趙景明，李 惠，李國(guó)峰

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，吉林 長(zhǎng)春 130000）

結(jié)腸癌為消化道高發(fā)腫瘤，致死率高居惡性腫瘤的第2 位［1］，該疾病早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時(shí)即為晚期，失去了手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)，化療是主要治療手段，但其較大的毒副作用及耐藥性而難以讓人滿意［2］。乙酰紫草素為紫草主要活性成分，對(duì)黑色素瘤B16F10、骨肉瘤S180、Lewis 肺癌及胃癌細(xì)胞SGC-7901 等均有較好的抑制作用［3-6］。研究發(fā)現(xiàn)，中藥聯(lián)合化療藥物能提高抗腫瘤療效，顯著降低化療藥物的毒副作用［7］，因此，本研究探討乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞增殖及凋亡的影響。

1 材料

1.1 試劑與藥物 乙酰紫草素（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20160518，純度＞98%）；奧沙利鉑（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)20160608）；MTT檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)20160921）；Annexin V-FITC ／PI（上海翊圣生物科技有限公司，批號(hào) 40302ES60）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)20161125）、實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)試劑盒（批號(hào)20160917）（日本TaKaRa 公司）；p-PI3K（批號(hào)ab32089）、p-Akt（批號(hào)ab38449）、GAPDH 抗體（批號(hào)ab8245）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.2 細(xì)胞 人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞，來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 儀器 WD-2102A 型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（北京六一儀器廠）；FACS Canto II 流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；ABI 7500 快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國(guó)ABI 公司）；EBX-700 蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（上海書(shū)俊儀器設(shè)備有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 常規(guī)條件下，將HT29 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105／mL，以每孔200 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為空白組、乙酰紫草素組（10 μmol／L）、奧沙利鉑組（1 μmol／L）和聯(lián)合給藥組（10 μmol／L 乙酰紫草素+1 μmol／L 奧沙利鉑），各組的藥物劑量設(shè)置依據(jù)于徐錦程［8］、薛德冬等［9］報(bào)道，并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入含有相應(yīng)終濃度藥物的完全培養(yǎng)基處理24、48、72 h，測(cè)定490 nm 處光密度值（OD），細(xì)胞增殖抑制率＝（1-OD給藥組／OD空白組）×100%。

2.2 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 常規(guī)條件下，將HT29 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，以每孔1×106個(gè)細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分為空白組、乙酰紫草素組（10 μmol／L）、奧沙利鉑組（1 μmol／L）和聯(lián)合給藥組（10 μmol／L 乙酰紫草素+1 μmol／L 奧沙利鉑），細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液，加入含有相應(yīng)終濃度藥物的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。4 ℃下離心收集細(xì)胞，并在預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液中重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC ／PI 溶液，避光孵育20 min 后在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)，Cell Quest 軟件分析細(xì)胞凋亡率。

2.3 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因檢測(cè) 按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后收集，TRIzol 提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄法獲取cDNA，實(shí)時(shí)定量PCR 反應(yīng)體系為6 μL蒸餾水、2 μL cDNA、1 μL 正向引物、1 μL 反向引物、10 μL 2×SYBR Green Mix。采用2-△△Ct法，以GAPDH 為內(nèi)參基因，引物由上?；鶢栴D生物公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

2.4 細(xì)胞PI3K／Akt 通路相關(guān)蛋白檢測(cè) 按“2.2”項(xiàng)下方法處理細(xì)胞后收集，加入適量RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法測(cè)定細(xì)胞總蛋白濃度，確定蛋白上樣量后，經(jīng)12% SDS-PAGE 凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，加入稀釋后的p-PI3K、p-Akt 及GAPDH 抗體（均為1∶2 000），4 ℃下孵育過(guò)夜，加入對(duì)應(yīng)二抗，室溫下孵育0.5 h。洗膜后顯色、曝光、拍照，分析各條帶光密度值，并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行處理。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞增殖的影響 HT29 細(xì)胞經(jīng)乙酰紫草素、奧沙利鉑和聯(lián)合給藥處理24、48、72 h 后，細(xì)胞增殖抑制率均增加（P＜0.05）；與乙酰紫草素組比較，奧沙利鉑組的細(xì)胞增殖抑制率增加（P＜0.05）；聯(lián)合給藥組的細(xì)胞增殖抑制率高于乙酰紫草素組及奧沙利鉑組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝5）Tab.2 Effect of acetyl shikonin combined with oxaliplatin on HT29 cell proliferation（±s，n＝5）

表2 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝5）Tab.2 Effect of acetyl shikonin combined with oxaliplatin on HT29 cell proliferation（±s，n＝5）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與乙酰紫草素組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，△P＜0.05。

3.2 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞凋亡率的影響 HT29 細(xì)胞經(jīng)乙酰紫草素、奧沙利鉑和聯(lián)合給藥處理48 h 后，細(xì)胞凋亡率均增加（P＜0.05）；與乙酰紫草素組比較，奧沙利鉑組的細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.05）；聯(lián)合給藥組的細(xì)胞凋亡率高于乙酰紫草素組及奧沙利鉑組（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

