陳紅娜，葉 剛，陳 銀，吳治明，黃志光，鮮 軍，楊維芳，崔侖標，張育富，褚宏亮

蜱屬蛛形綱寄螨目，可攜帶病毒、細菌、寄生蟲等病原體，為重要的自然疫源性疾病和人獸共患病的傳播媒介。蜱種類和蜱傳病原體在我國不同省份的分布不同，在空間和時間上分布不均[1]。新疆維吾爾自治區(qū)是我國最大的省份，面積占全國的1/6以上，蜱種類豐富。據(jù)文獻記載新疆迄今已發(fā)現(xiàn)蜱類2科10屬49種，占全國已知蜱類的1/3以上，新疆蜱媒疾病已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10多種[2]。近年，新疆邊境地區(qū)毗鄰的周邊國家新現(xiàn)多種蜱傳疾病，但是新疆北部的克拉瑪依地區(qū)，對蜱攜病原體和其所致疾病缺乏研究[3]。本研究旨在調(diào)查新疆克拉瑪依地區(qū)蜱種類及其攜帶的病原體，為該地區(qū)蜱傳疾病的防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1蜱采集與鑒定 本研究從克拉瑪依市不同地區(qū)(克拉瑪依、烏爾禾、獨山子和白堿灘)的植被或家畜中采集蜱，收集到離心管中，記錄采集點、經(jīng)緯度、宿主種類、采集日期等信息。利用分類圖譜對蜱的種類進行鑒定。

1.2DNA提取 按照蜱種類和采集時間、地點和寄生宿主，將1～5個成蜱放入1.5 mL EP管中。用70%的乙醇將蜱在試管中清洗3次，然后用解剖刀切開。利用組織研磨器(購于德國QIAGEN公司)研磨均化樣品，按照試劑盒說明書(購于Roche公司)提取基因組DNA和RNA，-80 ℃凍存。

1.3PCR擴增 采用熒光定量RT-PCR或套式PCR試劑盒，對蜱中可能存在的多種病原體進行分子檢測。采用套式和半套式PCR兩種方法分別檢測巴貝斯蟲/泰勒蟲(Babesia/Theileria)和斑點熱群立克次體(Spottedfevergrouprickettsiae, SFGR)。實時熒光定量RT-PCR用于檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征新布尼亞病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome bunya virus, SFTSV)、克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus, CCHFV)、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus, TBEV)、貝氏立克次體(Rickettsiaburnetii)、伯氏疏立克次體(Borreliaburgdorferisensu lato)和恙蟲病東方體(Orientiatsutsugamushi, O.t)，查菲埃立克次體(ehrlichiachaffeensis)。PCR檢測方法、目的基因、引物等詳見表1。

表1 PCR檢測方法、目的基因、引物序列
Tab.1 PCR methods，Target genes, primers sequence used for pathogens identification

