應(yīng)朝輝, 隗玉川, 程萬(wàn)宏

肺癌是當(dāng)今世界各國(guó)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,其發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì),并已成為人類因癌癥死亡的主要原因之一[1-2]。目前,手術(shù)仍是治療肺癌的主要方法,但其僅適用于早期肺癌患者的治療,而對(duì)于晚期患者則療效不佳。近年來(lái),分子靶向治療因其靶向性和安全性等優(yōu)點(diǎn)而受到越來(lái)越多的關(guān)注,并成為晚期肺癌患者的一種新的治療方法。雖然表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)等靶向治療藥物被開(kāi)發(fā)和引進(jìn),但現(xiàn)有的治療方法對(duì)肺癌的治療效果仍不理想[3-4]。微小RNA(microRNAs)可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、轉(zhuǎn)移和侵襲在肺癌發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[5-6]。有研究顯示,microRNA-130b(miR-130b)可靶向抑制胃癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡[7];miR-130b在黑色素瘤[8]中表達(dá)上調(diào),而在子宮內(nèi)膜癌[9]和垂體腺瘤[10]中表達(dá)下調(diào);miR-130b可靶向調(diào)控PTEN,通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制凋亡來(lái)促進(jìn)兒童急性早幼粒細(xì)胞白血病的發(fā)病進(jìn)程[11]。但關(guān)于miR-130b對(duì)靶向治療肺腺癌患者預(yù)后的影響尚少見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究旨在探討經(jīng)靶向治療肺腺癌患者術(shù)前血清miR-130b的表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年1月至2014年1月于我院胸外科接受靶向治療的肺腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn):① 根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)肺癌組織學(xué)分型和分期標(biāo)準(zhǔn)確診為肺腺癌[12];② 未接受靶向治療;③ 無(wú)其他惡性疾病(如糖尿病伴嚴(yán)重并發(fā)癥者、嚴(yán)重腎臟疾病患者等);④ 證實(shí)為EGFR突變陽(yáng)性。排除標(biāo)準(zhǔn):① 合并胃癌、肝癌等其他惡性腫瘤;② 合并抑郁癥、老年癡呆等精神類疾病;③ 不符合靶向治療適應(yīng)證的患者。最終納入符合上述條件的患者278例,其中男113例,女165例;年齡40～82歲,平均年齡(60.8±10.3)歲。有肺癌家族史者41例,有吸煙史者71例。根據(jù)TNM分期,Ⅲ期115例,Ⅳ期163例。按照2004年WHO分類標(biāo)準(zhǔn),腫瘤分化程度為中高分化(G1～2)者170例,低分化(G3～4)者108例。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),獲患者和家屬知情同意且簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 靶向治療 于治療前7 d對(duì)患者進(jìn)行全面的身體檢查。所有患者均行EGFR-TKIs治療,口服250 mg/d的吉非替尼(阿斯利康)或150 mg/d的厄洛替尼(上海羅氏制藥有限公司),患者只要未出現(xiàn)死亡、無(wú)法耐受的不良反應(yīng)或者明顯的耐藥情況,就持續(xù)使用藥物維持治療。

1.2.2 主要試劑及儀器 RNA提取試劑盒TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)、NanoDrop 2000c紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime-ScriptTMRT reagent Kit(TaKaRa,Japan)、普通RT-PCR儀(BIO-RAD,USA)、羅氏LC 480熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, USA)。

1.2.3 采用定量實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)miR-130b的表達(dá) 靶向治療前4 h內(nèi),采集患者空腹靜脈血5 ml,并在45 min內(nèi)以3 000 r/min的速度離心10 min分離血清,置于-80 ℃冰箱備用。RNA的分離使用miRNeasy血清試劑盒(Qiagen,Hilden, Germany)。利用TRIzol(美國(guó)Invitrogen公司)提取總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。以U6基因?yàn)閮?nèi)參,應(yīng)用qRT-PCR儀在ABI PRISM 7500序列檢測(cè)系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸1 min,45個(gè)循環(huán)。引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-130b的相對(duì)表達(dá)量。測(cè)量3次取平均值。

