成玉梁 李恒超 謝云飛 于航 郭亞輝 姚衛(wèi)蓉 陳英 錢和

摘要?[目的]基于氯霉素對大豆蛋白金納米簇（SP-AuNCs）的熒光猝滅現(xiàn)象，建立一種熒光檢測傳感器。[方法]采用改良后的SP-AuNCs的合成，以及加入氯霉素后熒光檢測及優(yōu)化表征。[結(jié)果]氯霉素和SP-AuNCs反應(yīng)的最佳反應(yīng)時(shí)長為9?min，線性檢測濃度為0～300?μmol/L，檢測限為22.86?μmol/L，同時(shí)有很好的選擇性，最終取得的回收率是87.80%～98.45%。[結(jié)論]該試驗(yàn)為氯霉素的快速、可視化檢測拓寬了思路，提供了新的方法參考。

關(guān)鍵詞?熒光檢測;大豆蛋白金納米簇;氯霉素;豬肉

中圖分類號?S851.34+7文獻(xiàn)標(biāo)識碼?A

文章編號?0517-6611（2020）07-0213-06

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.07.061

Study?on?Rapid?Detection?of?Chloramphenicol?in?Pork?by?Fluorescent?Gold?Nanoclusters

CHENG?Yuliang，LI?Hengchao，XIE?Yunfei?et?al

（School?of?Food?Science?and?Technology，Jiangnan?University，Wuxi，Jiangsu?214122）

Abstract?[Objective]?Based?on?the?fluorescence?quenching?of?soybean?protein?gold?nanoclusters?（SPAuNCs）?by?chloramphenicol，a?fluorescence?detection?sensor?was?established.[Methods]?An?improved?SPAuNCs?was?synthesized，and?fluorescence?detection?and?optimized?characterization?were?performed?after?the?addition?of?chloramphenicol.[Result]The?optimal?reaction?time?of?chloramphenicol?and?SPAuNCs?was?9?min，the?linear?detection?concentration?ranged?from?0?to?300?μmol/L，and?the?detection?limit?was?22.86?μmol/L.At?the?same?time，it?had?good?selectivity，and?the?final?recovery?range?was?87.80%?-98.45%.[Conclusion]This?experiment?broadens?the?idea?of?rapid?and?visual?detection?of?chloramphenicol，and?provides?a?new?method?for?reference.

Key?words?Fluorescence?detection;Soybean?protein?gold?nanoclusters;Chloramphenicol;Pork

作者簡介?成玉梁（1980—），男，江蘇鹽城人，研究員，博士，從事食品安全研究;李恒超（1996—），男，安徽滁州人，碩士研究生，研究方向：食品檢測。成玉梁和李恒超是共同第一作者。通信作者，研究員級高級工程師，碩士，從事食品、食品相關(guān)產(chǎn)品的檢測工作。

收稿日期?2019-10-02

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一類廉價(jià)、高效的廣譜抗生素。氯霉素通過抑制細(xì)菌合成蛋白質(zhì)而起作用。適量的抗生素添加到飼料中可以起到殺死病原微生物的作用，這種方法不僅阻礙了腸道有害微生物的增殖，也節(jié)省了大量的本會被微生物消耗掉的營養(yǎng)物質(zhì)，從而增加動(dòng)物的營養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)其平穩(wěn)增長的目標(biāo)。氯霉素價(jià)格低廉、抗菌性能好、藥物穩(wěn)定性好，在農(nóng)牧業(yè)和細(xì)菌性治療用藥中得到廣泛應(yīng)用[1]。然而，隨著氯霉素的廣泛應(yīng)用，人們逐漸發(fā)現(xiàn)氯霉素有極大的毒、副作用[2]。動(dòng)物源性食品中的氯霉素殘留可以通過食物鏈進(jìn)入人體，抑制人體的骨髓造血功能，可能引起粒細(xì)胞缺乏癥，血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血等惡性血液病[3]，也可能引起消化系統(tǒng)疾病，如食欲不振、腹脹、腹瀉和口腔炎癥等，給人們的健康帶來危害。任何一種藥物的成功使用，都受到其首次使用時(shí)就可能產(chǎn)生的對該化合物的耐受性和耐藥性的影響[4]，氯霉素也不例外。長期、微量地?cái)z入氯霉素會使沙門氏菌和大腸桿菌產(chǎn)生耐藥性，引起人體內(nèi)部正常菌群失調(diào)，使人易患各種疾病。細(xì)菌在體內(nèi)外對氯霉素均可產(chǎn)生耐藥性，大腸桿菌、沙門菌和其他革蘭氏陰性桿菌可因耐藥因子（R因子）的傳遞而獲得耐藥性，現(xiàn)已證明具有R因子的大腸桿菌可產(chǎn)生乙酰轉(zhuǎn)移酶，使氯霉素發(fā)生乙酰化而失效;耐氯霉素的金黃色葡萄球菌可產(chǎn)生某種誘導(dǎo)酶，在乙酰輔酶A的參與下，使氯霉素乙?；?。氯霉素殘留物不僅會通過進(jìn)入食物鏈危害人體健康，還會導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的傳播，從而導(dǎo)致二次環(huán)境污染。糞便的循環(huán)污染就為耐藥微生物的傳播提供了可能。若動(dòng)物排泄的糞便中含有氯霉素殘留，這些糞便會污染其他未經(jīng)處理的動(dòng)物飼料;蔬菜也可能受到糞便的污染，尤其是在通常用糞便作肥料的國家[5]。