病原體種類方法目的基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp參考文獻巴貝斯蟲/泰勒蟲Nested PCR18S rDNABab-outF (AATTACCCAATCCTGACACAGG)Bab-outR (TTTGGCAGTAGTTCGTCTTTAACA)540[11-12]Bab-inF (GACACAGGGAGGTAGTGACAAGA)Bab-inR (CCCAACTGCTCCTATTAACCATTAC)421新疆出血熱病毒Real-time RT-PCRS segmentCCHFs-f ( TCTCAAAGAAACACGTGCC)CCHFs-r ( CYTTYTTRAACTCYTCAAACC)CCHFs-p (FAM- ACTCAAGDKAACACTGTGGGCGTAAG-BHQ)[13]恙蟲病立克次體Real-time RT-PCR47-kD outer membrane protein geneOtsuFP630 (AACTGATTTTATTCAAACTAATGCTGCT)OtsuRP747 (TATGCCTGAGTAAGATACRTGAATRGAATT)OtsuPR665 (FAM-TGGGTAGCTTTGGTGGACCGATGTTTA-ATC T-TAMRA_)[14]斑點熱群立克次體Seminested PCROmpA geneRr190-70 ( ATGGCGAATATTTCTCCAAAA)Rr190-701( GTTCCGTTAATGGCAGCATCT)632[15]Rr190-602( AGTGCAGCATTCGCTCCCCCT)532貝氏立克次體Real-time RT-PCRISllla geneISllla-f ( TGGGCTGCGTGGTGATG)ISllla-r ( TGACGTGCTGCGGACTGAT)ISllla-p (FAM- CGTGTGGAGGAGCGAACCATTGGTAT-BHQ)[16]表1(續(xù))病原體種類方法目的基因引物序列(5′-3′)片段大小/bp參考文獻查菲埃立克次體Real-time PCR16S rRNAECH16S-17 (5-GCGGCAAGCCTAACACATG-3_)ECH16S-97 (5-CCCGTCTGCCACTAACAATTATT-3_)ECH16S-38 (5-AGTCGAACGGACAATTGCTTATAAC-CTTTTGGT-3_)[17]伯氏疏螺旋體Real-time PCR16S rRNABorre 16S-F GCTTCGCTTGTAGATGAGTCTGBorre 16S-R GCGGAAGATTCTTAGCTGCTGBorre 16S-P FAM-CCGTATCTCAGTTCCAGTGTGACCG- E-clipse)[18]布尼亞病毒Real-time PCRS segmentSFTSV-F-GGGTCCCTGAAGGAGTTGTAAASFTSV-R-TGCCTTCACCAAGACTATCAATGTFAM-TTCTGTCTTGCTGGCTCCGCGC-BHQ1[19]蜱傳腦炎病毒Real-time PCRNS5TBEVNS-F GATCAAGTTCAGAGCGGGAATGTBEVNS-R CGATGTCACACATGATGGTATCAGTBEVNS-P FAM-ATGTGTTCAGCATGCAACCACACCGA-BHQ[20]

1.4同源性比對分析 將陽性PCR產(chǎn)物送生工生物公司測序，所得測序結(jié)果通過NCBI的BLAST程序在線檢索分析。本研究引用我國及其他國家和地區(qū)分離的覆蓋11個基因型的18株SFGR毒株，其中嗜吞噬細胞無形體(Anaplasmaphagocytophilum)毒株為外群(圖1)，通過MEGA 6軟件繪制OmpA基因核苷酸序列進化樹；26株巴貝斯蟲/泰勒蟲的18SrDNA基因，其中銅平鲉(SebastesCaurinus)毒株為外群(圖2)繪制核苷酸序列進化樹。 繪制方法為Neighbor-joining法(參數(shù)設(shè)置為500 replications)。

2 結(jié) 果

2.1蜱鑒定 從宿主動物(狗、羊、山羊、牛、馬)和環(huán)境(哈羅木、沙漠、楊樹)中共采集硬蜱683只，其中銀盾革蜱(Dermacentorniveus) 311只 (45.53%)，亞東璃眼蜱(Hyalommaasiaticumkozlovi) 362只(53%)，圖蘭扇頭蜱(Rhipicephalushaemaphysaloides)10只(1.47%)。

2.2病原體檢測與鑒定 經(jīng)PCR檢測， 檢測陽性率按最小概率即每份陽性樣本中1只蜱陽性計算，銀盾革蜱中斑點熱群立克次體的陽性率為3.2%(10/311)，巴貝斯蟲的陽性率為1.0%(3/311)。亞東璃眼蜱中巴貝斯蟲的陽性率為0.8%(3/362)，泰勒蟲陽性率為0.3%(1/362)。圖蘭扇頭蜱中未檢測到陽性病原體。SFTSV、CCHFV、TBEV、貝氏立克次體、伯氏疏立克次體、恙蟲病東方體和查菲埃立克次體等檢測均為陰性，且所有蜱中均未檢測到兩種或兩種以上病原體(表2)。