3.3 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞Ki-67、Bcl-2 及BaxmRNA 表達(dá)的影響 HT29 細(xì)胞經(jīng)乙酰紫草素、奧沙利鉑和聯(lián)合給藥處理48 h 后，BaxmRNA 表達(dá)增加，而Ki-67、Bcl-2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；與乙酰紫草素組比較，奧沙利鉑組BaxmRNA 表達(dá)增加，而Ki-67、Bcl-2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05）；聯(lián)合給藥組對(duì)BaxmRNA 表達(dá)的促進(jìn)作用，Ki-67、Bcl-2 mRNA 表達(dá)的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞Ki-67、Bcl-2及Bax mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.3 Effects of acetyl shikonin combined with oxaliplatin on the mRNA expressions of Ki-67，Bcl-2 and Bax in HT29 cells（±s，n＝5）

表3 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞Ki-67、Bcl-2及Bax mRNA 表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.3 Effects of acetyl shikonin combined with oxaliplatin on the mRNA expressions of Ki-67，Bcl-2 and Bax in HT29 cells（±s，n＝5）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與乙酰紫草素組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，△P＜0.05。

圖1 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞凋亡率的影響（±s，n＝5）Fig.1 Effect of acetyl shikonin combined with oxaliplatin on HT29 cell apoptosis rate（±s，n＝5）

3.4 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞PI3K／Akt 信號(hào)通路的影響 人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞經(jīng)乙酰紫草素、奧沙利鉑和聯(lián)合給藥處理48 h 后，p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)均降低（P＜0.05）；與乙酰紫草素組比較，奧沙利鉑組的p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；聯(lián)合給藥組的p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)均低于乙酰紫草素組及奧沙利鉑組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

4 討論

隨著人們攝入膳食纖維和碳水化合物減少，脂肪增加，結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年遞增［10］。乙酰紫草素存在于紫草科植物紫草的根中，可以抑制人結(jié)腸癌HCT116 細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，但關(guān)于該成分與化療藥物的聯(lián)合使用未見(jiàn)報(bào)道［9］。本研究發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，乙酰紫草素組、奧沙利鉑組及聯(lián)合給藥組細(xì)胞增殖抑制率均明顯增加，以聯(lián)合給藥組更明顯。

圖2 Western blot 檢測(cè)HT29 細(xì)胞p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of p-PI3K and p-Akt protein in HT29 cells detected by Western blot

表4 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞PI3K／Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.4 Effects of acetyl shikonin combined with oxaliplatin on the expressions of PI3K／Akt signaling pathwayrelated proteins in HT29 cells（±s，n＝5）

表4 乙酰紫草素聯(lián)合奧沙利鉑對(duì)HT29 細(xì)胞PI3K／Akt 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（±s，n＝5）Tab.4 Effects of acetyl shikonin combined with oxaliplatin on the expressions of PI3K／Akt signaling pathwayrelated proteins in HT29 cells（±s，n＝5）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與乙酰紫草素組比較，#P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，△P＜0.05。

腫瘤的形成除了與細(xì)胞增殖失控有關(guān)外，死亡過(guò)程受阻也是重要原因［11］，因此，可以通過(guò)抑制細(xì)胞分裂、增殖，以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到預(yù)期治療效果。Ki-67 在多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，是評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞凋亡水平的重要指標(biāo)［12］；Bcl-2 家族蛋白成員間的相互作用在調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程中也發(fā)揮著關(guān)鍵性作用，存在于胞漿或線粒體外膜的促凋亡蛋白Bax 與抗凋亡蛋白Bcl-2 結(jié)合后可以激活caspase 途徑，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合給藥組細(xì)胞凋亡率、BaxmRNA表達(dá)高于乙酰紫草素組和奧沙利鉑組，而Ki-67、Bcl-2 mRNA 表達(dá)更低。

在細(xì)胞的凋亡和增殖過(guò)程中，PI3K／Akt 信號(hào)通路均發(fā)揮重要作用，在腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞中異常激活［14］，p-PI3K 及p-Akt 表達(dá)均明顯升高［15］。研究［16］表明，抑制PI3K／Akt 信號(hào)通路的活化是多種化療藥物的共同機(jī)制；胡澤成等［17］報(bào)道，青龍衣多糖在體外可直接殺傷或抑制人結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，其作用機(jī)制與抑制PI3K／Akt 信號(hào)通路的活化有關(guān)；本研究也發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，乙酰紫草素組、奧沙利鉑組及聯(lián)合給藥組細(xì)胞p-PI3K、p-Akt 蛋白表達(dá)均明顯降低，以聯(lián)合應(yīng)用組更明顯。

綜上所述，乙酰紫草素和奧沙利鉑對(duì)人結(jié)腸癌HT29 細(xì)胞均具有抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡作用，可能與調(diào)控PI3K／Akt 信號(hào)通路有關(guān)，而且兩者聯(lián)合作用時(shí)效果更好。