張璞，林育，游斌杰，孫靜,5*

(1. 四川農(nóng)業(yè)大學畜禽品種資源發(fā)掘與利用省重點實驗室，四川 611130； 2. 重慶市畜牧科學院，重慶 402460； 3. 農(nóng)業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 402460； 4. 養(yǎng)豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶 402460； 5. 重慶市醫(yī)用動物資源開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，重慶 402460)

家豬(Susscrofadomesticus)屬于哺乳綱、真獸亞綱、偶蹄目，是較早被馴化的動物之一[1]，也是最為廣泛的肉類來源。在馴化過程中，豬體型的頭軀比從原始野豬的7∶3變成了現(xiàn)代家豬的3∶7左右，使得現(xiàn)代家豬具有很強的產(chǎn)肉性能[2]。我國是豬肉生產(chǎn)大國，豬肉是我國城鄉(xiāng)居民主要消費的肉類，豬肉消費比重占肉類消費總量的60%左右。全世界豬肉的消費比重在總體肉類消費中同樣占據(jù)重要地位。

除了可以提供肉制品，豬還是重要的模式動物。盡管豬是非靈長類動物，但是在基因同源度、部分器官解剖學結(jié)構(gòu)、新陳代謝方式等多個方面與人類有著較高相似性[3-4]。利用其繁殖性能優(yōu)秀、單胎產(chǎn)子數(shù)多等特點，可以在較短時間內(nèi)提供充足的試驗材料。如今豬的克隆技術(shù)已較為成熟，可在一定程度上進行相關(guān)基因的編輯[5-6]，為疾病研究提供穩(wěn)定且性狀均一的動物模型，現(xiàn)階段在疾病模型研究中已經(jīng)有了一定應用[7-11]，同時有望作為器官供體進行器官移植[12]。

編碼免疫球蛋白(immunoglobulin，IG)的基因包括重鏈(immunoglobulin heavy chain)和輕鏈(immunoglobulin light chain)基因，重鏈和輕鏈的胚系基因(germline gene)由編碼可變區(qū)(V區(qū))和恒定區(qū)(C區(qū))的多個基因偏關(guān)串聯(lián)形成的基因簇組成。重鏈可變區(qū)基因包括V、D、J三類基因片段，輕鏈可變區(qū)基因包括V、J兩類基因片段[13]。重鏈和輕鏈基因在基因組中通常位于不同染色體上，其胚系基因彼此由內(nèi)含子隔開。

免疫球蛋白是指具有抗體活性且化學結(jié)構(gòu)與抗體類似的一類球蛋白，具有調(diào)節(jié)免疫、介導消除抗原等多種功能。免疫球蛋白分子單體都具有由兩條重鏈多肽和兩條輕鏈多肽組成的基本結(jié)構(gòu)，兩條輕鏈分別靠二硫鍵及非共價作用力與重鏈結(jié)合，兩條重鏈間通過二硫鍵與非共價鍵的親水和疏水作用力結(jié)合在一起，形成一個Y字型結(jié)構(gòu)[13]。根據(jù)重鏈和輕鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)的不同可以將重鏈分為五類(α，δ，ε，γ，μ鏈)，分別組成IGA、IGD、IGE、IGG、IGM五類免疫球蛋白；將輕鏈蛋白分為κ型和λ型，分別對應IGK與IGL。

基因注釋方法主要包括兩大類：一是進行序列比對，二是進行從頭預測。研究者在對芥菜(Brassicajuncea)基因組進行基因注釋時便采用了這兩種注釋策略，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，取得了很好的注釋效果[14]。彭長軍等人對大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)基因組重復序列采取了基于序列比對的方法注釋其轉(zhuǎn)座子元件，選取的數(shù)據(jù)庫為食肉目，仍獲得了不錯的注釋效果[15]。在對某一種或某一類基因進行預測時，通過序列對比的預測方法較為常用[16-17]。

最新版豬基因組(Susscrofa11.1版本)是2018年由英國羅斯林研究所Alan團隊主導拼裝并公布的，其基因組組裝指標contig N50已經(jīng)提高到與人接近的水平，是極其優(yōu)秀的參考基因組?；蚪M組裝得越好，對基因、功能元件、基因組修飾等的注釋幫助就越大。當前版本豬基因組組裝得足夠好，但是豬的免疫球蛋白基因并未獲得完全注釋。豬與人的基因相似度較高，而人的免疫球蛋白基因研究得足夠深入，通過序列對比對豬的免疫球蛋白基因進行注釋可能取得不錯的效果。研究表達的豬免疫球蛋白基因有助于了解相關(guān)免疫球蛋白的組裝機制，進一步研究豬對抗原、病原的免疫特性，以更好地發(fā)揮其作為農(nóng)用動物及疾病模型的作用。

