黃銀燕，溫圓圓，劉 偉，程慶林，吳亦斐，賈慶軍，謝 立

猩紅熱(Scarlet Fever)是由能產(chǎn)生紅疹毒素的A群鏈球菌(Group A streptococcus isolates, GAS)即化膿鏈球菌(S.pyogenes)感染所引起的急性呼吸道傳染病，3～15歲兒童多發(fā)，在托幼機(jī)構(gòu)和中小學(xué)易引起聚集性發(fā)病，是我國(guó)法定的乙類傳染病之一。我國(guó)猩紅熱每年都有流行，尤其在2011年中國(guó)大陸發(fā)生了全國(guó)性的猩紅熱暴發(fā)流行，杭州市同樣受到波及，發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升。為探究杭州市兒童猩紅熱的病原學(xué)特征及分子分型，從病原學(xué)角度了解杭州市兒童猩紅熱發(fā)病率上升的原因，我們?cè)?016年4月至2018年6月期間采集杭州市兒童醫(yī)院報(bào)告的兒童猩紅熱病例及幼兒園健康幼兒的咽拭子標(biāo)本進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)菌株 實(shí)驗(yàn)菌株分離于杭州市兒童醫(yī)院采集的32例猩紅熱患者咽拭子以及杭州市某幼兒園健康兒童咽拭子標(biāo)本215份。

1.2實(shí)驗(yàn)材料 哥倫比亞血平板；5%牛血清的腦心浸液；A群鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒(膠體金法)[美艾利爾(上海)醫(yī)療器械銷售有限公司]； DNA裂解液； 苯酚氯仿抽提液；TaKaRa Ex Taq。

1.3鏈球菌的分離鑒定 化膿鏈球菌的分離培養(yǎng)依據(jù)WS 282-2008 《猩紅熱診斷標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行，挑取具有β溶血的可疑菌，分離后進(jìn)行革蘭氏染色，并使用A群鏈球菌抗原檢測(cè)試劑盒和16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。分離培養(yǎng)得到的α溶血菌株采用16S rRNA基因測(cè)序進(jìn)行鑒定。細(xì)菌基因組DNA抽提采用苯酚氯仿法，并以細(xì)菌基因DNA為模版PCR擴(kuò)增16S rRNA基因，產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.4化膿鏈球菌的emm基因分型 以細(xì)菌基因組DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增emm基因。引物參考美國(guó)CDC網(wǎng)站(http://www.cdc.gov/streplab/protocol-emm-type.html)。擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果分別在NCBI和CDC Home中與已知的emm序列進(jìn)行同源性比對(duì)，確定各菌株的emm型別。

1.5血鏈球菌S28毒力基因擴(kuò)增 參考病原菌毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)，選取化膿鏈球菌常見(jiàn)毒力基因emm、speB、smeZ、speC、speG、speK、ssa、mf/spd、mf2、mf3、mf4，每一個(gè)毒力基因取病原菌毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)中5株不同化膿鏈球菌的相應(yīng)序列(菌株親緣關(guān)系盡可能遠(yuǎn)，毒力基因?qū)?yīng)的鏈球菌少于5株的，取全部菌株)，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增，簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)采用Primer5。

參考病原菌毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)中與S28同種的S.sanguinisSK36的毒力基因，選取化膿鏈球菌和血鏈球菌 SK36共有的毒力基因lmb、tig、plr/gapA、psaA、fbp54，使用血鏈球菌 SK36的基因序列，設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物設(shè)計(jì)采用Primer5。

2 結(jié) 果

2.1鏈球菌的分離鑒定 從32例臨床診斷的猩紅熱患者咽拭子分離鏈球菌22株，其中化膿鏈球菌占31.82%(7/22)，其余菌均屬于緩癥鏈球菌群(Mitis group)[1]，在血平板上呈現(xiàn)α溶血，包括口腔鏈球菌(S.oralis)占27.27%(6/22)，唾液鏈球菌(S.salivarius)占22.73%(5/22)，血鏈球菌(S.sanguinis)占13.64%(3/22)，嵴鏈球菌(S.cristatus)占4.54%(1/22)。從杭州某幼兒園健康兒童215份咽拭子中共分離出可培養(yǎng)的鏈球菌36株，分屬9種不同的鏈球菌種類。其中化膿鏈球菌占11.11%(4/36)，其余菌都屬于緩癥鏈球菌群，包括唾液鏈球菌19.44%(7/36)占比最高，其次是嬰兒鏈球菌(S.infantis)與嵴鏈球菌各占13.89%(5/36)，緩癥鏈球菌(S.mitis)和口腔鏈球菌各占11.11%(4/36)，星座鏈球菌(S.constellatus)、血鏈球菌均占8.33%(3/36)以及1株(2.78%，1/36)假肺炎鏈球菌(S.pseudopneumoniae)，見(jiàn)圖1。

