唐培培 賈真 郭傳濱 楊立均 孫會(huì)忠 許曉敬

摘要?采用土壤微生物稀釋平板法分離技術(shù)，從煙草根際土壤分離到一株活體純培養(yǎng)物，將其編號(hào)為ZMD1。ZMD1菌株與2種病原的拮抗試驗(yàn)均顯示出一定的抗菌活性;通過(guò)聚酮合成酶（PKS）基因的兼并引物對(duì)ZMD1進(jìn)行了克隆驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果與其他物種的PKS基因序列具有較高的相似性，故將ZMD1初步定性為產(chǎn)聚酮合成酶活性菌株。綜合ZMD1菌株的一般形態(tài)特征、生理生化特征和菌株的16S?rDNA保守序列特征分析，初步將ZMD1確定為鏈霉菌屬（Streptomyces）菌株，暫命名為Streptomyces?sp.ZMD1。ZMD1可作為煙草病害生防菌劑、土壤保育菌劑和專用菌肥等開(kāi)發(fā)的良好備用材料。

關(guān)鍵詞?煙草;根際土壤;生防菌;分類鑒定

中圖分類號(hào)?S572文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼?A文章編號(hào)?0517-6611（2020）07-0160-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.045

Polyketone?Synthase?Gene?Validation?of?a?Strain?and?Its?Identification

TANG?Peipei，JIA?Zhen，GUO?Chuanbin?et?al

（Zhumadian?Branch?of?Henan?Provincial?Tobacco?Company，Zhumadian，Henan?463000）

Abstract?A?pure?bacterial?culture?was?isolated?from?tobacco?rhizosphere?soil?by?plate?culture?technique，and?its?number?was?ZMD1.?ZMD1?strain?showed?some?antagonistic?activity?against?two?pathogens.?ZMD1?was?identified?as?a?polyketide?synthase?producing?strain?by?cloning?with?the?merger?primers?of?the?polyketone?synthase?（PKS）?gene，and?the?results?of?sequencing?were?similar?to?those?of?PKS?gene?sequences?of?other?species.?Based?on?the?general?morphological?characteristics，physiological?and?biochemical?characteristics?and?16S?rDNA?conservative?sequence?analysis?of?ZMD1?strain，ZMD1?strain?was?initially?identified?as?Streptomyces?strain，?tentatively?named?Streptomyces?sp.?ZMD1.?ZMD1?strain?can?be?used?as?a?good?reserve?material?for?the?development?of?biocontrol?agents?for?tobacco?diseases，soil?conservation?agents?and?special?fertilizer.

Key?words?Tobacco;Rhizosphere?soil;Biocontrol?bacteria;Classification?and?identification

基金項(xiàng)目?河南省煙草公司駐馬店市公司項(xiàng)目“植煙土壤的微生物定向調(diào)控保育技術(shù)研究”;河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（16A180003）。

作者簡(jiǎn)介?唐培培（1990—），女，河南沈丘人，碩士，從事煙草學(xué)研究。通信作者，碩士，從事煙草栽培學(xué)研究。

收稿日期?2019-10-01

聚酮化合物（polyketide，PK）是細(xì)菌、真菌和植物等生物體內(nèi)一類具有天然生物活性的化合物，它是在生物體內(nèi)聚酮合成酶（polyketide?synthase，PKS）的作用下合成的[1-3]。聚酮化合物是很多生防活性微生物的作用靶點(diǎn)，在諸多領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，如醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，尤其是在獲取創(chuàng)新藥物和新穎次生代謝產(chǎn)物方面頗受關(guān)注[4-7]。因此，從不同環(huán)境篩選獲取具有產(chǎn)聚酮合成酶活性的菌株仍然具有重要意義。

煙草是我國(guó)一種重要的經(jīng)濟(jì)作物，土壤條件和病害防控是影響煙草生長(zhǎng)的重要因素，二者不但影響植株?duì)I養(yǎng)器官的形態(tài)建成，對(duì)烤煙品質(zhì)也有著非常重要的影響[8-9]。目前，因煙草重茬和化肥施用造成的土壤劣變及病害流行雖有所緩解，但植煙前茬作物的連作及較高的化肥施用，致使土壤劣變的總趨勢(shì)仍然是普遍存在的，煙草病害是產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重威脅。在此背景下，植煙土壤保育和病害的防控就成了煙草生產(chǎn)技術(shù)研究的兩個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域[10]。從煙草根際土壤中獲取具有PKS活性的功能菌株鮮見(jiàn)報(bào)道，開(kāi)展相關(guān)研究，無(wú)論是對(duì)PKS基因簇本身還是對(duì)微生物資源開(kāi)發(fā)均具有積極意義。該研究擬從煙草根際土壤中分離產(chǎn)PKS菌株并進(jìn)行鑒定。

