孫秀鳳, 周芬, 吳婷

肺癌是一種發(fā)病率和死亡率極高的常見惡性腫瘤,目前已躍居我國腫瘤死因首位,多發(fā)于男性,其主要致病原因與吸煙、環(huán)境等密切相關(guān)[1-2]。肺癌根據(jù)其生物學(xué)特性和治療方法可分為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)和小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)兩種類型,其中NSCLC約占肺癌患者的90%[3]。長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是一類長于200 bp的非編碼RNA,其在包括肺癌在內(nèi)的多種腫瘤中異常表達(dá)[4-6]。microRNA可以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄效率,抑制目標(biāo)信使RNA翻譯的起始和延伸,促進(jìn)目標(biāo)信使RNA衰變,降低從目標(biāo)信使RNA合成的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性等[7]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1(metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1, MALAT1)又稱為非編碼核內(nèi)富集轉(zhuǎn)錄本1,是最早被證明與人類疾病相關(guān)的lncRNA之一。有研究顯示,MALAT1可參與調(diào)控NSCLC增殖、凋亡及侵襲等過程,但有關(guān)其作用機(jī)制尚存爭議[8-9]。本研究旨在探討lncRNA MALAT1對NSCLS增殖、侵襲遷移及凋亡的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要細(xì)胞及組織

肺癌A549細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫;34例NSCLC腫瘤組織和癌旁正常組織均來自2015年6月至2017年8月在天門市第一人民醫(yī)院接受肺癌手術(shù)的NSCLC患者,其中男17例,女17例;年齡29～70歲,平均(41.13±7.83)歲;體重39～82 kg,平均(61.28±8.59)kg;腫瘤直徑2.5～7.2 cm,平均(4.63±1.58)cm;TNM分期:Ⅰ期6例,Ⅱ期7例,Ⅲ期11例,Ⅳ期10例。納入標(biāo)準(zhǔn):符合2013年衛(wèi)生部臨床路徑專家委員組編寫的《原發(fā)性肺癌外科手術(shù)臨床路徑》中肺癌診斷標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)病理學(xué)診斷確診為NSCLC患者;入院治療前未接受放療、化療、手術(shù)和靶向藥物等治療;術(shù)前均存在可測量病灶,臨床資料完整;無肺部感染和低蛋白血癥;無免疫系統(tǒng)疾病;無呼吸系統(tǒng)疾病;無腫瘤轉(zhuǎn)移或患有其他腫瘤;無先天性肺功能異?；蚧?簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器

E-cadherin Ig1(1∶500,貨號sc-52327)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司;兔抗增殖細(xì)胞周期相關(guān)核抗原(Ki67，1∶500,貨號201826123)、兔抗Caspase-9(1∶500,貨號201872169)和二抗羊抗鼠IgG二抗蛋白(貨號2018630258)購自武漢華聯(lián)科有限公司(代理公司);RPMI1640培養(yǎng)基購自廣州威佳科技有限公司;HRP羊抗兔IgG、HRP羊抗鼠IgG等二抗購自美國Thermo公司;青霉素鈉購自哈藥集團(tuán)制藥總廠;質(zhì)粒購自豐暉生物;TRAIL購自英國Pepro Tech 公司;細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑盒購自賽默飛世爾科技公司;Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自杭州四季青生物工程材料有限公司;磷酸緩沖液PBS購自天津科密歐有限公司。

HC-2068恒溫離心機(jī)購自湖南恒諾離心機(jī)有限公司;Leica DM6000 M光學(xué)顯微鏡購自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司;MoFlo XDP流式細(xì)胞儀購自賽默飛世爾科技有限公司;Thermo forma3111細(xì)胞培養(yǎng)箱購自美國Forma公司;Trans-Blot Turbo蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 將肺癌A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素RPMI1640培養(yǎng)基中,置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將肺癌A549細(xì)胞分為Control組、shRNA-NC組和sh-MALAT1組;其中shRNA-NC組使用空白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,sh-MALAT1組利用干擾RNA(siRNA)敲除lncRNA MALAT1并轉(zhuǎn)染肺癌A549細(xì)胞(由豐暉生物完成),嚴(yán)格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書方法操作;空白對照組不做任何轉(zhuǎn)染處理。轉(zhuǎn)染 48 h 后,收集細(xì)胞,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)檢測MALAT1的表達(dá) 根據(jù)在NCBI中查到RNA MALAT1的核酸序列設(shè)計(jì)引物。將肺癌A549細(xì)胞研磨,用TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,采用蛋白核酸分析儀測定RNA濃度和純度后,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄RNA得cDNA,以該cDNA為模板,按照試劑盒說明書進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)。反應(yīng)條件,95 ℃預(yù)變性5 min,90 ℃變性30 s,65 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min,以β-actin為內(nèi)參,各引物的序列見表1,采用2-ΔΔCt法計(jì)算RNA的相對表達(dá)量。

