李濤，王玉△，陳偉，夏春輝，倫志強(qiáng)

由于酞菁類配合物在紅光照射下產(chǎn)生的.O2自由基與.OH具有很高的化學(xué)活性，能與腫瘤細(xì)胞內(nèi)的有機(jī)物進(jìn)行強(qiáng)氧化反應(yīng)，殺死癌細(xì)胞，因此酞菁類配合物成為具有潛在前景的新一代抗腫瘤光敏劑［1-2］。線粒體凋亡途徑是光敏劑治療的主要作用途徑，與光敏劑的光動(dòng)力治療（PDT）原理密切相關(guān)，具有中心樞紐和放大作用，因此線粒體的調(diào)節(jié)作用在腫瘤的治療中具有重要作用。線粒體作為細(xì)胞供能的主要場(chǎng)所，發(fā)生損傷時(shí)會(huì)釋放活性氧（Reactive oxygen species，ROS）等有毒化學(xué)物質(zhì)到細(xì)胞質(zhì)中，從而引起細(xì)胞凋亡、自噬的發(fā)生［3-4］。P38MAPK是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)系統(tǒng)之一，參與多種刺激引起的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，與ROS氧化應(yīng)激損傷密切相關(guān)［5-7］。

本課題組已初步證明四-α-（對(duì)羧基苯氧基）酞菁鋅（TαPcZn）光敏劑在大腸癌Lovo細(xì)胞中具有良好的富集能力，并且能明顯抑制Lovo細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［7］，但TαPcZn-PDT誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞線粒體凋亡過(guò)程中各級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的具體環(huán)節(jié)和作用機(jī)制尚未清楚。鑒于前期的研究結(jié)果顯示P38MAPK參與了TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡的作用［8］，因此本實(shí)驗(yàn)以P38MAPK基因?yàn)榘心繕?biāo)，探討P38MAPK在ROS損傷中的作用，為今后光敏劑的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 DMEM培養(yǎng)基、opti-MEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher scientific公司，Silencer select Negative siRNA、Silencer select P38MAPK siRNA購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher Scientific公司，胰蛋白酶購(gòu)自德國(guó)Sigma公司，JC-1和Hoechst33342購(gòu)自美國(guó)Genmed Scientifics公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，抗P38MAPK抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，Lovo細(xì)胞購(gòu)自中科院動(dòng)物研究所。MuseTM細(xì)胞分析儀購(gòu)自美國(guó)默克密理博公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（5×105個(gè)/L）接種于培養(yǎng)瓶中，分成5組：對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNAP38MAPK 轉(zhuǎn)染組、TαPcZn-PDT組、TαPcZn-PDT/siRNAP38MAPK組。細(xì)胞在經(jīng)不同因素處理后進(jìn)行紅光照射，紅光的波長(zhǎng)范圍為600～700 nm，光動(dòng)力為53.7 J/cm2。紅光照射結(jié)束后，細(xì)胞孵育3 h，然后進(jìn)行各項(xiàng)檢測(cè)。

對(duì)照組：紅光照射10 min。siRNA-陰性對(duì)照組：在Lovo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-陰性對(duì)照（12.5 nmol/L）48 h后紅光照射10 min。siRNA-P38MAPK（正向5'-GAAGCUCUCCAGACCAUUUtt-3'，反向5'-AAAUGGUCUGGAGAGCUUCtt-3'）轉(zhuǎn)染組：在Lovo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-P38MAPK（12.5 nmol/L）48 h后紅光照射10 min。TαPcZn-PDT組：在Lovo細(xì)胞中添加TαPcZn（54μmol/L）2 h后紅光照射10 min。TαPcZn-PDT/siRNA-P38MAPK組：在Lovo細(xì)胞中轉(zhuǎn)染siRNA-P38MAPK（12.5 nmol/L）48 h后添加TαPcZn（54μmol/L），2 h后紅光照射10 min。