1?材料與方法

1.1?材料

煙草根際土壤：采自駐馬店市確山縣煙田，取樣深度20?cm。

分離培養(yǎng)基[11]：蛋白胨5?g、牛肉膏3?g、氯化鈉10?g、瓊脂粉20?g、蒸餾水1?000?mL，自然pH。LB培養(yǎng)基[11]：蛋白胨10?g、酵母粉5?g、氯化鈉10?g、瓊脂粉20?g、蒸餾水1?000?mL，pH?7.0。

1.2?菌株的分離培養(yǎng)

采用土壤微生物平板法分離技術(shù)[12]，獲取細(xì)菌的活體純培養(yǎng)物，保種備用。

1.3?分離菌株的抗菌活性判斷

指示菌液的制備：從指示菌斜面上挑取一環(huán)接入3?mL?LB培養(yǎng)基，28?℃、轉(zhuǎn)速180?r/min培養(yǎng)12?h。待測(cè)菌株發(fā)酵液的制備：將純化出的菌株挑取一環(huán)接入LB培養(yǎng)基，28?℃、轉(zhuǎn)速?180?r/min培養(yǎng)12?h后，取5?mL超聲波破碎，備用。

采用紙片法[4，11]測(cè)定待測(cè)菌株對(duì)金黃色葡萄球菌的抗性：向培養(yǎng)皿中倒入20?mL滅菌LB培養(yǎng)基，凝固后加入100?μL（1.0×107?CFU/mL）的金黃色葡萄球菌菌液，涂布，靜置5?min。將圓形紙片置培養(yǎng)皿表面，紙片滴加待測(cè)菌發(fā)酵液，靜置5?min，于28?℃培養(yǎng)24?h觀察抑菌圈情況。

待測(cè)菌株對(duì)煙草黑脛病病原的抑制作用測(cè)定：在LB平板中央接種煙草黑脛病病原菌塊，在距培養(yǎng)皿邊緣約9?mm處放置滅菌圓形制片，每個(gè)紙片滴加一滴待測(cè)菌株發(fā)酵液，靜置5?min，28?℃恒溫培養(yǎng)7?d，期間每隔24?h在紙片上滴加一滴待測(cè)菌株發(fā)酵液。

1.4?菌株P(guān)KS基因的克隆驗(yàn)證

所用引物為PKS-Ⅰ?正：5′-TSAAGTCSAACATCGGBCA-3′;反：5′-CGCAGGTTSCSGTACCAGTA-3′，預(yù)期長(zhǎng)度1?200～1?400?bp。PKS-Ⅱ?正：5′-GGCAGCGGTTTCGGCGGTTTCCAG-3′;反：5′-CGTTGTTTACTGCGTAGAACCAGGCG-3′，預(yù)期長(zhǎng)度492～630?bp[13]。采用TaKaRa?DNA?Extraction?kit?Ver.2.0提取菌株基因組DNA，PCR擴(kuò)增體系和反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。PCR產(chǎn)物膠回收后連接TaKaRa?pMDTM18-T?Vecter載體并轉(zhuǎn)化于DH5α，挑選陽(yáng)性克隆送測(cè)，測(cè)序由北京奧克鼎盛生物科技有限公司完成。

1.5?菌株的分類鑒定

應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡對(duì)菌株形態(tài)進(jìn)行觀察[14]。根據(jù)形態(tài)特征觀察和文獻(xiàn)報(bào)道，擬定生理生化特征測(cè)定項(xiàng)目，操作步驟參考工具書記載的方法進(jìn)行[15-16]。

16S?rDNA的克?。阂源郎y(cè)菌株基因組DNA作為模板，選用引物，正：5′-CCGTCGACGCTCAGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′，反：5′-CCCGGGTACCAAGCTTAAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′。操作參考文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

2?結(jié)果與分析

2.1?目標(biāo)菌株的獲得及其抑菌活性評(píng)估

從煙草根際土壤中分離獲得一株菌株，將其編號(hào)為ZMD1，劃線純化后，甘油-40?℃保存。

采用紙片法考察ZMD1菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和煙草黑脛病病原的抗菌活性。試驗(yàn)結(jié)果表明，ZMD1菌株對(duì)金黃色葡萄球菌和煙草黑脛病病原具有明顯的抑菌圈（圖1a、b），說(shuō)明其存在拮抗病原菌的活性物質(zhì)。故初步推斷ZMD1可能具有聚酮合成酶活性。

2.2?ZMD1的PKS基因克隆驗(yàn)證

以ZMD1菌株的基因組DNA為模板，分別采用PKS-Ⅰ和PKS-Ⅱ的兼并引物進(jìn)行PKS基因的PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，PKS-Ⅰ（圖2a）和PKS-Ⅱ（圖2b）均能擴(kuò)增出清晰的目標(biāo)產(chǎn)物條帶。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中已知PKS序列進(jìn)行比對(duì)，測(cè)序獲得的PKS-Ⅰ和PKS-Ⅱ與其他種PKS序列的相似度都超過(guò)95%，故確定ZMD1菌株含有PKS基因功能。