表1 miR-130b和U6引物序列

基因名稱序列(5'-3')產(chǎn)物長(zhǎng)度(bp) miR-130b正向CGGCAGTGCAATGATGAAAG100 反向CAGTGCGTGTCGTGGAGT96 U6正向TGCGGGTGCTCGCTTCG-GCAGC100 反向CCAGTGCAGG GTCCGAGGT96

1.2.4 隨訪 根據(jù)我院自制的隨訪登記表進(jìn)行隨訪,包括患者的睡眠、飲食、用藥、生存情況以及出院后的治療情況。隨訪方式：上門隨訪、電話隨訪以及門診隨訪等多種方式相結(jié)合。隨訪時(shí)間:患者出院1年內(nèi)每3個(gè)月隨訪1次,2～4年每6個(gè)月隨訪1次,4～5年每年隨訪1次。生存時(shí)間:患者的靶向治療時(shí)間記為該患者的生存起始時(shí)間。若死亡,則死亡時(shí)間記為終點(diǎn)時(shí)間;若未發(fā)生死亡,則隨訪結(jié)束時(shí)間記為終點(diǎn)時(shí)間,終點(diǎn)時(shí)間與起始時(shí)間的時(shí)間間隔為生存時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-130b對(duì)靶向治療肺腺癌患者生存的預(yù)測(cè)價(jià)值

278例患者靶向治療前miR-130b表達(dá)水平為11.3±2.1,治療后miR-130b表達(dá)水平為9.3±1.8,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.388,P<0.001)。治療前miR-130b對(duì)靶向治療肺腺癌患者生存的預(yù)測(cè)價(jià)值見(jiàn)圖1,miR-130b預(yù)測(cè)靶向治療肺腺癌患者死亡的最佳臨界點(diǎn)為9.93。當(dāng)miR-130b為9.93時(shí),miR-130b預(yù)測(cè)靶向治療肺腺癌患者死亡的靈敏度為82.2%,特異度為66.2%;ROC曲線下面積(AUC)為0.76。

圖1 miR-130b預(yù)測(cè)靶向治療肺腺癌患者死亡的ROC曲線

2.2 miR-130b表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)ROC曲線分析結(jié)果進(jìn)行分組,miR-130b≥9.93者為高表達(dá)組(n=145),miR-130b<9.93者為低表達(dá)組(n=114)。miR-130b高表達(dá)組有腫瘤家族史、吸煙、低腫瘤分化程度以及高TNM分期患者比例高于低表達(dá)組(P<0.05),見(jiàn)表2。

表2 miR-130b表達(dá)與肺癌患者臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

項(xiàng)目例數(shù)miR-130b高表達(dá)組(n=145)miR-130b低表達(dá)組(n=114)χ2值P值 性別0.0030.956 女15486(59.31)68(59.65) 男10559(40.69)46(40.35) 年齡(歲)0.0170.732 <6010658(40.00)48(42.11) ≥6015387(60.00)66(57.89) 家族史10.7650.001 無(wú)3812(8.28)26(22.81) 有221133(91.72)88(77.19) 吸煙史11.7830.001 無(wú)6625(17.24)41(35.96) 有193120(82.76)73(64.04) 分化程度23.344<0.001 中+低225139(95.86)86(75.44) 高346(4.14)28(24.56) TNM分期34.701<0.001 Ⅲ11541(28.28)74(64.91) Ⅳ163104(71.72)40(35.09)

2.3 肺腺癌患者單因素生存分析

隨訪起止時(shí)間為2014年2月至2019年1月,278例肺腺癌患者中失訪19例,隨訪率93.17%。在隨訪到的259例患者中,死亡191例,中位隨訪時(shí)間為42個(gè)月。Kaplan-Meier并Log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示,miR-130b低表達(dá)組患者中位生存時(shí)間為48個(gè)月,高表達(dá)患者中位生存時(shí)間為36個(gè)月,miR-130b低表達(dá)組患者的生存情況優(yōu)于高表達(dá)組(Log-rankχ2=28.341,P<0.001),見(jiàn)圖2。