動(dòng)物源性食品中的氯霉素殘留已被公認(rèn)為會對人體健康和社會環(huán)境造成潛在危害。我國農(nóng)業(yè)部在2002年發(fā)布的《農(nóng)業(yè)部235號公告》中明確規(guī)定氯霉素及其鹽、酯禁用于所有食品動(dòng)物、所有可食組織[6]。為了研究植物材料中天然存在的低水平氯霉素是否會引起可食動(dòng)物組織中氯霉素殘留物，Rejtharov等[7]用雞進(jìn)行了飼養(yǎng)研究，結(jié)果表明，當(dāng)檢測到氯霉素殘留時(shí)，很可能是通過非法使用。由于氯霉素抗菌效果好、價(jià)格低廉，所以仍然有人在生產(chǎn)動(dòng)物源性食品中違規(guī)使用。在現(xiàn)有的針對氯霉素的檢測方法中，我國國家標(biāo)準(zhǔn)中檢測氯霉素的方法包括基于表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）傳感器的混合分子印跡聚合物（MIP）檢測牛奶中氯霉素的方法[8]、氣相色譜-質(zhì)譜法[9-13]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[14-18]和酶聯(lián)免疫法[19-21]。因此，迫切需要建立一種快速、有效的方法來檢測動(dòng)物源食品中的氯霉素殘留，以便更好地監(jiān)督管理食品安全環(huán)境。

貴金屬納米簇（NMNCs）是指由幾個(gè)到幾十個(gè)貴金屬原子（如Au、Ag?或Pt）構(gòu)成，表面的配體（如硫醇類小分子、核酸、生物大分子或聚合物分子）進(jìn)行穩(wěn)定和保護(hù)、經(jīng)能量激發(fā)后能發(fā)射熒光的一種納米顆粒，它們的大小接近費(fèi)米波長[22-23]。貴金屬納米團(tuán)簇具有熒光強(qiáng)度高、催化活性高、生物相容性好、低毒、易溶于水等優(yōu)點(diǎn)，其制備方法相對簡單，常被用于構(gòu)建熒光納米傳感器或被用作熒光標(biāo)記物，在污染物監(jiān)測、生物化學(xué)分析、生物傳感器和成像等方面有廣泛的應(yīng)用[24-35]。

