此早期液體復(fù)蘇的啟動(dòng)時(shí)機(jī)、輸注量和輸注速率一直是研究熱點(diǎn)，但卻沒(méi)有明確的相關(guān)建議指導(dǎo)臨床治療。本研究致力通過(guò)觀察初始不同液體復(fù)蘇速率對(duì)內(nèi)毒素性休克豬肺損傷的影響，以期為內(nèi)毒素性休克早期液體復(fù)蘇的速率設(shè)定提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

普通級(jí)巴馬香豬24頭，體質(zhì)量為30±3kg，雌雄不拘(由武漢大學(xué)中南醫(yī)院動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)：4207470736)。主要試劑：大腸埃希菌內(nèi)毒素(LPS，0111：B4，Sigma，USA)，10%戊巴比妥鈉、Tunel試劑盒、BSA牛血清白蛋白(美國(guó)Roche公司)，蛋白酶K、DAPI染液、細(xì)胞破膜液、抗熒光淬滅封片劑(武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理

1.2.1動(dòng)物飼養(yǎng)與麻醉置管：實(shí)驗(yàn)豬手術(shù)前在動(dòng)物房飼養(yǎng)2天以適應(yīng)環(huán)境，操作前一天禁食12h，不禁水。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，首先以3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)肌肉注射行誘導(dǎo)麻醉。誘導(dǎo)后動(dòng)物取仰臥位，連接心電監(jiān)護(hù)儀記錄生命體征基線水平。行氣管切開(kāi)連接呼吸機(jī)機(jī)械通氣，置入頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管(雙腔)和股動(dòng)脈導(dǎo)管。頸內(nèi)靜脈置管后持續(xù)給予3%戊巴比妥鈉(2mg/kg/h)和地西泮(0.2mg/kg/h)維持麻醉。置管操作完成后觀察1h至生命體征恢復(fù)至基線水平。

1.2.2內(nèi)毒素休克模型制備：參考張家瑛等[4]的方案，每頭豬均給予LPS，總量20μg/kg，30min內(nèi)通過(guò)靜脈輸液泵泵注完畢。當(dāng)動(dòng)脈收縮壓較基礎(chǔ)水平下降40%時(shí)界定為模型制備成功。

1.2.3動(dòng)物分組和初始液體復(fù)蘇(3h內(nèi))策略：依照隨機(jī)對(duì)照表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為4組，內(nèi)毒素休克組(n=6)，造模成功后的頭3h內(nèi)不進(jìn)行液體復(fù)蘇；慢速補(bǔ)液組(n=6)：造模成功后即開(kāi)始液體復(fù)蘇，并將此時(shí)記錄為零時(shí)，經(jīng)頸內(nèi)靜脈導(dǎo)管按照10ml/kg/h速率勻速輸注30ml/kg乳酸林格氏液，3h輸注完畢；中速補(bǔ)液組(n=6)：造模成功后以30ml/kg/h速率勻速輸注30ml/kg乳酸林格氏液，1h輸注完畢，隨后2h不進(jìn)行液體復(fù)蘇；快速補(bǔ)液組(n=6)：造模成功后以120ml/kg/h速率勻速輸注30ml/kg乳酸林格氏液，15min輸注完畢，隨后2h 45min不進(jìn)行液體復(fù)蘇。各組從零時(shí)(造模成功)即開(kāi)始靜脈泵入去甲腎上腺素維持血壓，目標(biāo)血壓為基線水平。

1.2.43-12h的復(fù)蘇策略：3h后各組均按照以下流程進(jìn)行復(fù)蘇，如血壓水平降至基線值80%以下，重新啟動(dòng)乳酸林格氏液復(fù)蘇，以10ml/kg/h速率輸注，同時(shí)聯(lián)合去甲腎上腺素泵入，一旦血壓恢復(fù)至基線水平則停止液體復(fù)蘇。這一策略持續(xù)至復(fù)蘇后12h。12h后以過(guò)量鎮(zhèn)靜劑聯(lián)合呼吸抑制方式處死動(dòng)物。

1.3 觀察指標(biāo)和方法

1.3.1動(dòng)脈血乳酸水平監(jiān)測(cè)：實(shí)驗(yàn)中各組動(dòng)物注射LPS前及液體復(fù)蘇0h、3h、6h、9h及12h分別采集動(dòng)脈血0.3ml進(jìn)行乳酸檢測(cè)并計(jì)算乳酸清除率。6h乳酸清除率=(0h乳酸值-6h乳酸值)/0h乳酸值×100%；12h乳酸清除率=(0h乳酸值-12h乳酸值)/0h乳酸值×100%。

