蘭天艷，張永娥，郭鵬輝，郭小臘，陳軼霞，王明明，鄭亞?wèn)|

多房棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusmultilocularis)的幼蟲(chóng)寄生于動(dòng)物或人的肝臟和肺臟，可引起多房棘球蚴病，又稱泡型棘球蚴病(alveolar echinococcosis, AE)。AE主要流行于北半球高緯度地區(qū)及凍土地帶，遍及北美洲[1]、歐洲[2]和亞洲[3]。在我國(guó)，AE主要流行于北部、西北部和西南部的農(nóng)牧區(qū)[3-5]。截止2016年8月，全球報(bào)道的AE患者有1 076例(占棘球蚴病的5.78%)，而我國(guó)2012-2016年報(bào)道的有1 008例(占棘球蚴病的19.64%)[6-8]。雖然，AE患者數(shù)量明顯少于由細(xì)粒棘球蚴引起的囊型棘球蚴病(cystic echinococcosis, CE)患者的數(shù)量，但由于AE潛伏期長(zhǎng)，且常被誤診為肝癌或肝硬化，同時(shí)術(shù)后一年病死率顯著高于CE(CE病死率為0.70%，AE病死率為2.27%)[6]，因此AE對(duì)人體危害更為嚴(yán)重，故又被稱為“蟲(chóng)癌”[9]。

在棘球絳蟲(chóng)生活史中，需要兩種不同的哺乳動(dòng)物參與其中。臨床上發(fā)現(xiàn)，在不同的中間宿主中存在兩種類型的包囊，即一種是具有大量原頭蚴的可育包囊，其原頭蚴附著于生發(fā)層或游離于囊液中，另一種則是沒(méi)有或僅有少量原頭蚴的不育包囊。目前，對(duì)于包囊不育的研究尚處于初步階段，其分子機(jī)制仍未知。前期研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的不育囊中，含有一定水平的宿主IgG，生發(fā)層和原頭蚴的基因組DNA出現(xiàn)嚴(yán)重?fù)p傷，大量細(xì)胞出現(xiàn)凋亡[10-11]，推測(cè)基因組損傷或/和細(xì)胞凋亡最終引起包囊不育。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，與寄生在肝臟的包囊相比，多房棘球蚴在皮下寄生時(shí)包囊內(nèi)原頭蚴的數(shù)量明顯減少，個(gè)別原頭蚴發(fā)育異常，腔內(nèi)富含糖原的不規(guī)則的小泡明顯減少，提示皮下寄生不利于蟲(chóng)體發(fā)育，可引起包囊不育[12]。因此，我們以皮下寄生的多房棘球蚴為實(shí)驗(yàn)材料，探究早期不育包囊的蛋白組學(xué)特征，為深入研究棘球絳蟲(chóng)包囊不育的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1小鼠 BALB/c小鼠購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均為雄性，約4周齡。

1.2多房棘球蚴 在實(shí)驗(yàn)室，多房棘球蚴腹腔接種于長(zhǎng)爪沙鼠(Meriones unguicutatus)，進(jìn)行連續(xù)傳代保種。在無(wú)菌條件下，分離多房棘球蚴包囊，之后將包囊置銅網(wǎng)上研磨。利用自然沉降法，將研磨出的原頭蚴在預(yù)冷的PBS中自然沉降5次，每次10 min。取少量原頭蚴，用臺(tái)盼藍(lán)染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，并觀察原頭蚴的活力。

1.3主要試劑 過(guò)渡性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATP酶(transitional endoplasmic reticulum ATPase, VCP)、烯醇化酶(Enolase)由本實(shí)驗(yàn)室制備的兔源多克隆抗體，14-3-3的抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備的鼠源單克隆抗體，β-Actin的抗體購(gòu)自Abcam 公司，谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)的抗體購(gòu)自Sigma公司。HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG均購(gòu)自Seracare公司。牛血清白蛋白(BSA)、蛋白酶抑制劑、臺(tái)盼藍(lán)、Schiff試劑購(gòu)自Sigma公司。4×蛋白上樣緩沖液(含巰基還原劑)購(gòu)自索萊寶公司。ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購(gòu)自Invitrogen公司。蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒購(gòu)自碧云天公司。預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自賽默飛公司。

1.4蟲(chóng)體皮下接種及蛋白質(zhì)的制備 每只小鼠皮下多點(diǎn)注射約600只原頭蚴，并盡可能去除宿主組織。用PBS洗兩次后，再用濾紙吸干包囊表面殘留的液體并稱重。在液氮中研磨蟲(chóng)體，之后按每20 mg 25 mL的量加入含有1%蛋白酶抑制劑的PBS，4 ℃輕搖過(guò)夜。將混合液于4 ℃ 12 000 g離心10 min，收集上清。利用Bradford的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的濃度后，送蛋白質(zhì)樣品至華大基因進(jìn)行測(cè)序。

