胡新宇，邢凱，李征，趙志顯，常雪蕊，齊曉龍，盛熙暉，王相國，倪和民，郭勇*

(1. 北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206； 2. 北京市飼料監(jiān)察所，北京 100107)

在實(shí)驗(yàn)用小鼠中，隨著1972年Whittingham等[1]將小鼠胚胎成功冷凍并復(fù)蘇之后，即開啟了動(dòng)物源胚胎程序化冷凍的序章。經(jīng)前期研究所示，小鼠休眠胚胎的抗凍能力要優(yōu)于其正常孵化胚胎[2]。通過Affymetrix表達(dá)譜芯片對(duì)四組胚胎(孵化囊胚、冷凍后孵化囊胚、休眠胚胎、冷凍后休眠胚胎)掃描時(shí)發(fā)現(xiàn)Mgst1(microsomal glutathione S-transferase 1，微粒體谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1)基因在休眠胚胎冷凍前后具有顯著差異[3]。Mgst1在肝臟，腫瘤及癌細(xì)胞中表達(dá)量較高，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、微粒體和線粒體外膜，能夠被氧化應(yīng)激活化[4-5]。在胚胎干細(xì)胞以及其體外誘導(dǎo)分化后都具有較高的表達(dá)量[6]。Br?utigam等[7]通過Mgst1 KO/WT小鼠研究發(fā)現(xiàn)其后代中沒有KO/KO型小鼠的存在，且KO/KO型胚胎無法繼續(xù)至10 d之后。因此，Mgst1在胚胎前期乃至著床后發(fā)育中均具有至關(guān)重要的作用。由此，本實(shí)驗(yàn)將以Mgst1對(duì)于孵化及休眠胚胎抗凍性方面切入，通過對(duì)于胚胎中Mgst1的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的差異表達(dá)顯著性以及該蛋白在胚胎中表達(dá)分布情況，分析休眠胚胎抗凍性優(yōu)于正常孵化囊胚的原因，為闡明哺乳動(dòng)物胚胎在相關(guān)抗凍機(jī)理研究中提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)用SPF級(jí)ICR 7 ～ 8周齡雌雄鼠均購自北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(京)2016-0006】，飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房【SYXK(京)2015-0004】，光照7:00～ 19:00，自由采食飲水飼喂普通維持飼料由北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22 ～ 25℃，所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求。飼養(yǎng)兩周至性成熟(9 ～ 10周齡)，體重約28 g后，即可用于實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 主要儀器試劑

胚胎冷凍保護(hù)劑(貨號(hào)：101129)購自 ICP Bio Reproduction公司；重組Anti-Mgst1抗體(貨號(hào)：ab131059)購自Abcam公司；Donkey Anti-Rabbit IgG H&L(FITC)(貨號(hào)：ab6798)購自Abcam公司；TRIzolTMReagent(貨號(hào)：15596-018)購自Thermo Fisher公司；qRT-PCR專用UltraSYBR Mixture(High ROX)染料試劑盒(貨號(hào)：CW2602M)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

CO2培養(yǎng)箱：Thermo Scientific Forma 371；普通光學(xué)顯微鏡(Nikon YS2-H)；胚胎程序化冷凍儀(Cryobath-FREEZ CONTROL CL-8800i)；電子天平(Sartorius，BSA124S)；熒光定量PCR儀(安捷倫AriaMx Real-Time PCR System G8830A)；移液器[Eppendorf(1 mL、200 μL、100 μL、10 μL)]；掌心離心機(jī)(百晶，Qspin)；單孔水浴鍋(北京長安科學(xué)儀器廠)；貝克曼高速離心機(jī)(Allegra 64R Centrifuge)；載玻片；蓋玻片；計(jì)時(shí)器。

1.2 方法

1.2.1 超排處理及胚胎獲取

選擇發(fā)情期或發(fā)情間期的ICR雌鼠，實(shí)驗(yàn)當(dāng)晚20:00，每只腹腔注射10 IU的PMSG，48 h后，每只小鼠再腹腔注射10 IU hCG，然后與公鼠按1∶1合籠，次日早8:00挑選出見栓小鼠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)[8]。正常孵化囊胚于小鼠見栓第5天的早8:00，通過用PBS液正、反雙向沖洗其雙側(cè)子宮獲取。休眠胚胎則在小鼠見栓后的第4天早8:00，在徹底摘除小鼠雙側(cè)卵巢后，連續(xù)3 d頸部皮下注射0.2 mg/mL孕酮(每只0.1 mL)，術(shù)后第4天早8:00，用PBS液正、反雙向沖洗其雙側(cè)子宮獲取。回收的胚胎用PBS液充分洗滌后，進(jìn)行常規(guī)程序化冷凍處理：將胚胎在15℃中平衡15 min之后，以1℃/min降低至-5℃，平衡30 min，再以0.33℃/min降低至 -36℃。進(jìn)行37℃解凍復(fù)蘇2 h后，移入1.5 mL無菌離心管中，放入-80℃冰箱保存。

