UPLC 法測(cè)定生、制白術(shù)配伍枳術(shù)丸中10 種成分

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（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 大連 116600）

枳術(shù)丸是僅由白術(shù)、枳實(shí)2 味中藥組成的治療脾胃內(nèi)傷的經(jīng)典方劑［1］，始見于李東垣的《內(nèi)外傷辨惑論》［2］，后被2015 年版《中國藥典》 一部所收載［3］。方中白術(shù)量重于枳實(shí)1 倍，乃補(bǔ)重于消，寓消于補(bǔ)［4］；枳實(shí)藥性峻烈，需以麩炒緩和其破氣之力［5］，用于脾胃虛弱、食少不化、脘腹痞滿等癥［6］。白術(shù)為君藥，其味苦、性溫，可健脾益氣、燥濕利水［7-9］；枳實(shí)為臣藥，其味苦、性寒，可下氣化滯、消痞除滿［10］?，F(xiàn)代藥理研究表明，枳術(shù)丸還能治療小兒厭食、功能性消化不良等癥狀［11］。

近年來，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)麩炒可以促進(jìn)白術(shù)中蒼術(shù)酮氧化為白術(shù)內(nèi)酯，但與枳實(shí)配伍后卻可使白術(shù)內(nèi)酯還原為蒼術(shù)酮［12-13］，這也證明單味藥的炮制機(jī)理并不等同于復(fù)方中該藥炮制前后的組方和配伍機(jī)制。此外，《內(nèi)外傷辨惑論》 中枳術(shù)丸由麩炒枳實(shí)、白術(shù)組成，而被《中國藥典》 所收載的由麩炒白術(shù)、枳實(shí)組成，且臨床上麩炒白術(shù)以健脾消食、和胃作用為主，這又恰與枳術(shù)丸治痞、消食、強(qiáng)胃的功效相應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)采用UPLC 法測(cè)定生白術(shù)、制枳術(shù)丸中10 種成分的含有量，以期證實(shí)組方中白術(shù)與麩炒枳實(shí)配伍的合理性。

1 材料

1.1 儀器 Waters Acquity UPLC H-Class 色譜儀（沃特世科技上海有限公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1004B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；AE240型電子分析天平（十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司）；WGL-125B 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；RO-2640P 型超純水器（美國Millipore 公司）。

1.2 試劑與藥物 白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（批號(hào)111127）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（批號(hào)150917）、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（批號(hào)151107）對(duì)照品（四川省維克奇生物科技有限公司）；橙皮苷（批號(hào)YJ-160226）、柚皮苷（批號(hào)100002）、蕓香柚皮苷（批號(hào)101222）、柚皮素（批號(hào)100368）、橙皮素（批號(hào)100456）、辛弗林（批號(hào)YJ-151012）對(duì)照品（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司）；荷葉堿（批號(hào)DST180209-051）對(duì)照品（成都德思特生物技術(shù)有限公司），純度均大于98%。

白術(shù)購于安徽亳州、浙江麗水、湖北恩施，枳實(shí)購于江西省，荷葉（批號(hào)170701）購于安徽致良中藥飲片有限公司，均經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)李峰教授鑒定為正品。甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純（德國Merck 公司）；水為超純水，由RO-2640P 超純水器制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 枳術(shù)丸制備 按處方比例稱取白術(shù)生品、炮制品各500 g，麩炒枳實(shí)250 g，粉碎，過3 號(hào)篩，混勻。另取荷葉75 g，加40 倍量水（沒過荷葉表面）煎煮1 h，放涼過濾，殘?jiān)?0 倍量水煎煮1 h，放涼過濾，合并2 次濾液濃縮，濃縮液9 500 r／min離心10 min 后取上清液，用煎液泛丸，干燥，即得。