1.5測(cè)序分析 通過(guò)SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離，然后分別獲取膠片上不同位置的蛋白質(zhì)膠條，酶解后再抽提出肽段，再最后運(yùn)用LC-MS/MS質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定對(duì)應(yīng)肽段的質(zhì)譜圖。利用Mascot2.3.02軟件，結(jié)合多房棘球蚴蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genedb.org/)，鑒定所有蟲(chóng)體蛋白質(zhì)。最后，對(duì)所有鑒定的蛋白質(zhì)進(jìn)行功能和信號(hào)通路注釋，即Gene Ontology (http://www.geneontology.org/)和COG分析。

1.6Western blotting分析 將上述1.4中制備的蟲(chóng)體粗抗原(約80 μg)與4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液充分混合，煮沸8～10 min，之后利用12%的SDS-PAGE膠進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，條件如下：90 V恒壓條件下電泳30 min，之后轉(zhuǎn)換成120 V恒壓電泳60 min。在轉(zhuǎn)膜時(shí)，先將PVDF膜用無(wú)水乙醇浸泡3 min，再用蒸餾水洗滌數(shù)次。利用Bio-Rad轉(zhuǎn)膜儀進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，30 V恒壓，電轉(zhuǎn)1 h。將PVDF膜浸泡在2% BSA(用PBST配制)的PBS中，室溫封閉90 min。用PBST洗滌數(shù)次后，將膜與一抗(各種抗體均以1∶1000倍稀釋)4℃孵育過(guò)夜。次日，用PBST洗滌3次后，將膜與HRP標(biāo)記的二抗(均以1∶10 000倍稀釋)室溫孵育1 h，之后用PBST洗滌3次，每次10 min。曝光時(shí)，先加ECL化學(xué)發(fā)光顯色液，再與PVDF膜避光孵育2 min，最后利用X光膠片在暗室曝光。

1.7組織切片染色 將新鮮分離的包囊固定在4%的多聚甲醛溶液中，48 h后制備切片。按照如下方法進(jìn)行HE染色：首先利用二甲苯脫蠟，再將切片從高濃度到低濃度的乙醇中浸泡。用蒸餾水沖洗2 min后，蘇木素染色5～10 min。將染了色的切片浸在自來(lái)水中，沖洗去多余的染色液，約10 min。蒸餾水洗滌數(shù)次后，置切片于5%的乙酸溶液中分化2 s，自來(lái)水沖洗10 min，再用伊紅染色30 s。用低濃度到高濃度的乙醇脫水，二甲苯透明，最后用中性樹(shù)膠封片。

1.8糖原染色 首先利用二甲苯脫蠟，再將切片從高濃度到低濃度的乙醇浸泡。用蒸餾水沖洗2 min后，將切片放在高碘酸溶液中浸泡3 min。用自來(lái)水沖洗3 min后，Schiff試劑浸泡約15 min。用蒸餾水沖洗2 min后，蘇木素染色3 min。將染了色的切片浸在自來(lái)水中，沖洗去多余的染色液，約10 min。用低濃度到高濃度的乙醇中脫水，二甲苯透明，封片。

2 結(jié) 果

2.1小鼠感染及皮下寄生包囊的形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在感染的15只小鼠中，8只為陽(yáng)性，皮下均有一個(gè)或兩個(gè)明顯包囊，包囊如綠豆大小，呈微透明狀(圖1，箭頭所示)。在光學(xué)顯微鏡下，可見(jiàn)包囊中含有子囊，囊中僅有少數(shù)原頭蚴，且一些原頭蚴頭節(jié)上還帶有小鉤(圖2，箭頭所示)；囊壁糖原染色陽(yáng)性，呈粉紅色(圖2)。

圖1 多房棘球蚴在皮下寄生一個(gè)月時(shí)形成的包囊Fig.1 A subcutaneous cyst one month post infection of Echinococcus multilocularis

圖2 皮下寄生多房棘球蚴包囊的顯微鏡觀察Fig.2 Microscopic observation of subcutaneous hydatid cyst of Echinococcus multilocularis

