佟雷 劉金麗 劉世娟

[摘要] 目的 通過逆相蒸發(fā)法制備抗結(jié)核藥物利奈唑胺脂質(zhì)體，并利用響應(yīng)面法優(yōu)化其制備工藝和處方組成。 方法 以包封率為主要指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，以Box-Behnken響應(yīng)面分析法優(yōu)化其制備工藝。并將最優(yōu)工藝下制得的利奈唑胺脂質(zhì)體于倒置熒光顯微鏡下觀察其形態(tài)。 結(jié)果 通過逆相蒸發(fā)法制備利奈唑胺脂質(zhì)體的包封率較高;最佳制備工藝：膽固醇-卵磷脂質(zhì)量比為1：2.45，緩沖液pH值為6.65，超聲時(shí)間為3.2 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速為50 r。 結(jié)論 逆相蒸發(fā)法的制備工藝簡單，重現(xiàn)性好，所得包封率高。

[關(guān)鍵詞] 利奈唑胺脂質(zhì)體;逆相蒸發(fā)法;包封率;Box-Behnken響應(yīng)面分析法

[Abstract] Objective To prepare antituberculous drug linezolid liposome using the reverse-phase evaporation method， and optimize its preparation process and prescription composition using the response surface method. Methods Single-factor experiment was performed with the entrapment rate as key indicators， and Box-Behnken response surface analysis was used to optimize the preparation process. The linezolid liposome prepared using the optimal preparation process was observed for morphology by inverted fluorescent microscope. Results It was found that the entrapment rate of linezolid liposome prepared using the reverse-phase evaporation method was relatively high; under the optimal preparation process， the mass ratio of cholesterol to lecithin was 1：2.45， the pH value of the buffer solution was 6.65， the ultrasonic time was 3.2 min， and the rotation speed of the rotary evaporator was 50 r. Conclusion The reverse-phase evaporation method has the advantages of simple preparation process， good reproducibility and high entrapment rate.

[Key words] Linezolid liposome; Reverse-phase evaporation method; Entrapment rate; Box-Behnken response surface analysis

結(jié)核病是危害性較高的一種疾病，隨著藥學(xué)的快速發(fā)展，多種抗結(jié)核藥物不斷被研發(fā)且在臨床上得到廣泛應(yīng)用。但抗結(jié)核藥物往往會(huì)產(chǎn)生毒副作用，因此如何減輕抗結(jié)核藥物的毒副作用成了新的研究熱點(diǎn)。利奈唑胺為人工合成的惡唑烷酮類抗菌藥，可抗多重耐藥，利奈唑胺為水溶性藥物，通常為片劑，患者口服后常會(huì)產(chǎn)生腹瀉、嘔吐等不良反應(yīng)，其被吸收入血后不易到達(dá)病灶而且血藥濃度超過一定濃度還會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用，因此如何將其有效成分安全高效地送至靶器官是一個(gè)極有意義的研究方向。脂質(zhì)體的靶向性、兩親性、緩釋性等特性使其成為一種理想的藥物載體，因此本實(shí)驗(yàn)欲通過制備利奈唑胺脂質(zhì)體來實(shí)現(xiàn)利奈唑胺的肺部直接給藥[1-3]。

1 材料與儀器

紫外分光光度計(jì)（UV-6000PC），鄭州寶京科技有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（QA-205B），濟(jì)寧瑞德儀器設(shè)備有限公司;LS13320型激光粒度分析儀（江蘇榮華儀器制造有限公司）;倒置熒光顯微鏡（U-LH100HG），OLYMPUS CORPORATION;利奈唑胺原料藥（P09572），上海泰坦科技有限公司;卵磷脂（20180122），陜西澄明科技有限公司;膽固醇（20180228），江蘇百得科技有限公司;磷脂膜熒光劑（20190310），SIGMAALDRICH。

