許曦锃，倪瑞敏，林立敏，鐘曉芳，傅 紅，2*，葉秀云，2

(1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108；2.福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350108)

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一類(lèi)可催化酯類(lèi)水解與合成等反應(yīng)的生物催化劑[1]，已被廣泛應(yīng)用于食品、飼料、化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域[2-4]。酯交換反應(yīng)將天然的、容易被人體吸收的TG型魚(yú)油，在脂肪酶的選擇性催化下，與人工合成的富含ω-3脂肪酸的乙酯型(EE)魚(yú)油，發(fā)生酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，得到ω-3脂肪酸含量更高的TG型魚(yú)油[5]。Yang Z等[6]研究了Novozyme 435在無(wú)溶劑體系中催化魚(yú)肝油與EE型魚(yú)油進(jìn)行酯交換的條件，在最優(yōu)條件下乙酯的轉(zhuǎn)化率達(dá)到92.4%；劉芳[7]通過(guò)用水解反應(yīng)得到的甘油酯與濃縮魚(yú)油乙酯在真空條件下通過(guò)脂肪酶催化酯交換合成甘油三酯，在最佳條件下EPA和DHA的總含量為49.6%，提高了27.3%。目前，市售的商品化脂肪酶大部分為最適反應(yīng)溫度50℃左右的中高溫脂肪酶，而最適溫度在0～30℃范圍內(nèi)的低溫脂肪酶的品種不多且其應(yīng)用有限[8-9]。魚(yú)油是富含ω-3多不飽和脂肪酸的重要功能性油脂，其中EPA和DHA具有提高嬰幼兒智力發(fā)育、預(yù)防老年人動(dòng)脈粥樣硬化和老年癡呆等功效[10-12]。但天然魚(yú)油中EPA和DHA的含量很低，并且魚(yú)油對(duì)熱加工條件極其敏感，因此，開(kāi)發(fā)和應(yīng)用低溫脂肪酶可在一定程度上保障魚(yú)油產(chǎn)品的氧化穩(wěn)定性、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和風(fēng)味等。

本研究利用一種來(lái)源于米根霉的低溫脂肪酶，在考察其水解、酯化及酯交換等各項(xiàng)催化性能的基礎(chǔ)上，研究它對(duì)甘油三酯型和乙酯型魚(yú)油酯交換反應(yīng)的影響，并進(jìn)一步研究酯交換反應(yīng)產(chǎn)物的氧化特性，旨在為低溫生物催化劑富集TG型魚(yú)油的ω-3脂肪酸含量，減少工業(yè)化能源消耗，并為研究提高魚(yú)油產(chǎn)品氧化穩(wěn)定性提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

TG型魚(yú)油(EPA：17.71%、DHA：11.68%)、EE型魚(yú)油(EPA：43.86%、DHA：34.06%)：福建高龍海洋生物工程有限公司；低溫脂肪酶粗酶液：福州大學(xué)海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研發(fā)；Novozyme 435脂肪酶(10 000 PLU/g)：諾維信公司；薄層層析硅膠G(分析純)：青島海洋化工有限公司；對(duì)硝基苯酚、對(duì)硝基苯酚棕櫚酸酯(分析純)：麥克林生化科技有限公司；正己酸、三油酸甘油酯、正辛酸等均為分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GC7890A氣相色譜儀、112-88A7HP-88毛細(xì)管色譜柱(100 m×250 μm×0.20 μm)：美國(guó)Agilent公司；AVANCE NEO 600全數(shù)字化核磁共振波譜儀：瑞士 Bruker 公司；HH-501超級(jí)恒溫水浴鍋、HJ-4A磁力攪拌器：上海方瑞儀器有限公司；CF16RX-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)：天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司。

1.3 脂肪酶活力的測(cè)定

低溫脂肪酶水解活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚法[13]；酯化活力測(cè)定采用滴定法[14]；酯交換活力測(cè)定采用氣相色譜法[15]。

1.4 脂肪酶催化魚(yú)油酯交換反應(yīng)

以TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油為反應(yīng)底物，添加適量脂肪酶(以底物質(zhì)量計(jì)%，W/W)于雙層燒杯中混勻反應(yīng)。加入乙醇和丙酮終止反應(yīng)，離心除酶，用薄層層析法分離出甘油三酯[16]，經(jīng)正己烷萃取后甲酯化[17]，利用氣相色譜儀測(cè)定TG型魚(yú)油中EPA和DHA含量。

