謝 佳，曾春蘭，王 俊，趙 攀 (重慶兩江新區(qū)第一人民醫(yī)院普外科，重慶401121)

乳腺癌是一種在女性中常見的惡性腫瘤，隨著社會(huì)的快速發(fā)展，乳腺癌的發(fā)病率逐漸升高，且發(fā)病人群逐漸趨于年輕化，嚴(yán)重影響女性人群的生活質(zhì)量[1-3]。FOXM1屬于FOX基因家族中的一員，參與多種惡性腫瘤的發(fā)生，在腫瘤患者中呈高表達(dá)狀態(tài)[4]。有研究表明，F(xiàn)OXM1在乳腺癌、胃癌、前列腺癌等惡性腫瘤中的表達(dá)均高于正常人[4]。臨床上乳腺癌常采用化學(xué)治療，其中赫賽汀為常用一線藥物，但目前對于赫賽汀具體的使用劑量無明確的定論，不同研究使用的劑量也有所不同[5-7]。本研究通過調(diào)控FOXM1基因，探究其對乳腺癌BT474細(xì)胞赫賽汀藥物敏感性的影響，以期為乳腺癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

乳腺癌BT474細(xì)胞購自上海澤業(yè)生物科技有限公司。主要試劑：赫賽汀，購自Genentech 羅氏子公司基因泰克(國藥準(zhǔn)字J20110020)；兔抗大鼠FOXM1抗體購自Proteintech中國公司，小鼠抗大鼠PI3K、p-PI3K抗體、兔抗人AKT、p-AKT抗體均購自上海陶素生化科技有限公司，MTT試劑盒、Transwell試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司；PBS緩沖液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的乳腺癌BT474細(xì)胞取出后，快速采用40 ℃的溫度火浴，迅速搖晃均勻至融化，加入2 mL的完全培養(yǎng)基(10%PBS，10%～15%的56 mL胎牛血清，1%的5.56 mL青鏈霉素，500 mL RPMI1640培養(yǎng)基)，1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，使用完全培養(yǎng)基重懸，傳代至培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)體系為5 mL，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(飽和濕度95%、溫度37 ℃、CO2濃度5%)，第2天換液，當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 轉(zhuǎn)染及分組 構(gòu)建FOXM1過表達(dá)、FOXM1-shRNA質(zhì)粒，取對數(shù)的生長期乳腺癌BT474細(xì)胞，每孔中大約20×104個(gè)BT474細(xì)胞，接種于6孔板中，對其進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后，按照轉(zhuǎn)染試劑說明書將100 nmol/L FOXM1、100 nmol/L FOXM1-siRNA及RPMI1640培養(yǎng)液3組中均加入BT474細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，提取細(xì)胞蛋白。按轉(zhuǎn)染物的不同，將細(xì)胞分為上調(diào)FOXM1基因組(轉(zhuǎn)染FOXM1)、下調(diào)FOXM1基因(轉(zhuǎn)染FOXM1-siRNA)和對照組(加入等體積空載體質(zhì)粒)。

1.2.3 Western blot檢測FOXM1蛋白的表達(dá) 將采集到的細(xì)胞，使用PBS緩沖液清洗3遍以上，分離緩沖液，加入IP細(xì)胞裂解液，裂解處理35 min，之后提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度。每孔加入20 μg蛋白，通過10%的SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，加入適量濃縮的SDS-PAGE蛋白緩沖液100 V恒壓，電泳120 min，350 mA恒流，電轉(zhuǎn)90 min，之后再將電轉(zhuǎn)膜浸泡在10%的牛奶中，37 ℃環(huán)境下的搖床上封閉1.5 h；與一抗結(jié)合，加入TBST按1∶1 000稀釋FOXM1和β-actin一抗，在4 ℃的環(huán)境下孵育過夜保存；24 h后用TBST緩沖液清洗，與二抗結(jié)合在室溫下孵育1 h，再次用TBST緩沖液反復(fù)清洗。最后加入顯影劑將其浸在底物溶液中進(jìn)行顯色，嚴(yán)格按照顯影定影試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.4 不同濃度赫賽汀藥物干預(yù) 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞按照每孔2.0×104(100 μL)，接種于96孔板中，培養(yǎng)細(xì)胞過夜后，基于前期預(yù)實(shí)驗(yàn)的趨勢各加入1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L低、中、高濃度的赫賽汀，置于恒溫37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸取各孔內(nèi)的培養(yǎng)液，對照組使用0.1%的DMSO完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，上調(diào)FOXM1基因組、下調(diào)FOXM1基因組分別使用不同濃度的赫賽汀進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.5 MTT法檢測不同濃度赫賽汀對BT474細(xì)胞增殖能力的影響 待所有細(xì)胞組培養(yǎng)到相應(yīng)的時(shí)間后，在每孔中加入MTT 20 μL繼續(xù)孵育4 h，將上清液仔細(xì)吸取，然后在孔中加入150 μL的DMSO，振蕩10 s，采用酶標(biāo)儀測定波長為570 mm的細(xì)胞組OD值，按照腫瘤細(xì)胞增殖率計(jì)算公式，增殖率=(細(xì)胞組OD值/參照值-1)×100%，計(jì)算BT474細(xì)胞的增殖率。