圖2 miR-130b表達(dá)與經(jīng)靶向治療肺腺癌患者總體生存相關(guān)性

2.4 肺腺癌患者多因素Cox回歸分析結(jié)果

以生存狀態(tài)(生存=0,死亡=1)為因變量,腫瘤家族史(無(wú)=0,有=1)、吸煙史(無(wú)=0,有=1)、分化程度(高=0,中+低=1)、TNM分期(Ⅲ期=0,Ⅳ期=1)、miR-130b表達(dá)(<9.93為0,≥9.93為1)為自變量,進(jìn)行多因素Cox回歸分析。結(jié)果顯示,肺癌家族史、吸煙史、較低分化程度、較高TNM分期、miR-130b高表達(dá)是經(jīng)靶向治療肺腺癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,見(jiàn)表3。

表3 肺腺癌患者靶向治療預(yù)后多因素生存分析

因素βSEWaldPHR95%CI 腫瘤家族史0.1370.028174.745<0.0011.1471.124～1.170 吸煙史0.7940.083115.256<0.0012.2121.914～2.557 分化程度0.2310.09127.895<0.0011.2591.156～1.373 TNM分期0.6830.11353.489<0.0011.9801.649～2.377 miR-130b0.9680.18927.099<0.0012.6331.829～3.790

3 討論

肺癌患者的預(yù)后較差,雖然早期肺癌患者通過(guò)常規(guī)手術(shù)治療一般可起到根治的效果,但是手術(shù)對(duì)晚期肺癌的治療效果較差,其5年生存率不足15%[13]。近年來(lái),晚期肺腺癌患者分子靶向治療雖取得了新的進(jìn)展,然而由于個(gè)體異質(zhì)性,不同患者的靶向治療效果并不一致。microRNA被證明是腫瘤細(xì)胞對(duì)治療反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子[14],其表達(dá)與患者對(duì)靶向治療的反應(yīng)及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15-16]。

Wang等[17]研究發(fā)現(xiàn),miR-130b表達(dá)上調(diào)提示肝癌患者死亡風(fēng)險(xiǎn)增大。霍續(xù)磊等[18]研究發(fā)現(xiàn),miR-130b在肝硬化患者血清中的表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照者。目前關(guān)于miR-130b表達(dá)與肺癌患者預(yù)后的報(bào)道尚少見(jiàn)。本研究結(jié)果顯示,治療前miR-130b預(yù)測(cè)肺腺癌患者預(yù)后的AUC為0.76,靈敏度為82.2%,特異度為66.2%;另外,miR-130b低表達(dá)組患者的生存情況優(yōu)于高表達(dá)組,且miR-130b高表達(dá)是經(jīng)靶向治療肺腺癌患者死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示miR-130b對(duì)經(jīng)靶向治療肺腺癌患者的預(yù)后判斷具有一定價(jià)值。易敏等[19]研究發(fā)現(xiàn),miR-130b在結(jié)腸癌組織中表達(dá)下調(diào),并與腫瘤體積增大及高TNM分期有關(guān)。本研究結(jié)果顯示,miR-130b高表達(dá)組有腫瘤家族史、吸煙、低腫瘤分化程度以及高TNM分期患者比例高于低表達(dá)組。本研究與易敏等[19]的研究結(jié)果不一致,可能是由于胚層分化來(lái)源差異造成的。miR-130b對(duì)肺癌患者預(yù)后影響的機(jī)制尚不清楚。體外實(shí)驗(yàn)表明,miR-130b可靶向過(guò)氧化物酶體增殖物激活型受體(PPARγ),通過(guò)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)/B淋巴細(xì)胞瘤-2(BCL-2)途徑抑制肺癌細(xì)胞凋亡[20]。Zhang等[21]研究發(fā)現(xiàn),miR-130b通過(guò)激活Wnt蛋白與β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)通路,靶向調(diào)控PTEN誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的耐藥性。

綜上所述,miR-130b對(duì)肺腺癌患者靶向治療預(yù)后的判斷具有一定價(jià)值,miR-130b表達(dá)上調(diào)的肺腺癌患者靶向治療預(yù)后更差,其可能作為肺腺癌患者靶向治療預(yù)后的生物標(biāo)志物之一。