1.2.2 RT-PCR檢測(cè)siRNA沉默后P38MAPK、GAPDH mRNA表達(dá)情況 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lovo細(xì)胞，將密度為5×105個(gè)/L細(xì)胞加入到培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后棄去上清,以脂質(zhì)體包裹的siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。設(shè)對(duì)照組、siRNA陰性對(duì)照組、siRNA-GAPDH陽(yáng)性對(duì)照組、siRNAP38MAPK組，分別于轉(zhuǎn)染48 h后紅光照射10 min，繼續(xù)培養(yǎng)3 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件：94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)；另加72℃延伸10 min。GAPDH引物：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'。P38MAPK引物：上游 5'-GACAATCTGGGAGGTGCC-3'，下游 5'-GACCCAGTCCAAAATCCA-3'。PCR產(chǎn)物進(jìn)行15 g/L瓊脂糖電泳，凝膠成像圖像分析系統(tǒng)采集圖像（BIORAD公司）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 免疫印跡檢測(cè)siRNA沉默后P38MAPK、GAPDH表達(dá)情況 處理結(jié)束后收集細(xì)胞，提取總蛋白［13］，檢測(cè)P38MAPK及GAPDH。收集細(xì)胞后，加入適量的細(xì)胞裂解液150μL，超聲粉碎，4℃12 000×g離心1 h。用Lowry法測(cè)定蛋白濃度，30μg總蛋白/孔上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，分別孵育于一抗P38MAPK（1∶1 000）抗體及及GAPDH（1∶400），4 ℃過(guò)夜，用TBST漂洗5 min×3次，加1∶5 000的辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗，室溫孵育1 h，用TBS漂洗5 min×2次，TBST漂洗10 min×1次，ECL發(fā)光。凝膠成像圖像分析系統(tǒng)采集圖像（中國(guó)，上海天能公司Tanon 5200 Multi）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 線粒體膜電位（Mitochondrial membrane potential，ΔΨm）的檢測(cè) 培養(yǎng)于6孔板中的各組Lovo細(xì)胞，PBS洗2次,加入 1 mL 培養(yǎng)基，然后加入 1 mL JC-1（5,5’,6,6’-tetrachloro-1,1,3,3’-tetraethyl benzimidazolylcarbocyanine iodide,JC-1）染色工作液和7-氨基放線菌素（7-aminoactinomycin D，7-AAD）染液，充分混勻。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min結(jié)束后，吸除上清，用冰浴的JC-1染色緩沖液洗滌2次，經(jīng)細(xì)胞分析儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 細(xì)胞活性氧ROS檢測(cè) 細(xì)胞接種6孔板，參照1.2.1分組實(shí)驗(yàn)。光照前加入無(wú)熒光的2'，7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2'，7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA），終濃度10μmol/L。光照結(jié)束后培養(yǎng)30 min，然后加入1 mL Hoechst33342，培養(yǎng) 30 min，PBS洗 2次。鏡下觀察，Hoechst33342染色，核藍(lán)色顯示凋亡（深染，團(tuán)塊狀），DCFH被氧化成 2',7'-二氯熒光素（2'，7'-Dichlorofluorescein，DCF），在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)黃綠色熒光（表明有ROS，否則無(wú)色）。收集細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞分析儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Annexin V&Dead Cell雙標(biāo)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞處理結(jié)束后收獲細(xì)胞，PBS洗2次，用100μL結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×105/mL，加100μL（Annexin-V和7-AAD），室溫下閉光染色20 min，經(jīng)細(xì)胞分析儀檢測(cè)并分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較應(yīng)用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 siRNA沉默P38MAPK表達(dá) 轉(zhuǎn)染siRNAP38MAPK 48 h后，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到90%以上，見圖1A，P38MAPK mRNA和蛋白的表達(dá)明顯被抑制，提示轉(zhuǎn)染成功。見圖1B和1C。

Fig.1 The silencing of P38MAPK in Lovo cells圖1 siRNA沉默Lovo細(xì)胞P38MAPK表達(dá)

2.2 siRNA-P38MAPK介導(dǎo) TαPcZn-PDT誘導(dǎo)的Lovo細(xì)胞線粒體損傷

2.2.1 siRNA-P38MAPK 影響 TαPcZn-PDT激發(fā)Lovo細(xì)胞產(chǎn)生ROS 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNA-P38MAPK組的Lovo細(xì)胞形態(tài)較好，為梭形、三角形，TαPcZn-PDT組和TαPcZn-PDT/siRNA-P38MAPK組的Lovo細(xì)胞部分收縮變圓。通過(guò)熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、siRNA-陰性對(duì)照組、siRNA-P38MAPK組產(chǎn)生ROS的Lovo細(xì)胞很少，TαPcZn-PDT組和TαPcZn-PDT/siRNA-P38MAPK組產(chǎn)生ROS的Lovo細(xì)胞較多且處于凋亡狀態(tài)。見圖2A。細(xì)胞流式結(jié)果分析顯示，TαPcZn-PDT能明顯誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞產(chǎn)生ROS（P＜0.05），siRNA-P38MAPK能部分阻礙TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo產(chǎn)生ROS（P＜0.05）。見圖2B和表1。