1.2.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將乳腺癌BT474細(xì)胞接種到18孔板中，待細(xì)胞增長到90%時(shí)，使用100 μL的槍頭,垂直劃出3條直線。之后經(jīng)過PBS緩沖液清洗2～3次，分別加入0.5%的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后使用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞的遷移變化。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度赫賽汀藥物下BT474細(xì)胞的侵襲能力 將處于對數(shù)生長期的BT474細(xì)胞取出，調(diào)整細(xì)胞密度為3×105/mL，并使用濃度為1%的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將100 μL的細(xì)胞懸液加入每個(gè)小室中。在培養(yǎng)板上放入Transwell小室，加入無血清培養(yǎng)基，靜置30 min后使基質(zhì)膠再水化。向Transwell小室中加入細(xì)胞懸液，混合血清培養(yǎng)基在飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)24 h，之后進(jìn)行染色處理，將其取出用PBS緩沖液漂洗，使用多聚甲醛將其固定后采用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行染色，每組均染色15 min，最后用PBS漂洗3次。使用顯微鏡對隨機(jī)選取的5個(gè)小孔視野拍照，每組進(jìn)行3次細(xì)胞數(shù)目統(tǒng)計(jì)。

1.2.8 適宜赫賽汀濃度下PI3K/AKT信號通路蛋白檢測 使用Western blot對PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白進(jìn)行檢測，方法同1.2.3。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下BT474細(xì)胞轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)和FOXM1-siRNA效果

BT474細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染FOXM1過表達(dá)和FOXM1-siRNA的熒光質(zhì)粒以及空載熒光質(zhì)粒。顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率達(dá)到60%以上(圖1)。

圖1 熒光顯微鏡下BT474細(xì)胞與BT474細(xì)胞成功轉(zhuǎn)染FOXM1及FOXM1-siRNA圖(×200)

2.2 干預(yù)FOXM1基因后FOXM1蛋白相對表達(dá)量比較

上調(diào)FOXM1基因組中FOXM1蛋白的相對表達(dá)量明顯增高，是對照組的1.5倍，而下調(diào)FOXM1基因組中FOXM1蛋白的相對表達(dá)量明顯減少，是對照組的30%，與對照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

*：與對照組比較，P<0.05

圖2 對照組、上調(diào)FOXM1基因組和下調(diào)FOXM1基因組FOXM1蛋白相對表達(dá)量比較

2.3 不同濃度赫賽汀對BT474細(xì)胞增殖能力的影響

上調(diào)FOXM1基因組BT474細(xì)胞的增殖率顯著高于對照組，且隨著赫賽汀濃度的增加增殖率逐漸增加，上調(diào)FOXM1基因可增強(qiáng)BT474細(xì)胞對赫賽汀的耐藥性，促進(jìn)增殖(圖3)。下調(diào)FOXM1基因組BT474細(xì)胞的增殖率顯著低于對照組，低濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的增殖能力的抑制程度較弱，高濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的增殖能力的抑制過度，而中濃度的赫賽汀增殖抑制能力介于低、高濃度之間，能夠有效地抑制BT474細(xì)胞增殖，但無抑制過度的表現(xiàn)。不同赫賽汀濃度下，下調(diào)FOXM1基因組細(xì)胞的增殖率顯著低于上調(diào)FOXM1基因組。