1 材料與方法

1.1 資料來源

人的免疫球蛋白基因信息下載自NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，豬的最新版基因組數(shù)據(jù)(Sscrofa 11.1)下載自Ensembl數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/Sus_scrofa/Info/Index)。

1.2 數(shù)據(jù)處理

我們首先利用已知的人免疫球蛋白基因作為模板，使用Blast+(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK52640/)，將豬基因組數(shù)據(jù)進行序列比對，篩選出潛在的豬的免疫球蛋白基因，并進行定位與注釋；之后結(jié)合注釋信息使用R軟件繪制基因圖譜；并根據(jù)已知的人免疫球蛋白基因信息，與鑒定所得豬的免疫球蛋白基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，使用TreeBest(http://treesoft.sourceforge.net/treebest.shtml)基于Neighbor-joining計算方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

同時我們根據(jù)鑒定出的豬的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因片段，使用DNAstar(DNAstar Inc., Madison, USA)對其核苷酸序列進行同源性分析，將同源性大于80%的序列劃分為同一基因家族。此外我們還使用WebLogo[18]分別對豬免疫球蛋白的重鏈和輕鏈基因序列繪制序列標識圖。

2 結(jié)果

2.1 豬免疫球蛋白基因及其基因座結(jié)構(gòu)概述

BLAST搜索共鑒定出43個免疫球蛋白重鏈基因，其中IGHE基因1個，IGHG基因7個，IGHV基因35個，這些基因散亂地分布于多個scaffold上，難以對其進行具體定位(見表1)。

同樣方法鑒定出52個免疫球蛋白輕鏈基因，其中IGK型輕鏈蛋白基因27個，IGL型輕鏈蛋白基因25個。IGK基因分布于一個基因組scaffold上，所有基因跨越的長度范圍為290,541 bp。其中V區(qū)基因26個，C區(qū)基因1個，具體注釋信息見圖1。IGL基因分布于14號染色體上，長度范圍為250,644 bp。其中V區(qū)基因21個，C區(qū)基因4個，具體注釋信息見圖2。

表1 豬的IGH基因概述Table 1 Summaries of IGH gene in pig

圖1 豬的IGK基因物理圖譜Figure 1 Physical map of IGK gene in pig

2.2 豬免疫球蛋白基因的系統(tǒng)發(fā)生分析

選取所有鑒定出的豬免疫球蛋白基因片段，對比分析豬與人的免疫球蛋白基因的進化關(guān)系。結(jié)果如圖3、圖4、圖5所示，免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因的V區(qū)與C區(qū)的基因被劃分成兩個分支。對IGH與IGL基因的分析發(fā)現(xiàn)，豬與人的VH(重鏈可變區(qū))和VL(L鏈可變區(qū))基因聚在一起，表明其具有很高的相似度，而對IGK基因的分析發(fā)現(xiàn)，一部分豬的VK基因獨立聚在一起，跟人的VK(K鏈可變區(qū))基因同源性很低，不排除其為假基因的可能。

2.3 豬免疫球蛋白基因家族分析

根據(jù)鑒定出的豬免疫球蛋白基因序列的相似性，將相似性80%及以上的序列劃分為一個免疫球蛋白基因家族。免疫球蛋白重鏈基因可分為七個家族，每個家族包含的基因數(shù)1到18個不等；輕鏈IGK基因可分為六個基因家族，每個家族基因數(shù)1到12個不等；IGL基因可分為九個基因家族，每個家族基因數(shù)1到6個不等。同時，根據(jù)IGH、IGK和IGL基因的序列繪制序列標識圖(Sequence logo)，見圖6、圖7、圖8，提示在同一種免疫球蛋白基因中，大部分位點存在較高的保守性。

3 討論

此前的研究表明，多種動物的免疫球蛋白基因庫遠大于其抗體庫[19]。一部分免疫球蛋白基因在復制的過程中發(fā)生點突變并成為新的免疫球蛋白基因家族成員，這可能是免疫球蛋白各家族成員龐大且序列相似度較高的原因之一。免疫球蛋白存在多種亞型，并非所有編碼免疫球蛋白的基因會常時性表達，如敲除IGD的小鼠對部分胸腺依賴性和非胸腺依賴性抗原的免疫反應良好[20]，而兔子則完全缺乏IGD[21]。一些具有IGD基因的哺乳動物也幾乎不表達它，但不能忽視這些免疫球蛋白亞型的作用。因此，在基因組層面注釋免疫球蛋白基因，了解其基因庫特征將有助于揭示其系統(tǒng)發(fā)育機制及表達機制，從而建立更加有效的適應性免疫系統(tǒng)。