表1 RT-PCR引物序列

1.3.3 克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對數(shù)生長期的肺癌A549細(xì)胞,制作1×105/ml單細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù),將細(xì)胞接種到6孔板中分細(xì)胞梯度培養(yǎng)(以每孔50個(gè)、100個(gè)、200個(gè)的細(xì)胞梯度),2周后光學(xué)顯微鏡下可見明顯克隆形成,加入結(jié)晶紫染液染色30 min后拍照,并計(jì)算克隆形成率=克隆數(shù)/所種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.4 采用流式細(xì)胞儀檢測肺癌A549細(xì)胞凋亡率 取對數(shù)生長期細(xì)胞,使用恒溫離心機(jī)保持4 ℃,離心 5 min收集細(xì)胞;收集細(xì)胞后加入100 μl Binding Buffer 重懸細(xì)胞并加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,輕輕混勻;室溫避光孵育15 min并加入400 μl Binding Buffer 使用流式細(xì)胞儀檢測肺癌A549細(xì)胞凋亡情況。

1.3.5 采用Transwell檢測肺癌A549細(xì)胞侵襲能力 取對數(shù)生長期肺癌A549細(xì)胞,調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml,使用RPMI1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),小室下層加入正常培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后用無菌棉簽擦去小室內(nèi)細(xì)胞,加入結(jié)晶紫,對侵襲至小室下層的細(xì)胞進(jìn)行染色30 min后觀察,每孔隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì),每組3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.3.6 Western blot檢測Ki67、Caspase-9、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及N-鈣黏蛋白(N-cadherin)蛋白表達(dá)水平 用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳提取總蛋白,半干法將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜,置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測蛋白,孵育2 h,TBS洗凈,蛋白表達(dá)定量分析用Image J圖像分析軟件對條帶進(jìn)行分析,以β-actin為內(nèi)參蛋白,將檢測蛋白的灰度帶入標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)參的灰度標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各蛋白相對表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織與癌旁正常組織中MALAT1表達(dá)情況

肺癌組織與癌旁正常組織中MALAT1表達(dá)水平分別為4.35±1.29、2.01±1.02,肺癌組織中MALAT1表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=8.296,P<0.001)。

2.2 lncRNA MALAT1對NSCLS增殖的影響

shRNA-NC組MALAT1表達(dá)水平、細(xì)胞克隆形成率和Ki67蛋白表達(dá)水平與Control組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),sh-MALAT1組MALAT1表達(dá)水平、細(xì)胞克隆形成率和Ki67蛋白表達(dá)水平均顯著低于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),見圖1。

2.3 lncRNA MALAT1對NSCLS凋亡的影響

shRNA-NC組細(xì)胞凋亡率、Caspase-9蛋白表達(dá)水平與Control組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);sh-MALAT1組細(xì)胞凋亡率、Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著高于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),見圖2。

2.4 lncRNA MALAT1對NSCLS侵襲、遷移的影響

shRNA-NC組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目、E-cadherin及N-cadherin蛋白表達(dá)與Control組差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);sh-MALAT1組單位面積細(xì)胞侵襲數(shù)目和N-cadherin蛋白表達(dá)顯著低于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著高于Control組和shRNA-NC組(P<0.05),見圖3。

注:1A為MALAT1基因表達(dá)情況;1B為細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)(×1);1C為Ki67蛋白表達(dá)情況;a與Control組比較,P<0.05;b與shRNA-NC組比較,P<0.05圖1 lncRNA MALAT1對NSCLS增殖的影響

注:2A為細(xì)胞凋亡情況;2B為Caspase-9蛋白表達(dá)情況;a與Control組比較,P<0.05;b與shRNA-NC組比較,P<0.05圖2 lncRNA MALAT1對NSCLS凋亡的影響