2 方法與結(jié)果

2.1 最大吸收波長的選擇

50 mL容量瓶中加入1 mg利奈唑胺，以 pH值為6.5的緩沖液定容，得20 μg/mL藥物溶液，紫外分光光度法在200～400 nm范圍內(nèi)每隔10 nm測定吸光度，考察最大吸收波長并繪制曲線。移取空白脂質(zhì)體混懸液2 mL至50 mL容量瓶中，同法測定。最終確定利奈唑胺最大吸收波長為289 nm，空白脂質(zhì)體在此波長處無干擾。見圖1、2。

2.2 利奈唑胺的含量測定

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及方法學(xué)考察：10 mg利奈唑胺置50mL容量瓶中定容，得溶液濃度為200 μg/mL。移取0.125 mL、0.25 mL、0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL、3 mL置25 mL容量瓶中定容，以PBS溶液為空白對照，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線A=0.01C+0.0516，R2=0.9998。線性范圍為1～24 μg/mL，考察其精密度RSD為0.32%，平均回收率為99.7%，24 h內(nèi)穩(wěn)定性0.15%，均低于2%，符合制備要求。

2.3包封率的測定

（1）游離藥物量的測定：取利奈唑胺脂質(zhì)體混懸液置于離心管中，2500 r/min離心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，緩沖液定容，測定吸光度，然后計(jì)算游離藥物濃度。

（2）總藥量的測定：取等量的利奈唑胺脂質(zhì)體加入甲醇破乳，充分振搖后于2500 r/min下離心20 min，取上清液2 mL于25 mL容量瓶中，緩沖液定容，測定吸光度，然后計(jì)算總的藥物濃度[4-5]。

（3）計(jì)算包封率的公式：包封率=（C總-C游離）/C總×100%。

2.4 逆相蒸發(fā)法制備利奈唑胺脂質(zhì)體

精密稱取卵磷脂100 mg和膽固醇50 mg于50 mL燒杯中，加入二氯甲烷5 mL、95%乙醇5 mL、吐溫80 0.2 mL，在50℃恒溫水浴鍋上充分振搖使其完全溶解;10 mg利奈唑胺置50 mL燒杯中，加緩沖液5 mL使溶解;將兩溶液混合后超聲3～5 min，再于40℃下減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑并形成均勻薄膜，加入40 mL 緩沖液，使膜溶解即得利奈唑胺脂質(zhì)體[6-13]。

2.5 利奈唑胺脂質(zhì)體制備處方工藝的單因素考察及結(jié)果[14]

在固定其他因素不變的前提下，分別對卵磷脂-膽固醇質(zhì)量比、緩沖液pH、超聲時(shí)間、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速四個(gè)關(guān)鍵制備條件進(jìn)行單因素考察，選取包封率最大的因素作進(jìn)一步優(yōu)化，其結(jié)果顯示膽卵比（A）、緩沖液pH（B）、超聲時(shí)間（C）為對包封率影響較大因素，見圖3。

2.6 響應(yīng)面法篩選最佳處方組成[15]

以單因素考察結(jié)果上下浮動(dòng)設(shè)置三個(gè)梯度，通過Design Expert 8.0.6數(shù)據(jù)處理軟件設(shè)計(jì)出的17組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示，其中以利奈唑胺脂質(zhì)體的包封率（Y）為響應(yīng)值，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

2.6.1 顯著性實(shí)驗(yàn)結(jié)果? 根據(jù)2.6項(xiàng)中的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，得到了關(guān)于利奈唑胺脂質(zhì)體包封率（Y）和3個(gè)試驗(yàn)因素的回歸方程為：Y=78.79+3.72A+1.84B+0.75C+1.80AB-0.12AC+1.01BC-8.81A2-11.42B2-9.03C2。方程中各項(xiàng)系數(shù)的絕對值大小反映各因素對響應(yīng)值的影響程度，各項(xiàng)系數(shù)的正負(fù)反映各因素的影響方向，在本回歸方程中，三個(gè)一次項(xiàng)系數(shù)值：A>B>C，故各因素的影響順序?yàn)槟懧驯?緩沖液pH>超聲時(shí)間。