圖2 豬的IGL基因物理圖譜Figure 2 Physical map of IGL gene in pig

圖3 豬與人的IGH基因系統(tǒng)發(fā)生分析Figure 3 Phylogenetic analysis of IGH gene in pig and human

圖4 豬與人的IGK基因系統(tǒng)發(fā)生分析Figure 4 Phylogenetic analysis of IGK gene in pig and human

圖5 豬與人的IGL基因系統(tǒng)發(fā)生分析Figure 5 Phylogenetic analysis of IGL gene in pig and human

圖6 豬IGH基因的序列標識圖Figure 6 Sequence logo of IGH gene in pig

圖7 豬IGK基因的序列標識圖Figure 7 Sequence logo of IGK gene in pig

圖8 豬IGL基因的序列標識圖Figure 8 Sequence logo of IGL gene in pig

基于免疫球蛋白基因的保守性，研究者利用脊椎動物免疫球蛋白重鏈基因克隆了中華鱉(Pelodiscussinensis)的免疫球蛋白重鏈基因，發(fā)現(xiàn)中華鱉的三種免疫球蛋白重鏈亞型(IGM、IGY和IGD)跟雞、青蛙、壁虎和人等的相應亞型有40% ～ 50%的同一性[22]。此外，基于序列同源性比對鑒定出爬行動物變色蜥(Anolinscarolinensis)的免疫球蛋白重鏈基因座[23]，預示基于序列比對、利用生物信息學分析手段預測免疫球蛋白基因是可行的。

由于豬與人在基因同源度、部分器官解剖學結(jié)構(gòu)等多個方面的高度相似性，從生物信息的角度，通過比對人的免疫球蛋白基因與豬基因組可成功篩選鑒定出相關(guān)的豬免疫球蛋白基因。此前對豬的免疫球蛋白可變區(qū)的研究共發(fā)現(xiàn)約33個VH基因。由于輕鏈基因的研究較少，共發(fā)現(xiàn)14-15個VL基因，而且VK基因數(shù)目存在較大波動[19]。本研究共鑒定豬的IGH基因43個，可分為7個基因家族；IGK基因27個，可分為6個基因家族；IGL基因25個，可分為9個基因家族。這將有助于對豬免疫特性等研究，以期更好地發(fā)揮其作為疾病模型的作用。結(jié)合更多免疫球蛋白的研究，可深入探索豬免疫球蛋白重排特性、連接特性等。

在小鼠和人等多種動物上的研究表明，免疫球蛋白基因可變區(qū)的基因數(shù)目往往遠大于恒定區(qū)的基因數(shù)目，可變區(qū)的V基因片段通常具有較高的相似性，通常按照80%的相似性進行基因家族的劃分。小鼠的VH基因十分豐富，總數(shù)上百個[24]，至少可以分為九個家族。研究表明小鼠免疫球蛋白重鏈基因受到增強子的調(diào)控[25]。人的VH基因按照相似性至少可以分為七個家族，并且各個家族的基因片段并不是相互獨立，可與其他家族混雜分布于染色體上。從豬的免疫球蛋白重鏈和輕鏈基因序列標識圖(圖6-8)還可以看出其IGH、IGK和IGL基因序列上具有一定的保守性，其VH、VK和VL基因片段的序列也具有較高的相似性。

對免疫球蛋白輕鏈的研究在多種哺乳動物中都發(fā)現(xiàn)了κ型和λ型兩種輕鏈類型，但是在鳥類上僅發(fā)現(xiàn)λ型輕鏈[26]。在哺乳動物中，κ型和λ型輕鏈蛋白所占比例有所不同。人和小鼠以κ型輕鏈為主，牛、馬、貓、狗等動物主要的輕鏈蛋白卻是λ型，由漿細胞產(chǎn)生的豬免疫球蛋白的κ型和λ型輕鏈蛋白比例近乎相等[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，豬的IGK和IGL型免疫球蛋白基因數(shù)目較為接近，雖然免疫球蛋白的含量并不能僅靠基因評定，但可通過其可變區(qū)V、J基因片段去探索豬的VJ重組多樣性，為進一步研究豬的κ型和λ型免疫球蛋白奠定基礎。