貴金屬納米簇構(gòu)建的熒光納米傳感器在對食品和環(huán)境中污染物的檢測中具有被廣泛應(yīng)用的前景。銅（Cu2+）在調(diào)節(jié)許多生物過程中起著重要的作用，但過高濃度的Cu2+對腎臟、大腦等重要的生物器官是有害的;而且，游離的Cu2+會對細(xì)胞產(chǎn)生毒性，因?yàn)樗鼈儠a(chǎn)生羥基自由基，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Cu2+對蛋白質(zhì)和組氨酸存在很強(qiáng)的親和力，Cu2+與配體蛋白表面結(jié)合后，主要通過增強(qiáng)激發(fā)態(tài)電子的系間穿越（ISC）非輻射弛豫行為來抑制金納米簇的熒光[36]。Cheng等[37]利用大豆蛋白，成功開發(fā)了一種可視化檢測湖水中Cu2+的方法，且其最低檢測限為10?μmol/L。貴金屬納米簇構(gòu)建的熒光傳感器在分析和檢測生物小分子、藥物分子和功能蛋白質(zhì)方面也具有很大的發(fā)展前景。Hemmateenejad等[38]建立了一種基于牛血清白蛋白修飾金納米團(tuán)簇對葉酸（FA）有熒光猝滅響應(yīng)的新測定方法，其最低檢出限為18.3?ng/mL，并且該方法在測定片劑中葉酸含量時(shí)可行。貴金屬納米簇是進(jìn)行細(xì)胞或體內(nèi)成像研究時(shí)最理想的熒光標(biāo)記物之一，因?yàn)樗哂懈邿晒夥€(wěn)定性、強(qiáng)抗光漂白能力、低毒性、高生物相容性、體積相對較小等優(yōu)點(diǎn)。此外，其熒光發(fā)射波長覆蓋在可見光和近紅外區(qū)域。Chen等[39]采用綠色的合成方法，制備了牛血清白蛋白金納米簇，為了提高該金納米簇對高葉酸受體（FR）表達(dá)腫瘤的選擇性親和力，將葉酸（FA）固定在其表面，成功制備了一種極具腫瘤成像和靶向治療潛力的、經(jīng)配體修飾的金納米簇。該研究使用了一種廉價(jià)、穩(wěn)定、環(huán)境友好的金簇，發(fā)展了檢測方法。該研究首先合成SP-AuNCs，并表征其熒光強(qiáng)度，隨后觀察SP-AuNCs對氯霉素的熒光響應(yīng);其次還對SP-AuNCs檢測氯霉素的檢測條件進(jìn)行了優(yōu)化;同時(shí)，另外選擇2種抗生素（羅紅霉素和鏈霉素）進(jìn)行氯霉素?zé)晒鈾z測方法的選擇性評價(jià)，建立熒光檢測傳感器對實(shí)際豬肉樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?試驗(yàn)試劑。四氯金酸三水合物（HAuCl4·3H2O，≥99.0%），薩恩化學(xué)技術(shù)上海有限公司;低溫脫脂豆粕，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司;氫氧化鈉（NaOH，≥96.0%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乙酸乙酯（C4H8O2，≥99.5%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;屈臣氏蒸餾水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司;氯霉素、鏈霉素、羅紅霉素，百靈威科技有限公司;25%～28%氫氧化銨、無水硫酸鈉、正己烷，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2?試驗(yàn)儀器。

F-7000熒光光譜儀，日本國立公司;WH-2微型漩渦混合儀，上海滬西分析儀器廠有限公司;SCIENTZ-10ND冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;可調(diào)式移液器，德國Eppendorf公司;IKA?Lab?Dancer旋渦振蕩器，德國IKA公司;PB602-N電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;

EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;RJ-LD-50G低速大容量離心機(jī)，無錫市瑞江分析儀器有限公司;IKA?T10?basic?ULTRA-TURRAX勻漿機(jī)，德國IKA公司;KQ-600KDB型高功率數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?SP-AuNCs的制備[23]。將規(guī)格為1?g的四氯金酸倒入棕色細(xì)口瓶，加入99?g水混合，制備成四氯金酸儲備液，放入冰箱保藏;取17?mL質(zhì)量濃度為1%的四氯金酸儲備液，與33?mL水混合，制備成10?mmol/L的四氯金酸溶液。在裝有20?mL水的燒杯中放入攪拌子，稱取1?g大豆蛋白粉，緩慢倒入燒杯溶解，制備成50?mg/mL的大豆蛋白溶液。稱取12.5?g氫氧化鈉，用250?mL容量瓶定容，制備成1?mol/L氫氧化鈉溶液后備用。用移液槍準(zhǔn)確移取0.5?mL濃度為50?mg/mL的大豆蛋白溶液于2?mL離心管中，再移取0.5?mL濃度為10?mmol/L的四氯金酸溶液逐滴加入離心管中，漩渦振蕩2?min，再移取0.1?mL濃度為1?mol/L氫氧化鈉溶液逐滴加入離心管中，在加入的同時(shí)進(jìn)行漩渦振蕩;共配制35管。將上述配制完的反應(yīng)溶液于60?℃下繼續(xù)進(jìn)行7?h的攪拌反應(yīng);反應(yīng)結(jié)束后，可以觀察到反應(yīng)液由亮黃色變?yōu)闇\棕色，將離心管放置于365?nm波長的紫外燈下可看到溶液有粉紅色熒光;合并最終得到的反應(yīng)液，將其裝入分子截留值為3.5?kD的透析袋中后，置于裝有3?000?mL蒸餾水的大燒杯中透析。透析過程中每隔4?h換一次水，共換2次。透析完成后，將透析液倒入撐開的自封袋中，先放入-80?℃冰箱冷凍過夜，再放入冷凍干燥機(jī)中凍干3?d。凍干結(jié)束后，將自封袋放置到干燥器中。