2.3系統(tǒng)進化分析 通過同源性比對分析發(fā)現(xiàn)，所獲SFGR陽性樣本與多種已知SFGRompA基因序列同源，同源性高達93%～100%。 系統(tǒng)進化分析顯示本研究所獲10個樣本均位于進化樹勞氏立克次體R.raoultii分支上(圖1)。 巴貝斯蟲/泰勒蟲目的片段18SrDNA序列分別與環(huán)形泰勒蟲Theileriaannulata、駑巴貝斯蟲BabesiaCaballi、BabesiaOccultans等高度同源(圖2)。

表2 PCR檢測蜱樣本的SFG立克次體和巴貝斯蟲/泰勒蟲的陽性率
Tab.2 Total number of ticks (total number of pools) and the minimum field infection rate forSFGrickettsiaeandBabesia/Theileria

蜱種類總數(shù)(只)總數(shù)(份)斑點熱群立克次體陽性率(%)巴貝斯蟲陽性率(%)泰勒蟲陽性率 (%)銀盾革蜱31164103.231.000亞東璃眼蜱362920030.810.3圖蘭扇頭蜱102000000總計683158101.560.910.2

注：“■”代表本研究所檢測到的病原體樣本圖1 斑點熱群立克次體的OmpA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of the ompA gene sequence of Rickettsia

注：“■”數(shù)字代表本研究所檢測到的病原體樣本。圖2 巴貝斯蟲/泰勒蟲18S rDNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the 18SrDNA gene sequence of Babesia/ Theileria

3 討 論

新疆是我國蜱種多樣、蜱傳疾病高發(fā)地區(qū)之一，本研究中在新疆克拉瑪依市4個區(qū)共采集到銀盾革蜱、亞東璃眼蜱和圖蘭扇頭蜱等3種蜱，其中荒漠中的游離蜱主要是亞東璃眼蜱，在烏爾禾區(qū)養(yǎng)殖基地的牛、羊身體上除亞東璃眼蜱外，有數(shù)量較多的銀盾革蜱。銀盾革蜱成蟲主要寄生于牛、馬、羊、駱駝等大型哺乳動物，也侵襲人；幼蟲和若蟲多寄生于嚙齒類動物。2012 年田占成等報告伊犁新源縣采集主要蜱種為銀盾革蜱[4]。在我國已證實銀盾革蜱能夠傳播巴貝斯蟲病，從其體內(nèi)分離到萊姆病螺旋體、北亞斑點熱立克次體；亦有文獻記載其攜帶克里木-剛果出血熱病毒[5]。

巴貝斯蟲病是由巴貝斯蟲引起的一種蜱傳人獸共患寄生蟲病。自1982年起，我國已發(fā)現(xiàn)11種巴貝斯蟲，已有文獻報告分歧巴貝斯蟲、微小巴貝斯蟲和獵戶巴貝斯蟲引起人群感染[6]。目前，我國對巴貝斯蟲病疫源地分布范圍和流行規(guī)律、宿主動物和媒介蜱攜帶巴貝蟲的能力和傳播該病原體的生物學機制尚不完全清楚。弩巴貝斯蟲已在我國新疆、內(nèi)蒙古和甘肅省的森林革蜱和草原革蜱中檢出[7-8]，我們從亞東璃眼蜱和銀盾革蜱中檢出弩巴貝斯蟲尚屬國內(nèi)首次報道。

本次調(diào)查在烏爾禾區(qū)采集的銀盾革蜱中檢測到勞氏立克次體是一種新發(fā)現(xiàn)的SFGR，目前已從多個國家和地區(qū)革蜱屬中檢出。近幾年，從我國及周邊國家的革蜱屬中檢測到勞氏立克次體[9-10]。大多數(shù)立克次體感染的蜱是從狗、牛和植物中采集的，提示該地區(qū)存在蜱傳播給動物所有者、牧羊人和農(nóng)民的風險。本研究首次在新疆克拉瑪依地區(qū)的銀盾革蜱和亞東璃眼蜱中檢測到了勞氏立克次體和弩巴貝斯蟲，提示克拉瑪依市及周邊地區(qū)存在斑點熱、巴貝斯蟲病的自然疫源地，因此有必要加強對這些蜱傳疾病的防控。

利益沖突：無