脂肪酸組分的氣相色譜分析條件[18]：載氣為純氮?dú)?，流速? mL/min，氫氣為35 mL/min，空氣為350 mL/min；進(jìn)樣口溫度250℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器280℃。程序升溫：140℃保持5 min，以4℃/min程序升溫到220℃持續(xù)保持35 min。

1.4.1 脂肪酶添加量對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+ DHA)含量的影響

試驗(yàn)設(shè)置TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時(shí)間24 h，酶添加量分別為0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%。

1.4.2 底物質(zhì)量比對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+ DHA)含量的影響

試驗(yàn)設(shè)置反應(yīng)溫度30℃，加酶量為0.9%，反應(yīng)時(shí)間為24 h，TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油的質(zhì)量比分別為2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2。

1.4.3 反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+DHA)含量的影響

試驗(yàn)設(shè)置加酶量為0.9%，TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油質(zhì)量比為1∶1，反應(yīng)時(shí)間為24 h，反應(yīng)溫度分別為20、25、30、35、40℃。

1.4.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+DHA)含量的影響

試驗(yàn)設(shè)置TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油質(zhì)量比為1∶1，溫度為30℃，加酶量為0.9%，反應(yīng)時(shí)間分別為6、12、18、24、30、36 h。

1.5 魚(yú)油酯交換產(chǎn)物的氧化性質(zhì)研究

1.5.1 氧化指標(biāo)檢測(cè)

魚(yú)油酯交換產(chǎn)物的過(guò)氧化值(PV)檢測(cè)方法參照GB/T 5009.227—2016《食品中過(guò)氧化值的測(cè)定》[19]，茴香胺值(p-AV)檢測(cè)方法參照GB/T 5009.181—2016《動(dòng)植物油脂茴香胺值的測(cè)定》[20]。

1.5.2 核磁共振分析氧化產(chǎn)物的氫質(zhì)子化學(xué)位移

取100 μL魚(yú)油酯交換產(chǎn)物溶于600 μL氘代氯仿中，震蕩5 s后裝入直徑5 mm的核磁管中，平衡5 min后測(cè)量[21]。

1H-NMR譜采集參數(shù)[22]：以TMS為內(nèi)標(biāo)物，化學(xué)位移以ppm為單位，掃描次數(shù)32次，脈沖寬度90°，采集時(shí)間2.752 5 s，譜寬12 ppm，脈沖間隔1 s，脈沖序列zg30。

1.6 數(shù)據(jù)處理

利用Excel、Origin 9.5和MestReNova 6.1軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)脂肪酶活力及其熱穩(wěn)定性的影響

一般情況下，特定脂肪酶的水解、酯化和酯交換的酶活力并不相同，這是由其化學(xué)反應(yīng)的微觀差異導(dǎo)致的，傳統(tǒng)方法測(cè)定的脂肪酶酶活力通常指的是其水解活力，但因反應(yīng)體系是油與水的混合體系，因此其酶活力并不能代表酯化和酯交換的活力[23-24]。本研究在10～60℃范圍分別考察低溫脂肪酶的水解、酯化和酯交換的活力，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，此低溫脂肪酶的三種催化反應(yīng)的最適溫度都為30℃，在室溫范圍(25～35℃)內(nèi)具有的相對(duì)酶活力均在90%以上，表明它具有良好的低溫反應(yīng)活性，對(duì)生物催化某些熱敏性脂類(lèi)物質(zhì)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

對(duì)經(jīng)過(guò)10～60℃進(jìn)行1 h熱處理后的脂肪酶進(jìn)行催化反應(yīng)的殘余酶活力測(cè)定，試驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖2所示。結(jié)果表明，低溫脂肪酶在10～30℃的低溫環(huán)境下能維持良好的穩(wěn)定性，1 h熱處理的殘余酶活力在85%以上；而在40～50℃熱處理1 h后，殘余酶活力開(kāi)始迅速降低；經(jīng)60℃熱處理1 h的殘余酶活力不足20%，說(shuō)明此脂肪酶熱穩(wěn)定性較差。根據(jù)低溫脂肪酶的定義[25]，該脂肪酶屬于低溫脂肪酶范疇。

2.2 魚(yú)油酯交換反應(yīng)條件的確定

2.2.1 加酶量對(duì)魚(yú)油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+DHA)含量的影響