2.2.2 siRNA-P38MAPK影響 TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞線粒體膜電位ΔΨm的改變 流式結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，TαPcZn-PDT 組和 TαPcZn-PDT/siRNAP38MAPK組線粒體膜電位發(fā)生去極化的細(xì)胞非常多（P＜0.05），且 TαPcZn-PDT/siRNA-P38MAPK 組發(fā)生去極化的細(xì)胞少于TαPcZn-PDT組（P＜0.05）。見圖3、表1。

2.3 siRNA-P38MAPK影響TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡 流式結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，TαPcZn-PDT組和TαPcZn-PDT/siRNA-P38MAPK組的凋亡細(xì)胞較多（P＜0.05），且 TαPcZn-PDT/siRNA-P38MAPK 組的凋亡細(xì)胞比TαPcZn-PDT組的凋亡細(xì)胞少（P＜0.05）。見圖4、表1。

3 討論

Fig.4 Effects of TαPcZn-PDT on the apoptosis of Lovo cells with siRNA-P38MAPK圖4 在siRNA-P38MAPK作用下TαPcZn-PDT對(duì)Lovo細(xì)胞凋亡的影響

Tab.1 Effects of TαPcZn-PDT on ROS,ΔΨm and apoptosis level of Lovo cells after transfection with siRNA-P38MAPK表1siRNA-P38MAPK轉(zhuǎn)染后TαPcZn-PDT對(duì)Lovo細(xì)胞ROS、ΔΨm和凋亡的影響 （n=3，%，x±s）

目前已有研究證實(shí)TαPcZn-PDT具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且P38MAPK參與此過(guò)程［8-9］，但是P38MAPK影響凋亡過(guò)程的具體機(jī)制尚不清楚。因此，本文以P38MAPK為靶目標(biāo)，探討了TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡過(guò)程中P38MAPK在線粒體損傷中的作用。實(shí)驗(yàn)初期，在對(duì)照部分設(shè)立siRNA-陰性對(duì)照組，鑒于siRNA-陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組無(wú)差異，另外考慮到合成的TαPcZn較少，因此未在TαPcZn-PDT作用下設(shè)立siRNA-陰性對(duì)照組，只分別 設(shè) 了 TαPcZn-PDT 組 和 TαPcZn-PDT/siRNAP38MAPK組。

3.1 P38MAPK參與TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞線粒體的損傷 線粒體的變化在凋亡過(guò)程中最先出現(xiàn)，因而探討TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞線粒體的損傷具有重要意義。線粒體損傷先從線粒體膜通透性孔道（mitochondrial permeability transition pore，MPTP）開放和ROS產(chǎn)生開始，MPTP的開放導(dǎo)致線粒體ΔΨm的降低，產(chǎn)生的ROS釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而損傷細(xì)胞器、細(xì)胞核，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。ROS包括超氧自由基、過(guò)氧化氫及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，TαPcZn-PDT 能明顯誘導(dǎo) Lovo產(chǎn)生 ROS，且在siRNA-P38MAPK作用下產(chǎn)生的ROS明顯減少，說(shuō)明P38MAPK介導(dǎo)了TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞產(chǎn)生ROS，這與前期研究基礎(chǔ)TαPcZn-PDT具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，且P38MAPK參與此過(guò)程相呼應(yīng)［8-9］。