2.2測(cè)序結(jié)果 測(cè)序共得到譜圖39 698張，通過(guò)鑒定，匹配的譜圖數(shù)量為1 019張，共鑒定522個(gè)肽段，對(duì)應(yīng)203種蛋白質(zhì)，其中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的相對(duì)豐度最高，其次為檸檬酸合酶(表1)。在豐度較高的前20種蛋白質(zhì)中，大部分為酶類，有11種，主要參與糖代謝過(guò)程(表1)。在這11種蛋白質(zhì)中，有7種參與糖代謝，其中有3種蛋白質(zhì)參與糖酵解過(guò)程，分別為烯醇化酶、果糖16二磷酸醛縮酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶，有2種參與糖原異生，分別為磷酸烯醇丙酮酸羧激酶和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶。而參與細(xì)胞過(guò)程和應(yīng)激過(guò)程的蛋白質(zhì)各有一種，分別為細(xì)絲蛋白和熱休克70 kDa蛋白4。

表1 豐度較高的前20種蛋白質(zhì)
Tab.1 Top 20 proteins abundant identified in hydatid cyst ofEchinococcusmultilocularis

蛋白質(zhì)蛋白大小/kDa獨(dú)特肽數(shù)獨(dú)特譜圖數(shù)序列號(hào)代謝過(guò)程磷酸烯醇丙酮酸羧激酶71 2261EmuJ_000292700.1檸檬酸合酶 511756EmuJ_001028500.1烯醇化酶 471126EmuJ_000514200.1胞質(zhì)蘋(píng)果酸脫氫酶 371017EmuJ_000417100.1果糖16二磷酸醛縮酶 40924EmuJ_000905600.1ATP合酶亞基β線粒體56 915EmuJ_000752000.1鳥(niǎo)氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 46 8 9EmuJ_001032200.1轉(zhuǎn)酮醇酶68 815EmuJ_000103100.1谷氨酸脫氫酶58711EmuJ_000589100.1磷酸葡萄糖異構(gòu)酶62714EmuJ_000626300.1熱休克蛋白6061715EmuJ_001190900.1蘋(píng)果酸脫氫酶36614EmuJ_001185000.1細(xì)胞過(guò)程細(xì)絲蛋白25710EmuJ_000859700.1刺激應(yīng)答過(guò)程熱休克70 kDa蛋白47169EmuJ_001085400.1其他過(guò)程推測(cè)的主要穹窿蛋白971724EmuJ_000142500.1NADP結(jié)合域蛋白4178EmuJ_000511900.1乙酰輔酶A水解酶轉(zhuǎn)移酶55710EmuJ_001087900.1基底膜特異性硫酸乙酰肝素8666EmuJ_000575900.1吞蛋白B12959EmuJ_000550800.1凝溶膠蛋白4257EmuJ_000882300.1

2.3蛋白質(zhì)功能注釋 在分子功能方面，所鑒定的203種蛋白質(zhì)中有107種蛋白質(zhì)具有催化活性，如轉(zhuǎn)酮醇酶、烯醇化酶等，有101種蛋白質(zhì)具有結(jié)合活性，而具有蛋白質(zhì)/核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性、電子載體活性及分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性等方面的蛋白質(zhì)則非常少。在生物學(xué)過(guò)程方面，包括細(xì)胞過(guò)程、代謝過(guò)程和單組織過(guò)程，分別有94、93和84種(圖3)，而參與免疫過(guò)程的蛋白質(zhì)則很少，僅有4種，分別為泛素核糖體蛋白L40、組蛋白H4樣(Priapulus caudatus)、細(xì)絲蛋白和26S蛋白酶調(diào)節(jié)亞基7。在細(xì)胞組成方面，參與組成細(xì)胞器、細(xì)胞的蛋白質(zhì)占絕大多數(shù)(260/462)，而參與組成膠原蛋白三聚體、突觸的蛋白則非常少。COG分析結(jié)果表明，參與翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶分子信號(hào)通路的蛋白質(zhì)最為富集，有29種之多(圖4)，例如蛋白酶體亞基α型7、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶、熱休克蛋白家族成員3等。參與能量合成與轉(zhuǎn)換的蛋白質(zhì)的豐度次之，分別有20種，而參與細(xì)胞移動(dòng)、原噬菌體和轉(zhuǎn)座子的蛋白質(zhì)僅1種，即肌聯(lián)蛋白(圖4)。

圖3 皮下寄生多房棘球蚴蛋白的GO功能注釋圖Fig.3 GO function annotation of subcutaneous parasitic Echinococcus multilocularis proteins

圖4 皮下寄生多房棘球蚴蛋白的COG注釋柱圖Fig.4 COG annotation of subcutaneous parasitic Echinococcus multilocularis proteins