當(dāng)加酶量(以底物質(zhì)量計(jì)%，W/W)為0.3%～1.5%時(shí)，研究魚(yú)油酯交換產(chǎn)物TG中ω-3脂肪酸(EPA和DHA)的含量。從圖3可以看出，當(dāng)脂肪酶添加量為0.3%～0.9%時(shí)，產(chǎn)物TG中ω-3脂肪酸含量顯著增加；當(dāng)加酶量為0.9%～1.5%時(shí)，其增加趨勢(shì)趨于平緩。這可能是因?yàn)樵诩用噶窟^(guò)多時(shí)，粗酶液中的水分促進(jìn)了水解作用，抑制了酯交換反應(yīng)的進(jìn)行。因此研究選用0.9%低溫脂肪酶添加量。

2.2.2 底物質(zhì)量比對(duì)魚(yú)油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+DHA)含量的影響

TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油的質(zhì)量比(2∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶2)對(duì)魚(yú)油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+DHA)含量的影響結(jié)果如圖4所示。隨著EE型魚(yú)油比例的增加，(EPA+DHA)含量先增加后降低，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量比為1∶1時(shí)，ω-3脂肪酸含量達(dá)到最高。按照化學(xué)平衡的原理，這主要是因?yàn)閮煞N底物的酯交換反應(yīng)在1∶1的質(zhì)量比時(shí)達(dá)到化學(xué)平衡，能夠得到相對(duì)穩(wěn)定的高含量ω-3脂肪酸TG型產(chǎn)物。因此選取TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油質(zhì)量比為1∶1進(jìn)行后續(xù)研究。

2.2.3 溫度對(duì)魚(yú)油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+DHA)含量的影響

反應(yīng)溫度對(duì)魚(yú)油酯交換的影響如圖5所示，酯交換產(chǎn)物TG型魚(yú)油的ω-3脂肪酸含量在反應(yīng)溫度為30℃時(shí)達(dá)到最大，為41.14%，在反應(yīng)溫度25℃時(shí)為37.47%，分別比原料TG型魚(yú)油提高了11.75%和8.08%，可見(jiàn)此脂肪酶在室溫范圍內(nèi)能很好地催化魚(yú)油的酯交換反應(yīng)。當(dāng)反應(yīng)溫度繼續(xù)升高到35～40℃時(shí)，產(chǎn)物TG中ω-3脂肪酸含量降低至36%，這可能是40℃左右的中高溫就能破壞該酶的活性中心，產(chǎn)生不可逆變性結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致酶催化酯交換能力迅速下降。因此，該脂肪酶在低溫條件下能夠發(fā)揮其最大的酯交換催化活性，選取30℃的反應(yīng)溫度為宜。

2.2.4 時(shí)間對(duì)魚(yú)油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中(EPA+DHA)含量的影響

反應(yīng)時(shí)間6～36 h對(duì)魚(yú)油酯交換的影響，如圖6所示。在反應(yīng)時(shí)間為18 h時(shí)，酯交換產(chǎn)物TG型魚(yú)油的ω-3脂肪酸含量最大，達(dá)到44.83%，比原料TG型魚(yú)油提高了15.44%，表明液體脂肪酶與魚(yú)油底物接觸更充分，體系流動(dòng)性大，有利于加快反應(yīng)的進(jìn)行。所以，該低溫脂肪酶催化魚(yú)油酯交換的反應(yīng)時(shí)間以18 h為宜。

2.2.5 最優(yōu)反應(yīng)條件驗(yàn)證

試驗(yàn)設(shè)置低溫脂肪酶添加量為0.9%，TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油質(zhì)量比為1∶1，于30℃反應(yīng)18 h，重復(fù)3次，獲得最佳條件下魚(yú)油酯交換產(chǎn)物TG中EPA和DHA含量為(44.83±0.30)%。

2.3 魚(yú)油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物的氧化性質(zhì)比較

在產(chǎn)物TG型魚(yú)油ω-3脂肪酸含量基本相同的條件下，探究此低溫脂肪酶和中高溫脂肪酶Novozyme 435在不同溫度反應(yīng)下對(duì)魚(yú)油品質(zhì)帶來(lái)的影響，反應(yīng)條件和理化指標(biāo)如表1所示。脂肪酶Novozyme 435在50℃酯交換所得魚(yú)油產(chǎn)物氧化程度較大，過(guò)氧化值和茴香胺值分別是低溫脂肪酶30℃催化的產(chǎn)物的1.6倍和2.6倍，這是因?yàn)轸~(yú)油富含ω-3多不飽和脂肪酸，在50℃加熱時(shí)與空氣接觸更易發(fā)生熱氧化反應(yīng)，產(chǎn)生氫過(guò)氧化物以及引起人體有異常生理反應(yīng)的醛、酮等有害物質(zhì)，從而影響?hù)~(yú)油品質(zhì)[26]。因此，30℃的熱加工條件對(duì)魚(yú)油品質(zhì)的影響較小。

表1 魚(yú)油酯交換條件及所得產(chǎn)物的理化指標(biāo)

注：酯交換反應(yīng)的時(shí)間為18 h，底物質(zhì)量比為1∶1。

Note：The transesterification time was 18 h，and the substrate mass ratio was 1∶1.