由于線粒體ΔΨm的去極化是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件，因此線粒體的損傷最先體現(xiàn)在線粒體ΔΨm的變化［11］。因此，本研究又對(duì)線粒體的ΔΨm的變化進(jìn)行了研究，探討siRNA-P38MAPK介導(dǎo)TαPcZn-PDT誘導(dǎo)的Lovo細(xì)胞線粒體損傷的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)，TαPcZn-PDT導(dǎo)致早期凋亡和晚期凋亡的Lovo細(xì)胞ΔΨm發(fā)生去極化，而這種去極化現(xiàn)象可被siRNA-P38MAPK抑制，主要是在早期凋亡的發(fā)生去極化的細(xì)胞大量減少，從而導(dǎo)致晚期凋亡的發(fā)生去極化的細(xì)胞也大量減少。這與P38MAPK參與TαPcZn-PDT具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用相一致。

本研究發(fā)現(xiàn)P38MAPK介導(dǎo)TαPcZn-PDT誘導(dǎo)的Lovo細(xì)胞的線粒體凋亡途徑是通過(guò)影響ROS的產(chǎn)生和線粒體膜電位ΔΨm的改變來(lái)實(shí)現(xiàn)的。沉默P38MAPK基因可明顯減弱TαPcZn-PDT誘導(dǎo)的ROS釋放，阻礙了線粒體膜電位去極化，從而降低了TαPcZn-PDT誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

3.2 P38MAPK參與TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡 線粒體的變化在凋亡過(guò)程中最先出現(xiàn)，因此在研究線粒體損傷的同時(shí)，也檢測(cè)了細(xì)胞凋亡的情況。研究結(jié)果再一次證明了TαPcZn-PDT誘導(dǎo)的Lovo細(xì)胞凋亡的作用，且主要發(fā)生在早期凋亡，這與TαPcZn-PDT誘導(dǎo)的Lovo細(xì)胞線粒體ΔΨm去極化相一致，更加證明了TαPcZn-PDT通過(guò)誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞線粒體損傷從而誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡，與Panel等［12］的研究結(jié)果一致，說(shuō)明線粒體在細(xì)胞凋亡中具有重要作用。本研究結(jié)果還顯示，siRNA-P38MAPK部分抑制了TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡的作用，這與siRNA-P38MAPK部分抑制ΔΨm發(fā)生去極化的作用相一致。因此，認(rèn)為P38MAPK參與TαPcZn-PDT誘導(dǎo)Lovo細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

本項(xiàng)目組前期研究結(jié)果顯示，在此凋亡過(guò)程中還有線粒體相關(guān)的蛋白也參與到此過(guò)程，如細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子（apoptosis inducing factor，AIF）、促凋亡蛋白BAX、細(xì)胞色素C（Cytochrome C，Cyto-C）等參與［7-8］，與Kello等［15］研究結(jié)果一致，均促進(jìn)了細(xì)胞凋亡過(guò)程。BAX參與MPTP孔道的開放，引起ΔΨm去極化加劇，同時(shí)開放的孔道引起AIF、Cyto-C的釋放，繼而加劇了細(xì)胞凋亡的進(jìn)程［16］。P38MAPK作為應(yīng)激反應(yīng)通路起到重要作用，它不僅通過(guò)caspase-3通路參與凋亡，還可通過(guò)線粒體通路參與到凋亡中［17］，因此siRNA-P38MAPK減弱了ROS的釋放，降低了凋亡率，但是凋亡細(xì)胞中形成的線粒體-caspase-線粒體的正反饋放大回路還在起作用，因此凋亡還存在［18-19］。

ROS、線粒體膜通透性及線粒體凋亡途徑三者之間存在著緊密的聯(lián)系，ROS與線粒體膜MPTP孔道的開放之間的關(guān)系一直存在爭(zhēng)議［11-12］。當(dāng)細(xì)胞受到ROS刺激時(shí)，線粒體MPTP開放，線粒體膜電位丟失，繼而引起ROS大量釋放，進(jìn)一步加劇了MPTP的開放，又加劇了ROS的釋放和累積，不斷往復(fù)引起線粒體損傷，最后導(dǎo)致線粒體途徑的細(xì)胞凋亡［13，19］，這與本研究結(jié)果一致，即TαPcZn-PDT誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，同時(shí)伴有線粒體膜電位ΔΨm去極化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。

綜上，TαPcZn-PDT通過(guò)誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生，引起線粒體膜電位去極化，導(dǎo)致Lovo細(xì)胞凋亡，P38MAPK通過(guò)影響ROS產(chǎn)生和釋放從而影響上述凋亡過(guò)程。

（圖2見插頁(yè)）