2.4Western blotting鑒定 為了驗(yàn)證蛋白質(zhì)測(cè)序結(jié)果，選取VCP、Enolase、14-3-3、GST和β-actin等5種蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blotting。結(jié)果顯示，VCP、Enolase、14-3-3、β-actin在皮下包囊中均有不同程度的表達(dá)，但GST并不表達(dá)或表達(dá)水平非常低(圖5)。這與測(cè)序結(jié)果一致。

A：皮下寄生多房棘球蚴5種蛋白的Western blotting分析；M：分子量標(biāo)記圖5 皮下寄生多房棘球蚴總蛋白的SDS-PAGE Fig.5 (A) SDS-PAGE analysis; (B) Western blotting analysis

3 討 論

在臨床上，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)(Echinococcusgranulosus)和多房棘球絳蟲(chóng)均可形成不育包囊[13-14]。通常情況下，細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)感染羊時(shí)，會(huì)形成可育包囊，而在感染牛時(shí)則發(fā)育為不育包囊，并且不同地區(qū)的包囊發(fā)育狀況存在差異。對(duì)多房棘球絳蟲(chóng)來(lái)說(shuō)，通常感染人時(shí)會(huì)發(fā)育為不育包囊。本研究結(jié)果表明，在皮下寄生不利于多房棘球蚴發(fā)育，幾乎所有的包囊沒(méi)有或僅有少數(shù)原頭蚴，有向不育囊發(fā)育的趨勢(shì)。這與以前的研究結(jié)果相似[12]。

14-3-3蛋白是一種廣泛存在于真核生物中的多功能蛋白，參與調(diào)節(jié)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡、代謝等重要的生理活動(dòng)，被認(rèn)為是細(xì)胞分化和增殖過(guò)程中的關(guān)鍵分子。在多房棘球蚴，14-3-3蛋白的表達(dá)量是其成蟲(chóng)表達(dá)量的10倍以上[15]。已經(jīng)證明，多房棘球絳蟲(chóng)14-3-3蛋白可誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫保護(hù)，使小鼠免受原發(fā)性肺泡包蟲(chóng)病[16]。在我們的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)14-3-3在皮下寄生包囊中的表達(dá)量相對(duì)較高，推測(cè)它可能在蟲(chóng)體寄生、發(fā)育等過(guò)程起著重要作用。GST是一種普遍存在的多功能蛋白超家族，也是一種重要的解毒酶，參與細(xì)胞清除外源性和內(nèi)源性毒性物質(zhì)[17]。在蠕蟲(chóng)寄生過(guò)程中，宿主免疫反應(yīng)可產(chǎn)生一些毒性物質(zhì)以殺滅寄生蟲(chóng)。值得注意的是，在我們的結(jié)果中未檢測(cè)到GST表達(dá)。這表明皮下寄生的多房棘球蚴的抗氧化能力可能有所下降。有研究表明，Caspase-3和RAD9基因在細(xì)粒棘球絳蟲(chóng)的不育包囊中表達(dá)量明顯上升[11，18]，誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡大于其自身的修復(fù)能力，這可能是由于包囊中不表達(dá)或低水平表達(dá)GST等一些抗氧化分子，最終導(dǎo)致包囊不育。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)的種類很少，豐度也很低，這可能是由于皮下血管分布較少，使得到達(dá)感染部位的免疫細(xì)胞及相關(guān)免疫分子相對(duì)有限，引起的宿主抗蟲(chóng)體的免疫應(yīng)答較弱所致。同樣，這似乎也可以解釋為什么磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、檸檬酸合酶、烯醇化酶等參與糖代謝的關(guān)鍵酶種類眾多且豐度也較高，這是因?yàn)槠は录纳鷷r(shí)蟲(chóng)體可獲取的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限，而這些酶可以多種不同的途徑合成糖以滿足蟲(chóng)體的生長(zhǎng)、發(fā)育、遷移、繁殖等生命活動(dòng)[19-21]。

總之，本研究利用LC-MS / MS方法確定了皮下寄生1個(gè)月的包囊的蛋白質(zhì)組成，發(fā)現(xiàn)磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、胞質(zhì)蘋(píng)果酸脫氫酶、果糖16二磷酸醛縮酶等多種酶的表達(dá)水平較高；所鑒定的蛋白質(zhì)在功能上主要富集在翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和伴侶分子信號(hào)通路、能量合成與轉(zhuǎn)換以及碳水化合物運(yùn)輸與代謝方面，而參與免疫應(yīng)答、脂質(zhì)運(yùn)輸與代謝等方面的蛋白質(zhì)則較少。這些研究結(jié)果為深入研究棘球蚴包囊不育的機(jī)理提供了有價(jià)值的線索。

利益沖突：無(wú)