1.2.2?表征SP-AuNCs熒光性能。

對透析前后的反應(yīng)液進(jìn)行留樣，將凍干后的SP-AuNCs制備成50?mg/mL溶液。分別對透析前、透析后和凍干后制備的金納米簇溶液用熒光分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。尋找、確定濃度為50?mg/mL的SP-AuNCs溶液的最佳激發(fā)波長，比較透析前、透析后和凍干后制備的金納米簇溶液的最高熒光強(qiáng)度。

1.2.3?氯霉素?zé)晒鈾z測反應(yīng)條件優(yōu)化。

1.2.3.1?反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化。用移液槍分別移取200?μL?pH為8、濃度為20?mmol/L的磷酸緩沖液和100?μL濃度為100?μmol/L的氯霉素溶液于1.5?mL離心管中，再在離心管中加入50?μL濃度為1?mg/mL的SP-AuNCs溶液，蓋緊離心管管蓋，置于漩渦振蕩器上快速振蕩后，用移液槍移取300?μL反應(yīng)液于微量石英比色皿中，測定隨著各反應(yīng)時(shí)間時(shí)的熒光強(qiáng)度。檢測的參數(shù)設(shè)置中，模式為時(shí)間檢測，激發(fā)波長為270?nm，狹縫均為10?nm，間隔1?s，共1?800?s。

1.2.3.2?磷酸緩沖液濃度的優(yōu)化。固定緩沖液的pH為7.5，配制濃度分別為5、10、20、30、40?mmol/L的磷酸緩沖液。用移液槍分別移取200?μL?pH為7.5、不同濃度的磷酸緩沖液和100?μL濃度為100?μmol/L的氯霉素溶液于1.5?mL離心管中，再在離心管中加入50?μL濃度為1?mg/mL的SP-AuNCs溶液，蓋緊離心管管蓋，置于漩渦振蕩器上均勻振蕩后，保持反應(yīng)時(shí)長一致。再用移液槍移取300?μL反應(yīng)液于微量石英比色皿中，測定樣品的熒光強(qiáng)度。檢測的參數(shù)設(shè)置中，模式為熒光檢測，激發(fā)波長為270?nm，狹縫均為10?nm，掃描頻率為2?400?Hz，電壓為700?V?？瞻捉M和不同濃度的緩沖液組均需做3個(gè)平行。

1.2.3.3?磷酸緩沖液pH的優(yōu)化。固定緩沖液的濃度為20?mmol/L，配制pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸緩沖液。用移液槍分別移取200?μL濃度為20?mmol/L、不同pH的磷酸緩沖液和100?μL濃度為300?μmol/L的氯霉素溶液于1.5?mL離心管中，再在離心管中加入50?μL濃度為1?mg/mL的SP-AuNCs溶液，蓋緊離心管管蓋，置于漩渦振蕩器上均勻振蕩后，保持反應(yīng)時(shí)長一致;再用移液槍移取300?μL反應(yīng)液于微量石英比色皿中，測定樣品的熒光強(qiáng)度。檢測的參數(shù)設(shè)置中，模式為熒光檢測，激發(fā)波長為270?nm，狹縫均為10?nm，掃描頻率為2?400?Hz，電壓為700?V?？瞻捉M和不同濃度的緩沖液組均需做3個(gè)平行。