應(yīng)用SPSS19.0軟件對因變量與自變量進(jìn)行多重線性回歸分析，結(jié)果顯示模型的顯著水平P<0.0001，表明模型的顯著性高;其中失擬項(xiàng)>0.05，不顯著，說明模型與得到的實(shí)驗(yàn)值的差異小;而且R2=0.9684，R2Adj=0.9942，兩者數(shù)值較為接近，說明本次實(shí)驗(yàn)的真實(shí)值和預(yù)測值相差較小，故可以應(yīng)用本方程優(yōu)化利奈唑胺脂質(zhì)體的處方組成。見表2。

2.6.2響應(yīng)曲面分析結(jié)果? 在軟件中繪制相應(yīng)的響應(yīng)面和等高線圖，以此分析三個(gè)單因素兩兩之間的交互作用。兩個(gè)因素間相互作用程度的強(qiáng)弱皆可以通過響應(yīng)面的形狀及等高線的特征來反映。

由圖4可知，等高線呈橢圓形，說明A、B兩因素交互作用明顯，響應(yīng)曲面較為陡峭，跨度較大，說明利奈唑胺脂質(zhì)體的包封率受這兩個(gè)因素交互作用的影響較大。等高線與膽固醇-卵磷脂質(zhì)量比的軸線相交更為密集，表明膽固醇-卵磷脂質(zhì)量比對利奈唑胺脂質(zhì)體包封率的影響更大。

在圖5中，等高線圖為橢圓形，表明兩因素交互作用明顯，而且響應(yīng)曲面比較陡峭，表明利奈唑胺脂質(zhì)體包封率受這兩個(gè)因素交互作用的影響。等高線與膽固醇-卵磷脂質(zhì)量比的軸線相交更密集，說明利奈唑胺脂質(zhì)體的包封率受膽固醇-卵磷脂質(zhì)量比的影響更大。

由圖6可知，等高線的圖形為橢圓形，說明被考察因素之間交互作用明顯，由于等高線與緩沖液pH的軸線相交更為密集，說明緩沖液pH對利奈唑胺脂質(zhì)體包封率的影響較大。

最終系統(tǒng)給出最佳的處方組成為：膽固醇-卵磷脂質(zhì)量比為1：2.45，其中膽固醇為50 mg，卵磷脂為122.5 mg，PBS緩沖液的pH值為6.65，超聲時(shí)間為3.2 min，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀轉(zhuǎn)速為50 r。

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

以上述最佳處方組成及制備工藝制備三批平行樣本測定結(jié)果如表3所示，三批脂質(zhì)體的平均包封率為78.19%，且RSD值小于2%，說明采用逆相蒸發(fā)法制備脂質(zhì)體的可行度較高。

2.8 脂質(zhì)體的形態(tài)觀察結(jié)果

為觀察載藥脂質(zhì)體形貌，對載藥脂質(zhì)體進(jìn)行熒光染色（圖7），使用NBD-PE熒光染色劑染色后的利奈唑胺脂質(zhì)體呈現(xiàn)出黃綠色，如圖8。在倒置熒光顯微鏡可以觀察到利奈唑胺脂質(zhì)體的外觀為橢球形且較為圓整如封三圖8，平均粒徑范圍（610±26）nm，如圖9所示。

3 討論

3.1 脂質(zhì)體作為藥物載體的缺點(diǎn)

脂質(zhì)體膜為磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)，其膜具有流動(dòng)性，造成被包封藥物易于泄露，導(dǎo)致脂質(zhì)體載藥量下降，在混懸液pH值發(fā)生改變或溫度發(fā)生變化的特殊條件下，脂質(zhì)體容易產(chǎn)生聚集、融合現(xiàn)象，由于脂質(zhì)體的組成為磷脂類物質(zhì)，易發(fā)生氧化，因此在實(shí)際生產(chǎn)制備脂質(zhì)體的過程中應(yīng)加入適量抗氧化劑，保證脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。

3.2 膽固醇在脂質(zhì)體制備過程中的應(yīng)用

在制備脂質(zhì)體的過程中，膽固醇作為構(gòu)成脂質(zhì)體膜的重要組成，對于膜的流動(dòng)性起到重要的調(diào)節(jié)作用，因此加入膽固醇有利于提高脂質(zhì)體膜的穩(wěn)定性，降低藥物的泄露率。