1.2.2 激光共聚焦檢測Mgst1蛋白在胚胎上的分布

當(dāng)日回收經(jīng)由PBS工作液清洗的胚胎后，立即放入4%多聚甲醛中固定30 min，PBS清洗3 min × 5次后用0.2% TritonX-100，PBS通透5 min。胚胎充分清洗后轉(zhuǎn)移至Mgst1一抗中4℃過夜。胚胎結(jié)合一抗后用0.05%Tween-20，PBS洗滌后置于帶有FITC標(biāo)簽的二抗中，37℃孵育1 h，隨后用0.05%Tween-20，PBS清洗胚胎并放入PI(碘化丙啶)溶液中37℃浸染3 min，浸染完成后將胚胎用0.05%Tween-20，PBS徹底清洗干凈后，胚胎置于帶有微量PBS的載玻片上，蓋玻片四角點(diǎn)入微量凡士林壓片，中性樹膠封片，隨后于激光共聚焦掃描顯微鏡中成像檢測。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI基因數(shù)據(jù)庫中小鼠Mgst1(NM_001347489.2)和GADPH(NM_008084.3)基因序列,用Primer3.0軟件網(wǎng)上在線設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物，引物序列見表1。

1.2.4 qRT-PCR 檢測胚胎冷凍前后Mgst1 mRNA 的表達(dá)變化

程序化冷凍前后胚胎通過 TRIzol法提取其總RNA，隨后放入1 μg反轉(zhuǎn)體系中反轉(zhuǎn)為cDNA，體系見表2。使用熒光定量PCR儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng),其反應(yīng)體系為：12.5 μL UltraSYBR Mixture(High ROX)，10.5 μL dd H2O，1 μL上下游引物1∶1混合物，1 μL反轉(zhuǎn)體系后所得cDNA。PCR擴(kuò)增程序:預(yù)變性，95℃，30 s；變性，95℃，5 s，退火，59℃，30 s，延伸，72℃，30 s，40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表2 mRNA反轉(zhuǎn)錄體系Table 2 mRNA reverse transcription system

注：加入olige dT后，70℃孵育3 min，隨后置于冰上3 min。隨后依次加入其它物質(zhì)并在39℃條件下孵育1 h即可得到cDNA。

Note. After adding olige dT, incubate at 70℃ for 3 min, and then place on ice for 3 min. Subsequently, other materials were added sequentially and incubated at 39℃ for 1 h to obtain cDNA.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，使用GraphPad Prism 7軟件制作數(shù)據(jù)分析圖[8]。

2 結(jié)果

2.1 Mgst1蛋白在程序化冷凍前后小鼠正常孵化囊胚和休眠胚胎中表達(dá)分布

如圖1、圖2所示，通過共聚焦圖像可以發(fā)現(xiàn)，Mgst1蛋白在冷凍前后的正常與休眠胚胎中均有表達(dá)，其表達(dá)區(qū)域位于細(xì)胞核外，且主要分布于胚胎滋養(yǎng)層中。

注：A：孵化囊胚；B：冷凍后孵化囊胚。綠色熒光代表Mgst1蛋白分布區(qū)域；紅色熒光代表細(xì)胞核位置(× 60，標(biāo)尺=100 μm)。圖1 Mgst1蛋白在孵化囊胚冷凍前、后蛋白表達(dá)定位Note. A, Hatched blastocysts. B, Blastocysts hatched after cryopreservation. Green fluorescent signal represents the distribution region of Mgst1 protein. Red fluorescent signal indicates the nuclear location(× 60, Bar=100 μm).Figure 1 Localization of Mgst1 protein expression before and after cryopreservation in hatched blastocysts

注：A： 休眠胚胎；B：冷凍后休眠胚胎。綠色熒光代表Mgst1蛋白分布區(qū)域；紅色熒光代表細(xì)胞核位置(× 60，標(biāo)尺=100 μm)圖2 Mgst1蛋白在休眠囊胚冷凍前、后蛋白表達(dá)定位Note. A, Dormant embryos. B, Dormant embryos after cryopreservation. Green fluorescent signal represents the distribution region of Mgst1 protein. Red fluorescent signal indicates the nuclear location(× 60, Bar=100 μm).Figure 2 Localization of Mgst1 protein expression before and after cryopreservation in dormant blastocysts