圖3 不同濃度赫賽汀藥物下BT474細(xì)胞的增殖能力比較

2.4 不同濃度赫賽汀藥物下BT474細(xì)胞的遷移能力比較

上調(diào)FOXM1基因組BT474細(xì)胞的遷移數(shù)量顯著多于對照組，且隨著赫賽汀濃度的增加遷移數(shù)量逐漸增加，上調(diào)FOXM1基因可增強(qiáng)BT474細(xì)胞對赫賽汀的耐藥性，促進(jìn)遷移(圖4)。下調(diào)FOXM1基因組BT474細(xì)胞的遷移數(shù)量顯著少于對照組，低濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的遷移能力的抑制程度較弱，高濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的遷移能力的抑制過度，而中濃度的赫賽汀對細(xì)胞遷移的影響介于低、高濃度之間，能夠有效地抑制BT474細(xì)胞遷移，無抑制過度的表現(xiàn)。不同赫賽汀濃度下，下調(diào)FOXM1基因組細(xì)胞的遷移數(shù)量顯著低于上調(diào)FOXM1基因組。

圖4 不同濃度赫賽汀藥物下BT474細(xì)胞的遷移能力比較

2.5 不同濃度赫賽汀藥物下BT474細(xì)胞的侵襲能力比較

上調(diào)FOXM1基因組BT474細(xì)胞的侵襲數(shù)量顯著多于對照組，且隨著赫賽汀濃度的增加侵襲數(shù)量逐漸增加，上調(diào)FOXM1基因可增強(qiáng)BT474細(xì)胞對赫賽汀的耐藥性，促進(jìn)侵襲(圖5)。下調(diào)FOXM1基因組BT474細(xì)胞的侵襲數(shù)量顯著少于對照組，低濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的侵襲能力的抑制程度較弱，高濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的侵襲能力的抑制過度，而中濃度的赫賽汀對細(xì)胞侵襲能力介于低、高濃度之間，能夠有效地抑制BT474細(xì)胞侵襲，無抑制過度的表現(xiàn)。不同赫賽汀濃度下下調(diào)FOXM1基因組細(xì)胞的侵襲數(shù)量顯著少于上調(diào)FOXM1基因組。

圖5 不同濃度赫賽汀藥物下BT474細(xì)胞的侵襲能力比較

2.6 適宜赫賽汀濃度下3組PI3K/AKT信號通路蛋白相對表達(dá)量比較

基于上述研究結(jié)果，低濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的抑制程度較弱，高濃度的赫賽汀對BT474細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的抑制過度，而中濃度的赫賽汀的抑制能力介于低、高濃度之間，能夠有效地抑制BT474細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，無抑制過度的表現(xiàn)。因此，使用5 μmol/L赫賽汀抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲為適宜濃度，既能抑制但又無抑制過度的表現(xiàn)。因此在5 μmol/L赫賽汀濃度下檢測3組PI3K/AKT信號通路蛋白相對表達(dá)量。下調(diào)FOXM1基因組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白相對表達(dá)量均低于對照組和上調(diào)FOXM1基因組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

*：與對照組比較P<0.05

圖6 適宜赫賽汀濃度下3組PI3K/AKT信號通路蛋白相對表達(dá)量比較

3 討論

FOXM1在乳腺癌患者中呈現(xiàn)出異常表達(dá)，參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，可能是乳腺癌分子治療的新靶點(diǎn)[8-9]。赫賽汀作為靶向治療乳腺癌的藥物之一，其應(yīng)用劑量暫無明確的規(guī)定，不同濃度的赫賽汀對乳腺癌細(xì)胞的影響不同[10-12]。本研究通過調(diào)控FOXM1基因，建立上調(diào)基因組和下調(diào)基因組，對比研究上調(diào)和下調(diào)FOXM1基因，在赫賽汀的不同濃度下對乳腺癌BT474細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響。