2.3?ZMD1菌株的鑒定

2.3.1?ZMD1菌株的形態(tài)特征。

對(duì)ZMD1菌株的觀察表明，菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和LB培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好，28?℃條件下培養(yǎng)4?d形成菌落，小而致密，干燥，邊緣粗糙，凸出，早期呈白色，后期逐漸呈土黃色，不透明（圖3a）;掃描電鏡觀察可知，菌體呈鏈狀，長(zhǎng)短不一，孢子絲端部鈍圓，表面具疣（圖3b）。從一般形態(tài)特征上初步判斷為鏈霉菌。

2.3.2?ZMD1菌株的生化特性。

生理生化測(cè)定結(jié)果表明，ZMD1為革蘭氏陽(yáng)性菌，20～40?℃溫度下均能生長(zhǎng)，對(duì)NaCl的耐受濃度可達(dá)60?g/L，耐酸堿范圍5～9。其他測(cè)定項(xiàng)目呈陰性的有硝酸鹽還原、尿素利用、纖維素分解、牛奶胨化、色氨酸分解、甘氨酸利用、酯酶分解、山梨醇利用、L-組氨酸利用、L-色氨酸利用和膠醛糖利用;呈陽(yáng)性的有明膠液化、淀粉水解、M.R.試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、牛奶凝固、L-谷氨酸利用、肌醇利用、甘油利用、L-酪氨酸利用;可利用葡萄糖、木糖、果糖、半乳糖作為糖源。ZMD1生化特征與文獻(xiàn)中對(duì)鏈霉菌屬的描述基本一致[13，17]。

2.3.3?ZMD1的16S?rDNA分析。

以ZMD1菌株DNA為模板進(jìn)行?PCR擴(kuò)增，將目的帶膠回收以后進(jìn)行克隆測(cè)序，獲得ZMD1菌株的16S?rDNA序列，長(zhǎng)度為1?474?bp。將獲得的序列提交NCBI在線平臺(tái)進(jìn)行比對(duì)，挑取近緣的模式菌對(duì)應(yīng)序列，以Escherichia?coli?11775T為外類群，采用Mega6.06構(gòu)建目標(biāo)菌株ZMD1的進(jìn)化樹(shù)（圖4），聚類分析結(jié)果表明，ZMD1菌株與鏈霉菌屬（Streptomyces）的Streptomyces?longisporus?5166T聚為一支，相似度為93%，說(shuō)明它們不屬于同一種。綜合形態(tài)、生化及16S?rDNA聚類結(jié)果，暫將ZMD1歸為鏈霉菌屬（Streptomyces），暫命名為Streptomyces?sp.ZMD1。

3?討論

該研究采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基從煙草根際土壤中分離到ZMD1株菌，通過(guò)指示菌株的拮抗試驗(yàn)和對(duì)PKS基因的克隆驗(yàn)證，初步斷定該菌株存在聚酮合成酶基因，豐富了功能野生菌株資源，也為PKS基因的后期深入研究奠定了一定的基礎(chǔ)。因?yàn)閆MD1來(lái)自煙草根際環(huán)境，該菌株在后期開(kāi)發(fā)利用過(guò)程中更容易在植煙土壤形成自己的生態(tài)位，進(jìn)而更有效地發(fā)揮調(diào)控、生防和保育等作用。該研究選取煙草黑脛病病原作為指示菌株，主要是基于該病原菌在不同植煙區(qū)均具有較高的侵染率，是煙草栽培中發(fā)病率較高的病害[8，10]，將其作為指示菌株便于分離菌株的后期開(kāi)發(fā)利用;選取金黃色葡萄球菌作為另一種指示菌株，則是因?yàn)榻瘘S色葡萄球菌是一種分布極為廣泛的原核致病菌，侵染寄主種類多，是原核致病菌的典型代表。另外，聚酮類化合物作為一類抑菌化合物，具有較廣的抑菌譜[18]，煙草黑脛病菌侵染脅迫嚴(yán)重的煙草根際土壤產(chǎn)聚酮合成酶活性菌株更容易被激活而發(fā)揮作用，也更容易獲得具有聚酮合成酶活性的菌株;PKS基因克隆驗(yàn)證的結(jié)果也進(jìn)一步說(shuō)明該試驗(yàn)分離到的ZMD1確實(shí)含有聚酮合成酶基因。該研究獲得的結(jié)果相互印證，為ZMD1在煙草病害生防菌開(kāi)發(fā)、土壤保育劑開(kāi)發(fā)和專用制劑開(kāi)發(fā)的后期研究提供了較大的參考價(jià)值。

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