2.2 色譜條件 ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相0.1% 甲酸（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫，程序見表1；體積流量0.4 mL／min；柱溫30 ℃；橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷、柚皮素、橙皮素、辛弗林、荷葉堿、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ檢測(cè)波長為283 nm，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ為220 nm；進(jìn)樣量2 μL。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3 對(duì)照品溶液制備 精密量取對(duì)照品溶液適量，甲醇溶解并定容于10 mL 量瓶中，搖勻，制成含白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ1.123 mg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ0.115 mg／mL、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ1.061 mg／mL、荷葉堿0.144 mg／mL、橙皮苷0.130 mg／mL、橙皮素0.125 mg／mL、柚皮苷0.134 mg／mL、柚皮素0.130 mg／mL、辛弗林0.162 mg／mL、蕓香柚皮苷0.144 mg／mL 的溶液，即得，密封避光保存。

2.4 供試品溶液制備 取枳術(shù)丸適量，研細(xì)，取約2.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL 浸泡30 min，稱定質(zhì)量，超聲處理（700 W、50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，甲醇定容于25 mL量瓶中，混勻，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.5 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取供試品、對(duì)照品溶液各2 μL，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ保留時(shí)間分別為1.219、10.707、11.369、11.851、13.423、15.757、16.513、21.233、23.215、24.910 min，且分離度良好，理論塔板數(shù)均不低于15 000。見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下各對(duì)照品溶液，甲醇稀釋成6 個(gè)質(zhì)量濃度，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 稱取“2.1”項(xiàng)下樣品（浙江麗水）約2.0 g，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ峰面積RSD 分別為2.53%、0.5%、1.45%、2.24%、2.81%、3.02%、0.46%、2.04%、1.45%、1.63%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取“2.1”項(xiàng)下樣品（浙江麗水）約2.0 g，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)下色譜條件下于制備后0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，測(cè)得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ峰面積RSD 分別為 2.85%、2.51%、1.96%、0.47%、3.58%、2.72%、2.44%、2.78%、2.96%、3.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一樣品6 份（浙江麗水），每份約2.0 g，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ峰面積 RSD 分別為 2.93%、2.48%、2.25%、2.55%、2.43%、2.53%、2.75%、1.75%、1.83%、1.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.5 加樣回收率試驗(yàn) 稱取同一樣品約1.0 g，共6 份，加入辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ?qū)φ掌愤m量，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算回收率。結(jié)果，辛弗林、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、荷葉堿、柚皮素、橙皮素、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ平均加樣回收率分別為100.6%、98.3%、98.9%、99.0%、97.5%、97.7%、98.2%、98.2%、98.7%、100.0%，RSD分別為2.96%、1.89%、2.33%、2.50%、2.22%、2.70%、2.02%、2.17%、2.50%、3.16%。

2.7 樣品含有量測(cè)定 稱取3 個(gè)產(chǎn)地白術(shù)鮮品和1 個(gè)產(chǎn)地枳實(shí)鮮品適量，按“2.1”“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算含有量。結(jié)果見表3。

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg／g）Tab.3 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論與結(jié)論

3.1 指標(biāo)性成分選擇 白術(shù)中內(nèi)酯類成分具有促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)和營養(yǎng)成分吸收的作用，是其主要活性物質(zhì)［14-15］，因此，本研究選取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ～Ⅲ作為指標(biāo)。枳實(shí)中主要活性物質(zhì)為生物堿及黃酮兩大類，其中以橙皮苷、柚皮苷及蕓香柚皮苷為代表的黃酮類成分具有抑制平滑肌收縮、改善功能性消化不良大鼠的胃排空和抗氧化抗炎等作用，是枳實(shí)中消食的主要活性物質(zhì)［16-18］。由于枳術(shù)丸中使用的是麩炒枳實(shí)，炮制的過程可導(dǎo)致黃酮苷類成分的苷鍵發(fā)生斷裂，得到其苷元類物質(zhì)，因此，本研究選取了黃酮苷類物質(zhì)橙皮苷、柚皮苷、蕓香柚皮苷及其苷元橙皮素、柚皮素作為指標(biāo)性。此外，生物堿類成分以辛弗林為代表，被《中國藥典》 收載，本研究也以其為檢測(cè)指標(biāo)之一；荷葉汁雖然只作為白術(shù)和枳實(shí)的粘合劑，但它含有大量生物堿，具有降脂、抑菌等作用［19］，故按照《中國藥典》 規(guī)定也選擇其所含荷葉堿作為指標(biāo)。