本研究選取乳腺癌BT474細(xì)胞作為研究對象，分別轉(zhuǎn)染FOXM1和FOXM1-siRNA，分為上調(diào)FOXM1基因組和下調(diào)FOXM1基因組，并設(shè)置正常乳腺癌BT474細(xì)胞對照組，運(yùn)用不同濃度的赫賽汀進(jìn)行干預(yù)，探究調(diào)控FOXM1基因?qū)θ橄侔〣T474細(xì)胞赫賽汀藥物敏感性的作用。有研究表明，F(xiàn)OXM1蛋白在乳腺癌患者中的表達(dá)顯著高于健康人群[13-14]。本研究建立上調(diào)FOXM1基因組和下調(diào)FOXM1基因組后，對其FOXM1蛋白水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，與對照組相比，上調(diào)FOXM1基因組細(xì)胞FOXM1蛋白的水平顯著升高，下調(diào)FOXM1基因組FOXM1蛋白水平顯著降低，說明下調(diào)FOXM1基因可有效抑制FOXM1蛋白的表達(dá)，與臨床上多項(xiàng)研究中，調(diào)控FOXM1基因可對FOXM1蛋白的高表達(dá)進(jìn)行抑制的研究一致[15-16]。有多項(xiàng)研究表明，對乳腺癌患者使用不同濃度的赫賽汀進(jìn)行干預(yù)治療，患者效果不一，臨床對于赫賽汀的使用劑量尚無統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[17-19]。本研究中，設(shè)置1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L 3個(gè)濃度，分別對上調(diào)FOXM1基因組、下調(diào)FOXM1基因組進(jìn)行干預(yù)，探討其對不同濃度下乳腺癌細(xì)胞增殖率的影響。結(jié)果顯示，不同濃度下下調(diào)FOXM1基因組的細(xì)胞增殖率均低于對照組及上調(diào)FOXM1基因組。有研究對FOXM1基因進(jìn)下調(diào)，檢測下調(diào)FOXM1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示，下調(diào)FOXM1基因能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制乳腺癌的惡化，起到抵抗癌細(xì)胞增殖的作用，本研究中下調(diào)FOXM1基因能夠抑制乳腺癌BT474細(xì)胞增殖的研究結(jié)果與之一致[20-21]。另外本研究對不同濃度赫賽汀下3組細(xì)胞遷移、侵襲能力進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，下調(diào)FOXM1基因組在不同濃度赫賽汀作用下乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力均低于上調(diào)FOXM1基因組和對照組，與臨床上多項(xiàng)研究中，通過調(diào)控FOXM1基因能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的研究結(jié)果一致[22-23]。

本研究使用不同濃度的赫賽汀對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)干預(yù)，結(jié)果顯示，低濃度的赫賽汀對乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力的抑制程度較弱，高濃度的赫賽汀對乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力出現(xiàn)抑制過度，而中濃度抑制作用介于低、高濃度之間，能夠有效地抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲，無抑制過度的表現(xiàn)。說明使用5 μmol/L赫賽汀抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲為適宜濃度，既能抑制又無抑制過度的表現(xiàn)。有研究表明，使用不同濃度的赫賽汀對乳腺癌患者進(jìn)行治療，其適宜濃度能夠有效抑制乳腺癌的惡化，治療效果較為理想，本研究結(jié)果與之一致[24-26]。研究表明，PI3K/AKT信號通路參與乳腺癌的發(fā)展，與乳腺癌細(xì)胞的遷移、侵襲有明顯的相關(guān)性[27-29]。乳腺癌患者中PI3K/AKT信號通路蛋白PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT表達(dá)水平顯著升高[30-33]。本研究采用5 μmol/L赫賽汀干預(yù)乳腺癌BT474細(xì)胞，并對PI3K/AKT信號通路蛋白進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，下調(diào)FOXM1基因組PI3K/AKT信號通路中PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT的表達(dá)水平均顯著低于上調(diào)FOXM1基因組及對照組，說明下調(diào)FOXM1基因組在適宜赫賽汀濃度下能夠有效調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路，從降低PI3K/AKT信號通路蛋白水平，達(dá)到抑制乳腺癌發(fā)展的目的。

綜上所述，上調(diào)FOXM1基因可增強(qiáng)乳腺癌BT474細(xì)胞對赫賽汀的耐藥性，下調(diào)FOXM1基因在5 μmol/L赫賽汀的干預(yù)下，可通過作用于PI3K/AKT信號通路，抑制乳腺癌BT474細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，從而抑制乳腺癌的發(fā)展。