1.3.2肺組織病理學(xué)檢測(cè)：動(dòng)物處死后，迅速留取適量肺組織，4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋切片行蘇木精-伊紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。參考Mrozek等[5]的方法，根據(jù)肺組織是否出現(xiàn)水腫、壞死、出血和脂肪壞死及血管炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等對(duì)肺組織進(jìn)行病理學(xué)評(píng)分。

1.3.3肺組織髓過(guò)氧化物酶(MPO)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)水平檢測(cè)：取豬肺組織約0.3cm見(jiàn)方的組織塊，用4%多聚甲醛液固定24h，石蠟包埋切片，行免疫熒光法檢查MPO、IL-1β、IL-6，陽(yáng)性表達(dá)為視野內(nèi)組織被染成紅色，對(duì)紅色染色細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.4肺組織凋亡細(xì)胞分析：采用Tunnel染色法檢查肺內(nèi)皮、肺上皮細(xì)胞凋亡，陽(yáng)性表達(dá)為視野內(nèi)組織被染成綠色，并記錄陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算凋亡指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 血清乳酸值和乳酸清除率

血?dú)夥治鰴z查乳酸結(jié)果顯示(表1)，內(nèi)毒素休克組及各補(bǔ)液組乳酸基礎(chǔ)值和補(bǔ)液0h值組間均無(wú)明顯差異(P>0.05)。各組間3h-12h乳酸水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與內(nèi)毒素休克組相比，各補(bǔ)液組在補(bǔ)液3h-12h的乳酸值均顯著降低(P<0.05)；在不同補(bǔ)液速率組中，中速補(bǔ)液組及快速補(bǔ)液組在補(bǔ)液3h-12h的乳酸值顯著低于慢速補(bǔ)液組(P<0.05)，中速補(bǔ)液組及快速補(bǔ)液組兩者乳酸值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各補(bǔ)液組6h及12h乳酸清除率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與慢速補(bǔ)液組相比，中速補(bǔ)液組及快速補(bǔ)液組6h及12h乳酸清除率明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)；與快速補(bǔ)液組相比，中速補(bǔ)液組6h及12h乳酸清除率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 各組各測(cè)量時(shí)間點(diǎn)乳酸值

注：與內(nèi)毒素休克組比較，1)P<0.05；與慢速補(bǔ)液組比較，2)P<0.05；與同組基礎(chǔ)值比較，3)P<0.05

表2 各補(bǔ)液組6h和12h乳酸清除率

注：與慢速補(bǔ)液組比較，1)P<0.05

2.2 肺組織病理學(xué)改變

肺組織HE染色結(jié)果顯示(圖1)，內(nèi)毒素休克組豬肺泡結(jié)構(gòu)破壞明顯，肺間質(zhì)增厚，肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)彌漫性出血、廣泛炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；慢速補(bǔ)液組豬肺可見(jiàn)肺泡正常結(jié)構(gòu)被破壞，肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)大量出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但相較于內(nèi)毒素休克組輕；中速補(bǔ)液組豬肺可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)少量出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；快速補(bǔ)液組豬肺可見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞， 肺泡腔和肺間質(zhì)內(nèi)少量出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，但較中速補(bǔ)液組重。各組肺組織病理評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=19.26，P<0.05)。相較于內(nèi)毒素休克組，早期補(bǔ)液組肺組織病理評(píng)分均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同速率的補(bǔ)液各組中，中速補(bǔ)液組的肺組織病理評(píng)分顯著小于慢速補(bǔ)液組和快速補(bǔ)液組，同時(shí)快速補(bǔ)液組小于慢速補(bǔ)液組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：內(nèi)毒素休克組；B：慢速補(bǔ)液組；C：中速補(bǔ)液組;D：快速補(bǔ)液組;E：各組肺組織病理評(píng)分(與內(nèi)毒素休克組比較，*P<0.05；與慢速補(bǔ)液組比較，#P<0.05；與中速補(bǔ)液組比較，ΔP<0.05)

圖1 各組豬肺組織HE染色(光學(xué)顯微鏡，×400)

2.3 肺組織MPO水平檢測(cè)