3.2 流動(dòng)相選擇 本研究比較了甲醇-水、乙腈-水、0.1%甲酸-0.1%甲酸乙腈，發(fā)現(xiàn)甲醇-水溶液分離效率較低，在220 nm 波長下的末端吸收情況較為嚴(yán)重，而乙腈-水系統(tǒng)則具有相對(duì)好的色譜分離效果。為了有效改善部分色譜峰的拖尾現(xiàn)象，本研究還加入甲酸以提高分離度。最終，確定流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸。

3.3 色譜柱選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）2 種色譜柱，發(fā)現(xiàn)BEH C18色譜柱出峰少，色譜峰的保留時(shí)間延長，而HSS T3色譜柱顯著提高了峰容量及對(duì)色譜峰的分離效果，這可能與部分成分具有強(qiáng)極性有關(guān)，而該柱子對(duì)其具有更好的保留效果。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇HSS T3色譜柱。

3.4 提取方式選擇 本實(shí)驗(yàn)考察了25%、50%、75%、100%甲醇在超聲法和回流法下的提取效率，發(fā)現(xiàn)100%甲醇最高，而2 種提取方法之間沒有顯著性差異，但回流法所用時(shí)間較長，重復(fù)性較差。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇100%甲醇超聲提取。

3.5 白術(shù)內(nèi)酯類成分比較 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地生白術(shù)中內(nèi)酯類成分差異較大，這可能與生長環(huán)境及采收、加工方式有關(guān)。比較生制品白術(shù)與麩炒枳實(shí)配伍后白術(shù)內(nèi)酯類成分的變化趨勢(shì)顯示，在不同產(chǎn)地白術(shù)中含有量均較高的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在白術(shù)麩炒的過程中，僅有部分降低，而經(jīng)配伍后明顯下降，同時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ含有量明顯升高，這可能是由于白術(shù)在炮制的過程中促進(jìn)了白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ向白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的轉(zhuǎn)化，有利于增強(qiáng)麩炒白術(shù)的補(bǔ)益作用［14-15］，而配伍后促進(jìn)白術(shù)中有效成分的溶出（轉(zhuǎn)化）也表明麩炒枳實(shí)與麩炒白術(shù)配伍的必要性和合理性。

3.6 黃酮類成分比較 通過對(duì)比枳實(shí)炮制前后及配伍生制白術(shù)后黃酮類成分的含有量發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)生制品中橙皮苷最高，麩炒后枳實(shí)中黃酮苷類成分明顯降低，而在與白術(shù)進(jìn)行配伍之后反而升高，表明與白術(shù)配伍時(shí)對(duì)黃酮苷類成分可起到保護(hù)作用。同時(shí)，麩炒后枳實(shí)中黃酮苷元類成分含有量明顯升高，而與白術(shù)配伍后降低，進(jìn)一步表明白術(shù)具有增加黃酮苷類成分、降低黃酮苷元類成分的作用。枳實(shí)中黃酮苷類成分為其增強(qiáng)胃腸功能的主要活性物質(zhì)，而麩炒在降低了燥性揮發(fā)油類成分含有量的同時(shí)，也促進(jìn)了苷鍵的斷裂，使其改善脾虛患者胃腸功能的作用降低；與白術(shù)配伍后可促進(jìn)具有增強(qiáng)胃腸蠕動(dòng)作用的苷類成分含有量增加，以保證其健脾消積的作用。枳實(shí)中主要活性物質(zhì)辛弗林經(jīng)麩炒后由于溫度的影響，其結(jié)構(gòu)遭到破壞，含有量降低，而與白術(shù)配伍后增加，同樣體現(xiàn)出配伍的意義［20-21］。另外，荷葉堿含有量在麩炒白術(shù)制枳實(shí)中更高，也可證實(shí)枳術(shù)丸以麩炒白術(shù)入方的合理性。

本研究從復(fù)方配伍與炮制的角度，證明了枳術(shù)丸中選用麩炒白術(shù)與麩炒枳實(shí)配伍的合理性。今后，將繼續(xù)從入血成分種類及代謝情況入手，比較生、制白術(shù)配伍枳術(shù)丸的差異，以期從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)探討組方規(guī)律及其合理性。