3.3 Box-Behnken響應(yīng)面分析法的優(yōu)勢

Box-Behnken響應(yīng)面分析法是較為科學(xué)的分析方法，其通過對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行科學(xué)的數(shù)學(xué)建模并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行精確的統(tǒng)計(jì)分析，從而得出最佳方案，Box-Behnken 效應(yīng)面法可連續(xù)對試驗(yàn)各水平進(jìn)行分析，在反映各因素不同程度對制備工藝影響的同時(shí)，還直觀體現(xiàn)了因素間的交互作用，相對均勻設(shè)計(jì)與正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)具有實(shí)驗(yàn)精度高、預(yù)測性好的優(yōu)勢。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張朝輝，嚴(yán)晶晶.我國結(jié)核病現(xiàn)狀及其防治措施[J].海南醫(yī)學(xué)，2018，29（23）：3386-3389.

[2] 孫小璐，張?zhí)烊A，劉凱.藥物臨床研究與應(yīng)用利奈唑胺治療耐藥性肺結(jié)核病的臨床療效及安全性分析[J]. 中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2016，18（8）：800-801.

[3] 李佳，羅慧敏，范玉華，等.老年患者使用利奈唑胺的臨床評價(jià)及不良反應(yīng)監(jiān)測[J].中國新藥雜志，2017，26（11）：1322-1327.

[4] 呂曉燕，尹君婧，楊秀成，等.用于治療非小細(xì)胞肺癌的阿法替尼脂質(zhì)體的制備與包封率的測定[J].中國肺癌雜志，2018，21（9）：663-669.

[5] 王鳳玉，張保獻(xiàn)，張廣平，等.鹽酸常山堿的理化性質(zhì)及其脂質(zhì)體包封率的測定方法考察[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（1）：177-182.

[6] 祝俠麗，王莎莎，李玲華，等.基于近紅外光響應(yīng)性的鹽酸阿霉素納米脂質(zhì)體的制備工藝優(yōu)化[J].中國藥房，2019， 30（10）：1312-1315.

[7] Wang Hongwu，Cui Huantian，Lin Lan，et al.The effects of a hirudin/liposome complex on a diabetic nephropathy rat model[J].BMC Complementary and Alternative Medi-cine，2019，19（1）：118.

[8] 侯麗芬，谷克仁，吳永輝.不同制劑脂質(zhì)體制備方法的研究進(jìn)展[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016， 37（5）：118-124.

[9] 扈瑞瑞，申國明，高林，等.煙草綠原酸納米脂質(zhì)體的制備工藝及其穩(wěn)定性研究[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2017， 19（4）：128-137.

[10] 華雪蓮，張樹彪，肖義，等.新型陽離子脂質(zhì)體制備及應(yīng)用研究[J].化學(xué)研究與應(yīng)用，2019，31（2）：177-183.

[11] Sun Zhongqi，Deng Yun，Zhao Yanyun.Preparation，Optimization，and Characterization of Natural Apple Essence-Loaded Liposomes[J].Journal of Food Science，2019.

[12] Yamamoto E，Miyazaki S，Aoyama C，et al.A simple and rapid measurement method of encapsulation efficiency of doxorubicin loaded liposomes by direct injection of the liposomal suspension to liquid chromatography[J].Int J Pharm，2018，536（1）：21-28.

[13] Sheng ZJ，Xu WP，Xu TJ，et al.New developments in liposomal drug delivery systems[J].China Pharmaceuticals，2015，24（23）：6-9.

[14] 馬寧輝，路璐，丁越，等.鹽酸阿霉素和知母皂苷AⅢ共載脂質(zhì)體的制備及包封率的測定[J].中草藥，2019，50（1）：69-75.

[15] 高艷，鄭夢成，杜守穎，等.桂皮醛脂質(zhì)體制備工藝研究[J].天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，38（2）：180-185.

（收稿日期：2019-08-30）