豬肺組織免疫熒光染色顯示(圖2)，各組肺組織MPO陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.74，P<0.05)；相較于內(nèi)毒素休克組，早期補(bǔ)液各組MPO陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)都明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同速率的補(bǔ)液組中，中速補(bǔ)液組的MPO陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著小于慢速補(bǔ)液組和快速補(bǔ)液組，同時(shí)快速補(bǔ)液組小于慢速補(bǔ)液組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 肺組織IL-6水平檢測(cè)

豬肺組織免疫熒光染色顯示(圖3)，各組肺組織IL-6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=50.82，P<0.05)；相較于內(nèi)毒素休克組，早期補(bǔ)液各組IL-6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)都明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同速率的輸液組中，中速補(bǔ)液組的IL-6陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著小于慢速補(bǔ)液組和快速補(bǔ)液組，同時(shí)快速補(bǔ)液組小于慢速補(bǔ)液組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：內(nèi)毒素休克組；B：慢速補(bǔ)液組；C：中速補(bǔ)液組;D：快速補(bǔ)液組;E：各組肺組織MPO陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(與內(nèi)毒素休克組比較，*P<0.05；與慢速補(bǔ)液組比較，#P<0.05；與中速補(bǔ)液組比較，ΔP<0.05)

圖2 各組豬肺細(xì)胞MPO免疫熒光染色(熒光顯微鏡, ×400)

A：內(nèi)毒素休克組；B：慢速補(bǔ)液組；C：中速補(bǔ)液組;D：快速補(bǔ)液組;E：各組肺組織MPO陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(與內(nèi)毒素休克組比較，*P<0.05；與慢速補(bǔ)液組比較，#P<0.05；與中速補(bǔ)液組比較，ΔP<0.05)

圖3 各組豬肺細(xì)胞IL-6免疫熒光染色(熒光顯微鏡, ×400)

2.5 肺組織IL-1β檢測(cè)

豬肺組織免疫熒光染色顯示(圖4)，各組肺組織IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=20.18，P<0.05)；相較于內(nèi)毒素休克組，早期補(bǔ)液各組肺組織IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)都明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同速率的輸液組中，中速補(bǔ)液組的IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著小于慢速補(bǔ)液組和快速補(bǔ)液組，同時(shí)快速補(bǔ)液組小于慢速補(bǔ)液組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.6 肺組織細(xì)胞凋亡水平檢測(cè)

豬肺組織Tunnel熒光染色顯示(圖5)，各組肺組織IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.64，P<0.05)；相較于內(nèi)毒素休克組，早期補(bǔ)液各組凋亡細(xì)胞指數(shù)均明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；在不同速率的補(bǔ)液組中，中速補(bǔ)液組的凋亡細(xì)胞指數(shù)顯著小于慢速補(bǔ)液組和快速補(bǔ)液組，同時(shí)快速補(bǔ)液組小于慢速補(bǔ)液組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A：內(nèi)毒素休克組；B：慢速補(bǔ)液組；C：中速補(bǔ)液組;D：快速補(bǔ)液組;E：各組肺組織IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(與內(nèi)毒素休克組比較，*P<0.05；與慢速補(bǔ)液組比較，#P<0.05；與中速補(bǔ)液組比較，ΔP<0.05)

圖4 各組豬肺IL-1β免疫熒光染色(熒光顯微鏡，×400)

A：內(nèi)毒素休克組；B：慢速補(bǔ)液組；C：中速補(bǔ)液組;D：快速補(bǔ)液組;E：各組肺組織IL-1β陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)(與內(nèi)毒素休克組比較，*P<0.05；與慢速補(bǔ)液組比較，#P<0.05；與中速補(bǔ)液組比較，ΔP<0.05)

圖5 各組豬肺細(xì)胞凋亡tunnel染色(熒光顯微鏡,×400)

3 討 論

內(nèi)毒素性休克在臨床的主要體現(xiàn)就是膿毒癥。膿毒癥是由于感染引起的失調(diào)宿主反應(yīng)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙。膿毒癥患者由于細(xì)菌、病毒等病原體的作用，其血管張力降低，血容量不足，組織器官出現(xiàn)缺血缺氧，同時(shí)由于感染導(dǎo)致機(jī)體大量炎性因子的釋放，氧化與抗氧化機(jī)制的失衡，共同導(dǎo)致各器官出現(xiàn)損傷[6, 7]。