2.2化膿鏈球菌emm基因分析 從臨床猩紅熱患者分離的7株化膿鏈球菌中，共鑒定出3種emm基因型，其中emm1型4株，emm12型2株，另1株為emm22型。

2.3血鏈球菌S28毒力基因擴(kuò)增與分析 S28分離于臨床診斷的猩紅熱患者咽拭子，16S rRNA基因與血鏈球菌NCTC7863，血鏈球菌 NCTC11086、血鏈球菌 NCTC11085和血鏈球菌 SK36同源性均為99%。SK36是病原菌毒力基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/)中唯一有毒力基因數(shù)據(jù)信息的緩癥鏈球菌群，并且已全基因組測(cè)序，因此選用S28研究毒力基因。

從S28中，擴(kuò)增得到基因lmb(309aa)的氨基酸序列與血鏈球菌 SK353的黏附蛋白(WP_002897412.1)有97%的同源性，該蛋白為類TroA 超家族中的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)以及底物結(jié)合蛋白。擴(kuò)增得到基因tig(427aa)的氨基酸序列與血鏈球菌 SK1087的觸發(fā)因子(Trigger factor) (WP_002920187.1)有99%同源性，該蛋白為Trigger_N超家族蛋白。擴(kuò)增得到基因gapA(335aa)的氨基酸序列與血鏈球菌 SK36的甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(WP_002899102.1 )有100%的同源性。擴(kuò)增得到基因psaA(309aa)的氨基酸序列與血鏈球菌SK150的黏附素SsaB (Adhesin SsaB)有99%的同源性，該蛋白屬于ZnuA超家族蛋白。擴(kuò)增得到基因fbp54(549aa)的氨基酸序列與鏈球菌 CCH8-C6的纖連蛋白Fibronectin(WP_060976766.1)有99%的同源性，屬于FbpA超家族蛋白。

圖1 從猩紅熱病例分離的鏈球菌分布(左)，從健康兒童分離的鏈球菌分布(右)Fig.1 Distribution of Streptococcus species from scarlet fever (left), distribution of Streptococcus species from healthy children (right)

根據(jù)毒力基因emm、speB、smeZ、speC、speG、speK、ssa、mf/spd、mf3、mf4設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物均未擴(kuò)增到片段。根據(jù)毒力基因mf2設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增到一條300 bp左右的片段，與 SK36全基因組992975 到 993308區(qū)域同源性高達(dá)98%，用 SK36基因組36992975-993308兩端序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增得到完整的基因片段mf2(253aa)的氨基酸序列與血鏈球菌 SK340的鏈道酶(Streptodornase)同源性高達(dá)100%。

表1 S28中的毒力基因
Tab.1 Virulence genes in S28

基因氨基酸aa參考菌株氨基酸同源性/%潛在功能lmb309aa SK35397黏附蛋白tig427aa SK108799半胱氨酸蛋白酶的分泌和成熟中的必須蛋白gapA335aaSK36100黏附蛋白psaA309aa SK15099黏附蛋白fbp54549aa CCH8-C699纖連蛋白(黏附)mf2253aaSK340100鏈道酶(DNA酶)

3 討 論

本研究中，從猩紅熱患者咽拭子分離的化膿鏈球菌共7株，攜帶率為21.88%(7/32)，緩癥鏈球菌群攜帶率46.88%(15/32)。從健康幼兒咽拭子分離出化膿鏈球菌共4株，攜帶率為1.86%(4/215)，而緩癥鏈球菌群的攜帶率為14.88%(32/215)。有研究表明健康兒童的化膿鏈球菌攜帶率為3%～26%，平均攜帶率為12%，年齡越低，檢出率越低，其中5歲以下幼兒化膿鏈球菌平均攜帶率為3%～17%[2-3]。本研究中健康兒童化膿鏈球菌攜帶率略低，可能與攜帶緩癥鏈球菌群有關(guān)。

emm基因型主要是emm1型和emm12型，各占57.1%和28.6%。全世界主要的emm型別是emm1和emm12[4]，國(guó)內(nèi)北京、山東和上海的主要流行株也是emm12和emm1[5]。另一項(xiàng)針對(duì)國(guó)內(nèi)8個(gè)省市2009年至2016年分離的140株化膿鏈球菌的研究表明emm12占42.9%，emm1占30.7%[6]。雖然本研究樣本量不大，但研究結(jié)果符合我國(guó)由化膿鏈球菌引起的猩紅熱的分子流行特征。