3 討論

MALAT1又稱為肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄本1,是由染色體11q13轉(zhuǎn)錄而來,長度約為8.7 kbp的長鏈非編碼RNA[10]。石婷等[11]研究表明,生理應(yīng)激或癌基因的激活會促進(jìn)MALAT1的表達(dá)水平升高。高度保守的lncRNA MALAT1的失調(diào)與頸腫瘤、肺腫瘤相關(guān)[12-13]。本研究結(jié)果顯示,肺癌患者組織中MALAT1表達(dá)水平顯著高于癌旁正常組織,與王俊鋼等[14]研究結(jié)果一致。Ki67所編碼的基因位于10號染色體上,其分子量為345 kd,是一種細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂增殖相關(guān)的蛋白抗原,其是反映細(xì)胞增殖的敏感指標(biāo),同時(shí)這種基因在維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)方面起著重要作用。馬志君等[15]研究表明:Ki67的表達(dá)與細(xì)胞增殖密切相關(guān),是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要組成部分。本研究結(jié)果顯示,sh-MALAT1組細(xì)胞克隆形成率及Ki67蛋白表達(dá)水平顯著低于Control組和shRNA-NC組,提示sh-MALAT1組肺癌A549細(xì)胞增殖受到了顯著地抑制,這可能是由于MALAT1通過抑制Ki67的表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞周期,使得A549細(xì)胞增殖受到抑制。

注:3A為Transwell小室實(shí)驗(yàn)(×400);3B為侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)情況;a與Control組比較,P<0.05;b與shRNA-NC組比較,P<0.05圖3 長鏈非編碼RNA MALAT1對NSCLS侵襲、遷移影響

調(diào)控癌細(xì)胞不僅要抑制其增殖,促進(jìn)其凋亡也是重要手段之一。其中Caspase是細(xì)胞凋亡的核心,Caspase-3、Caspase-9等是Caspase家族的凋亡因子。賈曉鵬等[16]通過前列腺腺癌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析得出:Caspase-9基因處于Caspase家族激活基因的頂端,是Caspase家族中最常見的凋亡啟動(dòng)子,通過自身的裂解使得proCaspase-3產(chǎn)生有活性的Caspase-3。這種有活性的Caspase-3是執(zhí)行凋亡的基因,主要作用機(jī)理是通過剪切另外的Caspase底物引起級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示,與shRNA-NC組相比,sh-MALAT1組細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率均顯著升高,提示降低MALAT1的表達(dá)可以通過調(diào)控細(xì)胞凋亡因子的水平促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。肖宜等[17]研究表明:升高M(jìn)ALAT1的表達(dá)水平可以促進(jìn)凋亡因子的表達(dá),有效促癌細(xì)胞的凋亡,與本研究得出的結(jié)論相一致。

E-cadherin是黏附分子蛋白家族的一員,E-cadherin表達(dá)下調(diào)會使間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如波形蛋白(Vimentin)、纖聯(lián)蛋白(fironcetion)等表達(dá)上調(diào),誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞因子、轉(zhuǎn)錄因子及輔助作用的一些酶等均表達(dá)上調(diào)[18]。蒲金定等[19]研究表明:癌細(xì)胞中最重要的標(biāo)志性變化就是E-cadherin的減少或丟失。N-cadherin也被稱為鈣黏著蛋白-2(CDH2)或神經(jīng)鈣黏著蛋白(NCAD),是人體由CDH2基因編碼的蛋白質(zhì)。N-cadherin是在多種組織中表達(dá)并起到介導(dǎo)細(xì)胞-細(xì)胞黏附功能的跨膜蛋白。本研究結(jié)果顯示,與shRNA-NC組相比,sh-MALAT1組E-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著升高,N-cadherin蛋白表達(dá)水平顯著降低,提示降低MALAT1的表達(dá)可以通過上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程改變NSCLC細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。劉速等[20]研究表明,lncRNA MALAT1可以有效抑制癌細(xì)胞的侵襲遷移及運(yùn)動(dòng)能力,與本研究得出的結(jié)論相一致。

綜上所述lncRNA MALAT1在肺癌組織中過表達(dá),敲低NSCLC細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平可以抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲及遷移并促進(jìn)NSCLC細(xì)胞的凋亡,其作用機(jī)制可能與調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)相關(guān),同時(shí)lncRNA MALAT1可以通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程抑制癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將通過小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探討MALAT1在小鼠體內(nèi)的表達(dá)對肺癌的影響。