在膿毒癥中，由于外周血管張力的降低和血管滲透性增加導(dǎo)致有效循環(huán)血容量不足，許多器官組織處于低灌注狀態(tài)出現(xiàn)缺血、缺氧損傷[8, 9]。早期的液體復(fù)蘇治療作為膿毒癥治療中的重要方法，可有效糾正循環(huán)血容量不足，提高膿毒癥患者氧輸送能力，改善組織器官灌注，穩(wěn)定及改善膿毒癥患者內(nèi)循環(huán)及微循環(huán)缺氧狀態(tài)，減輕器官損傷，降低病死率[10-12]。本研究結(jié)果顯示，內(nèi)毒素休克動(dòng)物模型建立后動(dòng)物血乳酸水平明顯升高，補(bǔ)液組經(jīng)過(guò)液體復(fù)蘇后,3h時(shí)其乳酸水平較休克值有所降低，但乳酸清除率有所差別，快速及中速補(bǔ)液組乳酸清除率水平顯著高于慢速補(bǔ)液組。這一結(jié)果也驗(yàn)證了早期的液體復(fù)蘇治療有助于改善膿毒癥患者器官組織低灌注狀態(tài)，改善組織微循環(huán)。同時(shí)快速的液體復(fù)蘇策略在改善組織灌注這一方面效果更加顯著，這與林敏等[13]的研究結(jié)果相一致。分析其原因，可能是早期快速的液體復(fù)蘇策略能更快的補(bǔ)充血容量，恢復(fù)由于血管張力改變導(dǎo)致的循環(huán)血容量相對(duì)不足的狀況，保證了足夠的灌注壓和灌注血流，從而助于改善組織器官缺血缺氧的低灌注狀態(tài)。

此外炎性因子介導(dǎo)的細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)也是膿毒癥肺損傷的重要機(jī)制之一。膿毒癥時(shí)炎性細(xì)胞被激活，IL-1β、IL-6等炎性介質(zhì)大量釋放，在其與趨化因子的共同作用下，中性粒細(xì)胞通過(guò)吞噬、脫顆粒等反應(yīng)造成肺泡上皮細(xì)胞及血管上皮細(xì)胞的損傷。同時(shí)中性粒細(xì)胞內(nèi)的MPO在炎性介質(zhì)的激活下催化過(guò)氧化氫生成次氯酸，次氯酸又與巰基及甲琉?；磻?yīng)，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，損傷肺組織及肺血管內(nèi)皮細(xì)胞[14，15]。炎性介質(zhì)作為決定肺損傷是否發(fā)生的關(guān)鍵，相關(guān)研究表明減少炎性因子及炎性介質(zhì)的釋放，可減輕其介導(dǎo)的細(xì)胞及氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而減少膿毒癥時(shí)肺損傷[ 14-18]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與內(nèi)毒素休克組相比，補(bǔ)液組的肺組織病理評(píng)分、IL-1β和IL-6等炎性介質(zhì)指標(biāo)、氧化指標(biāo)MPO及肺凋亡指數(shù)均明顯降低。在補(bǔ)液組中，相較于快速及慢速補(bǔ)液組，中速補(bǔ)液組其肺組織病理評(píng)分、IL-1β、IL-6、MPO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及肺凋亡指數(shù)降低更明顯。這一結(jié)果說(shuō)明在膿毒癥發(fā)生時(shí)，早期的液體復(fù)蘇治療可減輕膿毒癥時(shí)的炎癥反應(yīng)，減少作用于肺組織的炎性介質(zhì)的釋放，降低肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)。復(fù)蘇策略對(duì)其損傷程度也有所不同，相較于快速及慢速補(bǔ)液，以30ml/kg/h的中等速率進(jìn)行液體復(fù)蘇減輕肺損傷的效果更加顯著，而這與感染性休克指南所提出的3h內(nèi)輸注至少30ml/kg晶體液建議相比速率會(huì)更快(1h完成)，提示指南的早期復(fù)蘇速率的設(shè)定可能存在提升的空間。

綜上所述，早期的液體復(fù)蘇治療確實(shí)有助于減輕內(nèi)毒素休克豬的早期肺損傷，這一作用可能是與早期及時(shí)逆轉(zhuǎn)機(jī)體低灌注狀態(tài)，減輕炎性介質(zhì)的釋放，減少炎性細(xì)胞及其氧化應(yīng)激作用對(duì)肺泡細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)，同時(shí)不同的初始復(fù)蘇速率減輕肺損傷的程度也有所不同，以30ml/kg/h的中等速率進(jìn)行液體復(fù)蘇效果最佳。

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