2.2 qRT-PCR檢測結(jié)果

如圖3所示，經(jīng)過程序化冷凍后的囊胚與休眠胚胎分別與其冷凍前的正常囊胚與休眠胚胎相比，Mgst1基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著性升高(P< 0.05)，且經(jīng)程序化冷凍后休眠胚胎與休眠胚胎相比，Mgst1基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量極顯著性升高(P< 0.01)；與此同時(shí)，經(jīng)程序化冷凍后休眠胚胎與經(jīng)過程序化冷凍后的正常孵化囊胚相比，Mgst1基因的mRNA的相對(duì)表達(dá)量同樣具有顯著性升高趨勢(P< 0.05)。

注：A：孵化囊胚；B：冷凍后孵化囊胚；C：休眠胚胎；D：冷凍后休眠胚胎。上標(biāo)相同字母表示差異無顯著性，P> 0.05；不同字母表示差異有顯著性，P< 0.05。圖3 Mgst1基因相對(duì)表達(dá)量分析圖Note. A, Normal hatched blastocysts. B, Blastocysts hatched after freezing. C, Dormant blastocysts. D, Dormant blastocysts after freezing. The same letter indicates that the difference is not significant, P > 0.05. The different letters indicate that the difference is significant, P < 0.05.Figure 3 Relative expression of Mgst1 gene

3 討論

超低溫冷凍保存雖然能夠長時(shí)間儲(chǔ)存優(yōu)質(zhì)胚胎。到目前為止，任何發(fā)育時(shí)期(原核時(shí)期、分裂時(shí)期、孵化囊胚)的胚胎，與其冷凍前相比，在移植后的存活率較之前仍有著較大差距。

Mgst1(微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶1)是一種膜結(jié)合型谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，主要位于肝臟中，且在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及線粒體內(nèi)膜中表達(dá)量較高[9]。由于其通過谷胱甘肽依賴性轉(zhuǎn)移酶和過氧化物酶的活性，可對(duì)于活性中間體(其中包括代謝所產(chǎn)生的親電中間體和親脂性氫過氧化物)進(jìn)行解毒，因此能夠降低活性氧對(duì)于細(xì)胞膜的損傷程度[10]。

通過本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，Mgst1蛋白在小鼠的孵化囊胚、休眠胚胎以及經(jīng)由程序化冷凍后的孵化囊胚和休眠胚胎中均有表達(dá)，其說明Mgst1蛋白在胚胎的早期發(fā)育及著床過程中有著重要的作用。先前的研究已經(jīng)證實(shí)，Mgst1能夠減少氧化應(yīng)激所產(chǎn)生的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[11]。而在細(xì)胞冷凍之后，脫水所引起的滲透壓劇烈變化以及低溫保護(hù)劑毒性對(duì)細(xì)胞膜的損傷均可導(dǎo)致細(xì)胞膜功能喪失[12]。因此冷凍后的細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生氧化應(yīng)激并導(dǎo)致線粒體膜通透性發(fā)生變化，其中的線粒體膜間細(xì)胞色素釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)一步激活caspase-9活性，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。

qRT-PCR結(jié)果顯示，小鼠的孵化囊胚與休眠胚胎在經(jīng)程序化冷凍后，其Mgst1基因的表達(dá)量均較冷凍之前顯著上升。在胚胎著床時(shí)，Mgst1在著床位點(diǎn)上表達(dá)量較高的胚胎有較高的生物學(xué)活性[14]，且在其表達(dá)量下降人類患者中，胚胎將不能夠正常著床[15]。同時(shí)，程序化冷凍會(huì)對(duì)于細(xì)胞的生物膜系統(tǒng)構(gòu)成損害[16]，以至于線粒體內(nèi)膜在程序化冷凍過程中會(huì)遭到破壞，進(jìn)而降低其線粒體本身功能[17]，使得細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力大幅度下降[18]。由于細(xì)胞自身具有抗氧化機(jī)制[19]，且Mgst1在氧化應(yīng)激中有著重要的作用[20]。因此，解凍后的胚胎此時(shí)很有可能在處于著床時(shí)期的同時(shí)經(jīng)受氧化應(yīng)激，進(jìn)而使得胚胎Mgst1基因在短時(shí)間之內(nèi)顯著上調(diào)。

休眠胚胎，即胚胎滯育現(xiàn)象是動(dòng)物為了能夠更好的在環(huán)境中生存而進(jìn)化出的一種能夠保證物種繁育的策略[21-22]。且其與正常孵化囊胚之間有著大量表達(dá)差異的基因[23]。在本實(shí)驗(yàn)中，Mgst1的mRNA在冷凍后的休眠胚胎中的相對(duì)表達(dá)量極顯著高于冷凍前的正常孵化囊胚與休眠胚胎。這可能是胚胎在經(jīng)受冷凍氧化應(yīng)激之后所采取的抗氧化措施。因此，可以推測，Mgst1很可能在胚胎的程序化冷凍過程中起到非常重要的作用。但其在抗凍過程中能否起到?jīng)Q定性的作用，需進(jìn)行進(jìn)一步具體探究。