由圖1可知從猩紅熱病例咽拭子分離到的鏈球菌68.18%(15/22)為緩癥鏈球菌群。近年來(lái)流行病學(xué)研究顯示越來(lái)越多的非A群溶血性鏈球菌在喉咽部發(fā)現(xiàn)[7]?？谇痪彴Y鏈球菌位置轉(zhuǎn)移后可致病[8]。緩癥鏈球菌群可以引起猩紅熱樣皮疹、心內(nèi)膜炎、新生兒腦膜炎、菌血癥[9]。從1990年冬至1998年春，江蘇省海安縣等地發(fā)生了178起由緩癥鏈球菌群所致的猩紅熱樣疾病流行，重癥者表現(xiàn)為中毒性休克綜合征(TSS)[10-11]，研究者還從其中一株緩癥鏈球菌(S.mitis)中分離到了34-kDa的新型致熱外毒素[11]。海安縣同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了多例由血鏈球菌引起的中毒性休克綜合征(TSS)，并且在病人血液中分離到了血鏈球菌[12-13]。在英國(guó)和泰國(guó)都曾報(bào)道由緩癥鏈球菌引起的猩紅熱樣毒素綜合癥[14-15]，在日本也曾報(bào)道由豬鏈球菌引起養(yǎng)豬農(nóng)民患猩紅熱樣毒素綜合征[16]。因此本研究中，15例分離到緩癥鏈球菌群的兒童猩紅熱病例，雖然在臨床上被診斷為猩紅熱，但與前面江蘇報(bào)道的病例一樣，是由緩癥鏈球菌群引起的猩紅熱樣疾病。除了江蘇海安對(duì)緩癥鏈球菌的研究以外，目前國(guó)際上對(duì)于緩癥鏈球菌群引起猩紅熱樣疾病分子機(jī)理的研究尚未報(bào)道。猩紅熱患者緩癥鏈球菌群攜帶率46.9%(15/32)，大于化膿鏈球菌的攜帶率21.8%(7/32)。因此，杭州市兒童猩紅熱發(fā)病率上升的原因是部分被診斷為猩紅熱的病例實(shí)際上是由緩癥鏈球菌群引起的猩紅熱樣病例，而非化膿鏈球菌引起的猩紅熱。

本研究從血鏈球菌S28中分離鑒定到了6個(gè)鏈球菌毒力基因?；騠bpA編碼纖連蛋白結(jié)合蛋白FbpA，起到黏附、轉(zhuǎn)移和分化的作用[17]，促進(jìn)化膿鏈球菌在宿主內(nèi)的傳播[18]。基因gapA編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶GAPDH，可以錨定在咽部細(xì)胞表面，破壞宿主組織細(xì)胞，還可通過(guò)抑制吞噬作用，幫助化膿鏈球菌逃逸免疫監(jiān)視[19]?；騦mb編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的金屬結(jié)合脂蛋白AdcAII，是一種黏附蛋白[20]，并與Zn(II)、Fe(III) 和Cu(II)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)[21]?；騊saA編碼金屬結(jié)合蛋白SsaB(saliva-binding protein)，是宿主表面黏附蛋白[22]。在肺炎鏈球菌中，蛋白PsaA不僅有助于肺炎鏈球菌在鼻咽部的定植，并具有免疫原性[23]?；騮ig編碼Trigger factor(TF)，是核糖體結(jié)合分子伴侶和肽酰-脯氨酰-順?lè)词疆悩?gòu)酶(PPIase)，在化膿鏈球菌的半胱氨酸蛋白酶的分泌和成熟過(guò)程中是必須的,半胱氨酸蛋白酶可增加細(xì)菌的侵襲性[24]。基因mf2編碼有絲分裂因子(Mitogenic factor)，是化膿鏈球菌的DNA酶[25]，即鏈道酶，能降解膿液中具有高度粘稠性的DNA，使膿液稀薄，促進(jìn)病菌擴(kuò)散，并且能致敏T細(xì)胞[26]。

國(guó)際上報(bào)道的血鏈球菌主要分離于健康人的口腔[27]和心內(nèi)膜炎患者[28]，除了國(guó)內(nèi)江蘇海安的報(bào)道，目前國(guó)際上尚無(wú)從猩紅熱病人咽拭子分離血鏈球菌的研究。本研究首次在分離于猩紅熱樣病人咽拭子的血鏈球菌S28中發(fā)現(xiàn)6個(gè)毒力基因，其中fbpA、gapA、lmb、psaA都是表達(dá)黏附因子的基因，有助于S28在咽部定植?；騧f2是化膿鏈球菌致病的關(guān)鍵基因，在全基因組測(cè)序的血鏈球菌 SK36中并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這個(gè)基因，本研究是第一次在分離于猩紅熱樣病人咽拭子的血鏈球菌中克隆到鏈道酶基因。血鏈球菌 SK36是牙齒表面的定植菌[29]，不引起化 膿，并不需要鏈道酶發(fā)揮作用。而S28在咽部定植并會(huì)引起化膿感染，鏈道酶可以促進(jìn)S28在膿液中擴(kuò)散或者致敏T細(xì)胞，因此，基因mf2可能在S28引起猩紅熱樣疾病中很關(guān)鍵。

利益沖突：無(wú)