1.2.4?氯霉素?zé)晒鈾z測方法。

用移液槍分別移取200?μL濃度為20?mmol/L、pH為8的磷酸緩沖液和100?μL不同濃度的氯霉素溶液于1.5?mL離心管中，再在離心管中加入50?μL濃度為1?mg/mL的SP-AuNCs溶液，蓋緊離心管管蓋，置于漩渦振蕩器上均勻振蕩后，保持反應(yīng)時(shí)長一致;再用移液槍移取300?μL反應(yīng)液于微量石英比色皿中，測定樣品的熒光強(qiáng)度。檢測的參數(shù)設(shè)置中，模式為熒光檢測，激發(fā)波長為270?nm，狹縫均為10?nm，掃描頻率為2?400?Hz，電壓為700?V?？瞻捉M中，用移液槍分別移取300?μL濃度為20?mmol/L、pH為8的磷酸緩沖液和50?μL濃度為1?mg/mL的SP-AuNCs溶液，蓋緊離心管管蓋，置于漩渦振蕩器上均勻振蕩后，再用移液槍移取300?μL反應(yīng)液于微量石英比色皿中，測定空白樣品的熒光強(qiáng)度?？瞻捉M和不同濃度的緩沖液組均需做3個(gè)平行。

1.2.5?氯霉素?zé)晒鈾z測方法選擇性評價(jià)。

為了評價(jià)該SP-AuNCs檢測氯霉素方法的選擇性，另外購買了大環(huán)內(nèi)酯類的羅紅霉素和氨基糖苷類的鏈霉素這2種常見獸藥抗生素，均制備成濃度為400?μmol/L的溶液。按照“1.2.4”中的檢測方法，分別測定400?μmol/L的羅紅霉素、鏈霉素和氯霉素對SP-AuNCs的熒光響應(yīng)。此外，需做空白試驗(yàn)。考察和比較在相同濃度時(shí)，每組樣品對SP-AuNCs的熒光響應(yīng)情況。測定完畢后，回收樣品，將反應(yīng)完成后的4支離心管置于紫外燈下觀察比較每個(gè)樣品的熒光亮度變化。

1.2.6?實(shí)際樣品中氯霉素測定。

參考國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品前處理，首先配制質(zhì)量濃度為25%～28%的氫氧化銨溶液。購買純精豬肉，用肉類組織搗碎機(jī)絞碎，裝入干凈的自封袋中作為試樣。做好標(biāo)記之后，于-18?℃冰箱保藏。稱取5?g樣品，精確至0.01?g，置于50?mL離心管中，加入氯霉素內(nèi)標(biāo)溶液后，再依次加入15?mL乙酸乙酯、0.45?mL氫氧化銨和5?g無水硫酸鈉，勻質(zhì)提取30?s后，以4?000?r/min離心5?min，將上清液移至50?mL比色管中。另取一支50?mL離心管，加入15?mL乙酸乙酯、0.45?mL氫氧化銨，洗滌勻質(zhì)刀頭10?s后，洗滌液再次移入首支離心管中，用玻璃棒攪勻后，漩渦振蕩1?min，再超聲提取5?min，以4?000?r/min離心5?min。將上清液合并至50?mL比色管中，殘?jiān)偌尤?5?mL乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，所有上清液全部合并至比色管中后，用乙酸乙酯定容至50?mL。搖勻后提取10?mL乙酸乙酯提取液于25?mL雞心瓶中，在45?℃下水浴旋轉(zhuǎn)濃縮至干。用3?mL緩沖液溶解殘?jiān)蟪??min，加入3?mL正己烷漩渦振蕩30?s，待靜置分層后丟棄上層的正己烷，再加入3?mL正己烷漩渦振蕩30?s，待靜置分層后，用移液槍準(zhǔn)確移取1?mL水相于1.5?mL離心管中，以13?000?r/min離心5?min，過0.2?μm濾膜。取300?μL于微量石英比色皿中，測定樣品的熒光強(qiáng)度。計(jì)算、比較相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）和回收率。選擇的氯霉素加標(biāo)溶液在測定時(shí)的理論濃度分別為100、200和300?μmol/L，須制備空白樣品。