利用高場(chǎng)核磁共振對(duì)魚(yú)油中氫質(zhì)子在不同環(huán)境下的化學(xué)位移進(jìn)行研究，可以進(jìn)一步反映魚(yú)油氧化的變化，結(jié)果如圖7所示。上述兩種不同氧化程度的魚(yú)油1H-NMR圖譜在0～5.5 ppm處均有10個(gè)吸收峰，譜峰A～G的歸屬和對(duì)應(yīng)的官能團(tuán)，與文獻(xiàn)報(bào)道[27]相符。低溫脂肪酶于30℃催化酯交換所得的魚(yú)油，在5.5～7.0 ppm與8.2～8.9 ppm處可見(jiàn)明顯的共軛二烯物[28]和氫過(guò)氧化物[29]信號(hào)峰，而Novozyme 435于50℃催化反應(yīng)所得的魚(yú)油在9.0～10.2 ppm之間有更顯著的醛類(lèi)[28]吸收峰，這可能是因?yàn)?0℃高溫下魚(yú)油的溶氧量增加，促進(jìn)了初級(jí)氧化產(chǎn)生的共軛二烯物和氫過(guò)氧化物進(jìn)一步降解形成次級(jí)氧化產(chǎn)物醛、酮等物質(zhì)，因此與30℃低溫相比，其熱氧化程度較大。這說(shuō)明了低溫脂肪酶和Novozyme 435脂肪酶催化魚(yú)油酯交換所得產(chǎn)物的氧化程度存在差異，低溫脂肪酶的溫度條件能較好地保障魚(yú)油品質(zhì)。

3 討論

目前，我國(guó)應(yīng)用的主要是進(jìn)口脂肪酶，如丹麥諾維信公司、日本天野公司出售的多種脂肪酶，這些大多是反應(yīng)溫度在50～60℃左右的中高溫脂肪酶，不僅在工業(yè)生產(chǎn)的使用中需加裝熱裝置，增加能源消耗和生產(chǎn)成本，也會(huì)導(dǎo)致魚(yú)油的酶法催化推廣因脂肪酶的反應(yīng)溫度而受限。而低溫脂肪酶在室溫范圍即可催化反應(yīng)，不僅節(jié)約能耗，而且不會(huì)對(duì)魚(yú)油品質(zhì)造成不良影響。

本試驗(yàn)對(duì)一種來(lái)源于米根霉的低溫脂肪酶進(jìn)行研究，其水解、酯化和酯交換的最適溫度均為30℃，在室溫范圍內(nèi)熱穩(wěn)定性均較好。在催化TG型魚(yú)油與EE型魚(yú)油酯交換反應(yīng)中，米根霉低溫脂肪酶的加酶量為0.9%，底物質(zhì)量比為1∶1，在30℃下反應(yīng)18 h，其酯交換反應(yīng)產(chǎn)物中EPA和DHA的總含量達(dá)到44.83%，較原料TG型魚(yú)油提高近16%。低溫脂肪酶進(jìn)行酶法酯交換反應(yīng)所需的溫度條件易達(dá)，而且所需附加的熱能低，因而其有望在綠色工業(yè)化生產(chǎn)中被加以利用，并突破魚(yú)油商品生產(chǎn)中溫度條件的瓶頸。

魚(yú)油酯交換反應(yīng)產(chǎn)物氧化性質(zhì)的研究表明，當(dāng)使用酯交換溫度為30℃的低溫脂肪酶時(shí)，魚(yú)油氧化情況良好，而使用反應(yīng)溫度為50℃的中高溫Novozyme 435脂肪酶時(shí)，魚(yú)油發(fā)生明顯的熱氧化，降低了魚(yú)油產(chǎn)品的質(zhì)量。因此，低溫脂肪酶對(duì)熱敏性脂類(lèi)氧化穩(wěn)定性的保護(hù)，具有中高溫脂肪酶不可比擬的優(yōu)勢(shì)，在催化魚(yú)油酯交換反應(yīng)制備高含量ω-3脂肪酸TG型魚(yú)油中具有良好的應(yīng)用潛力。

致謝：感謝“海洋生物酶工程創(chuàng)新服務(wù)平臺(tái)2014FJPT02”對(duì)本試驗(yàn)的支持。