2?結(jié)果與分析

2.1?SP-AuNCs熒光性能的表征

通過熒光光譜儀分別對透析前、透析后和凍干后制備的SP-AuNCs溶液進(jìn)行檢測，確定各自對應(yīng)的最佳激發(fā)波長和熒光強(qiáng)度。由圖1可知，在不同制備階段的SP-AuNCs存在差異。透析前溶液的激發(fā)光譜的最佳發(fā)射波長是650?nm，熒光發(fā)射光譜的最佳激發(fā)光波長在362?nm，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為65?650.7;透析后溶液的激發(fā)光譜的最佳發(fā)射波長是648?nm，熒光發(fā)射光譜的最佳激發(fā)光波長在307?nm，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為320?090.5;而最終合成得到的SP-AuNCs溶液的熒光激發(fā)光譜的最佳發(fā)射波長是650?nm，發(fā)射光譜的最佳激發(fā)光波長在368?nm處，對應(yīng)的熒光強(qiáng)度為397?015.1。這與合成SP-AuNCs的參考文獻(xiàn)[23]相類似。以上結(jié)果證明，該試驗(yàn)成功合成了SP-AuNCs熒光體系。

2.2?反應(yīng)條件的選擇優(yōu)化

由圖2可知，在含有氯霉素的緩沖體系中加入SP-AuNCs溶液后，立即發(fā)生快速反應(yīng)，在200?s后趨于平穩(wěn)，約540?s反應(yīng)最佳。因此，該緩沖體系下的最佳反應(yīng)時(shí)長為9?min。

由圖3可知，當(dāng)緩沖液pH和反應(yīng)時(shí)長等反應(yīng)條件固定時(shí)，緩沖液濃度對氯霉素?zé)晒鈾z測的影響不是非常明顯。在濃度分別為5、10、20、30和40?mmol/L的緩沖液中，緩沖液濃度為20?mmol/L時(shí)，氯霉素對SP-AuNCs的熒光猝滅率最高。因此，選擇磷酸緩沖液濃度為20?mmol/L作為SP-AuNCs檢測氯霉素時(shí)反應(yīng)的最佳緩沖液濃度。

由圖4可知，當(dāng)緩沖液濃度和反應(yīng)時(shí)長等反應(yīng)條件固定時(shí)，在pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的緩沖體系中，pH為6.5時(shí)氯霉素對SP-AuNCs的熒光猝滅率最低，pH為8.0時(shí)氯霉素對SP-AuNCs的熒光猝滅率最高。因此，SP-AuNCs檢測氯霉素反應(yīng)中磷酸緩沖體系的最佳pH為8.0。

2.3?SP-AuNCs對氯霉素的熒光響應(yīng)?由圖5可知，氯霉素溶液對SP-AuNCs有熒光猝滅作用，且隨著氯霉素濃度的增大，SP-AuNCs的熒光強(qiáng)度逐漸減弱。當(dāng)氯霉素溶液濃度達(dá)到2?000?μmol/L時(shí)，SP-AuNCs幾乎完全被熒光猝滅。

從SP-AuNCs的熒光猝滅率與所添加氯霉素濃度的關(guān)系（圖6）可以看出，隨著添加的氯霉素濃度的增大，SP-AuNCs的熒光猝滅率逐漸提高。當(dāng)氯霉素濃度增加至2?000?μmol/L時(shí)，SP-GNCs的熒光猝滅率達(dá)到96.307%。圖5～6表明氯霉素對SP-AuNCs有熒光猝滅效應(yīng)，可以以此構(gòu)建針對氯霉素的熒光檢測傳感器。

2.4?SP-AuNCs對氯霉素的熒光猝滅線性關(guān)系

對SP-AuNCs的熒光猝滅率與氯霉素溶液濃度進(jìn)行線性回歸，從SP-AuNCs的熒光猝滅率與氯霉素溶液濃度的線性關(guān)系（圖7）可以看出，氯霉素溶液在0～300?μmol/L時(shí)，該方法呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=0.002x+0.039（R2=0.984?5）。根據(jù)3σ準(zhǔn)則，得出該方法的最低檢測限為22.86?μmol/L。

2.5?方法的選擇性評價(jià)

選擇與氯霉素種類不同的另外2種抗生素（羅紅霉素和鏈霉素）進(jìn)行了氯霉素?zé)晒鈾z測方法的選擇性評價(jià)。圖8表明，反應(yīng)條件相同的情況下，僅添加氯霉素溶液的反應(yīng)液的熒光猝滅效果明顯，添加羅紅霉素或鏈霉素溶液的反應(yīng)液的熒光響應(yīng)非常不明顯。這說明該試驗(yàn)設(shè)計(jì)和構(gòu)建的SP-AuNCs熒光檢測傳感器對氯霉素具有優(yōu)良的選擇性。

2.6?氯霉素對SP-AuNCs的可能作用機(jī)理

分析氯霉素的化學(xué)分子式，其中含有1個(gè)-NO2和2個(gè)Cl-，它們均屬于強(qiáng)吸電子基團(tuán)（圖9）。當(dāng)在SP-AuNCs溶液體系中引入氯霉素時(shí)，氯霉素和SP-AuNCs結(jié)合，-NO2和Cl-可能通過強(qiáng)吸電子作用打斷配體-Au的電子轉(zhuǎn)移過程（LMCT）[11]，進(jìn)而猝滅SP-AuNCs的熒光。

2.7?實(shí)際樣品中氯霉素的加標(biāo)回收率

進(jìn)一步將所構(gòu)建的SP-AuNCs傳感器應(yīng)用于實(shí)際豬肉樣品中氯霉素的檢測。從氯霉素的加標(biāo)試驗(yàn)的檢測結(jié)果（表1）可以看出，采用該方法檢測實(shí)際豬肉樣品中氯霉素的加標(biāo)回收率為87.80%～98.45%，在合理范圍之內(nèi)，說明該方法對豬肉樣品中氯霉素的實(shí)際檢測具有較高的可靠性和參考價(jià)值。

3?結(jié)論

該研究基于氯霉素對大豆蛋白金納米簇的熒光淬滅效應(yīng)，構(gòu)建了SP-AuNCs熒光傳感器檢測豬肉中氯霉素的檢測分析方法，具體結(jié)論如下：氯霉素中的-NO2和Cl-可能通過

強(qiáng)吸電子作用打斷配體-Au的電子轉(zhuǎn)移過程（LMCT），進(jìn)而猝滅SP-AuNCs的熒光。當(dāng)氯霉素溶液濃度為2?000?μmol/L時(shí)，SP-AuNCs的熒光猝滅率高達(dá)96.31%;優(yōu)化了SP-AuNCs檢測氯霉素的檢測條件，確定最佳反應(yīng)條件是緩沖體系pH為8.0，濃度為20?mmol/L，反應(yīng)時(shí)長9?min。氯霉素在0～300?μmol/L與SP-AuNCs的熒光猝滅率呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，最低檢測限為22.86?μmol/L;通過考察和比較2種常見的抗生素（鏈霉素、羅紅霉素）對SP-AuNCs的熒光響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)此次試驗(yàn)構(gòu)建的SP-AuNCs熒光檢測傳感器對氯霉素具有高度選擇性;應(yīng)用所構(gòu)建的SP-AuNCs熒光檢測傳感器對實(shí)際豬肉樣品進(jìn)行氯霉素的加標(biāo)回收試驗(yàn)，計(jì)算得到的加標(biāo)回收率為87.80%～98.45%，屬于合理范圍，說明該方法具有較高的可靠性。

此次試驗(yàn)研究也存在不足之處，大豆蛋白金納米簇檢測氯霉素的其他檢測條件有待進(jìn)一步優(yōu)化;可以進(jìn)行不同種緩沖液之間的比較，選擇最有利于反應(yīng)的緩沖液;反應(yīng)體系的配比可以進(jìn)一步完善;在做方法的選擇性評價(jià)時(shí)，作為比較的抗生素種類和個(gè)數(shù)可以更多、更豐富一些;可以探究參考國標(biāo)進(jìn)行的前處理步驟能否進(jìn)一步簡化;未對氯霉素對大豆蛋白金納米簇造成的熒光猝滅的機(jī)制進(jìn)行深入的探究，該猝滅屬于動(dòng)態(tài)還是靜態(tài)猝滅有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，貴金屬納米簇對獸藥殘留的檢測仍有許多需要探索和研究的空間。相信隨著時(shí)間的推移、技術(shù)的發(fā)展和社會的進(jìn)步，以熒光金納米簇為傳感器對氯霉素等獸藥的檢測分析方法將逐步得到改進(jìn)和完善，開發(fā)出更加高效、快速、綠色的檢測方法，為保證食品質(zhì)量安全、保障人民身體健康、維護(hù)社會環(huán)境作出更大的貢獻(xiàn)。

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