阿司匹林對酸和膽鹽誘導的Barrett食管患者食管鱗狀細胞NF-κB活化和CDX2表達的影響

戴 結(jié)

中國人民解放軍海軍安慶醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽 安慶 246003

在西方國家,2%～7%的成年人患有Barrett食管(Barrett’s esophagus,BE)，這是一種有惡性腫瘤風險的腸型化生黏膜取代胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)損傷的食管鱗狀上皮黏膜[1]。高達40%的西方成年人存在GERD癥狀，目前尚不清楚為何這些人中只有少數(shù)發(fā)展為BE[2]。研究表明，當食管鱗狀上皮細胞暴露于反流胃液中的有毒物質(zhì)酸和膽鹽時，個體之間在激活的分子通路上存在差異，這些差異可能決定了GERD 損傷的食管是通過鱗狀細胞再生還是通過伴隨 BE發(fā)展的化生而愈合[3-4]。

流行病學研究表明，使用阿司匹林和其他非甾體抗炎藥(NSAIDs)可以預防由 Barrett 化生發(fā)展而來的食管腺癌[5]。最近的一項病例對照研究發(fā)現(xiàn)，阿司匹林可以防止Barrett化生在具有GERD癥狀的個體中發(fā)生，而其他NSAIDs則無這種作用[6]。與其他NSAIDs不同的是，阿司匹林除抑制從花生四烯酸中產(chǎn)生前列腺素的環(huán)氧合酶外，還抑制促炎性NF-κB通路[7]。因此，推測阿司匹林對Barrett化生發(fā)展的獨特保護作用可能歸因于其對NF-κB的抑制作用。

NF-κB在正常食管鱗狀上皮中不激活，但在GERD炎癥形成的食管上皮中被激活[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，酸和膽鹽在食管鱗狀細胞中誘導NF-κB通路信號傳導[9]。尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2(CDX2)是一個受NF-κB信號傳導影響的決定腸上皮細胞形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[10]。CDX2啟動子包含兩個推測的NF-κB結(jié)合位點[11]。大量研究表明，酸和膽鹽可以增加CDX2啟動子的活性，并增加大鼠和部分人食管鱗狀細胞中CDX2 mRNA 的表達[12-13]。在反流性食管炎的動物模型中，反流損傷的食管上皮在出現(xiàn)Barrett化生之前也表現(xiàn)出CDX2表達增加[14]。這表明發(fā)炎的食管鱗狀上皮中CDX2的表達可能預示著BE的發(fā)展，而CDX2的表達可能是NF-κB通路信號傳導的結(jié)果。

本研究主要探討酸和膽鹽在BE患者的食管鱗狀細胞中誘導NF-κB活化和CDX2表達的機制，以及阿司匹林能否抑制這種表達。

1 材料與方法

1.1 細胞系與主要試劑我們使用了2種非腫瘤性端粒酶永生化食管鱗狀細胞(NES)系：NES-B細胞和NES-G細胞，分別由合并BE的GERD患者(NES-B)和無合并BE的GERD患者(NES-G)遠端食管鱗狀上皮內(nèi)鏡活檢標本制成[15]，均購自美國ATCC細胞庫。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、DMSO等購自美國Gibco公司；Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；阿司匹林(含量98%)、鹽酸、結(jié)合膽汁酸等購自上海撫生生物科技有限公司； CDX2、GAPDH、NF-κB/p50、p65、p-p65、IκB、p-IκB、PKAc等抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；兩步法RT-PCR試劑盒、引物、Western blotting檢測試劑盒、ECL發(fā)光液等購自南京凱基生物科技有限公司。

1.2 細胞培養(yǎng)所有細胞均生長于含質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，37 ℃、飽和濕度條件下常規(guī)傳代培養(yǎng)。實驗選用細胞均為對數(shù)期細胞。

1.3 酸和膽鹽暴露將細胞暴露于3種不同的實驗培養(yǎng)基：(1)酸性完全生長培養(yǎng)基(用1 mol/L HCl使pH值達到4.0)；(2)中性膽鹽培養(yǎng)基(含有總濃度為400 μmol/L的結(jié)合膽汁酸，pH值為7.2)；(3)酸性膽鹽培養(yǎng)基(同一膽汁酸溶液，pH值為4.0)。中性完全生長培養(yǎng)基(pH值為7.2)作為對照培養(yǎng)基。 在24 h的暴露中，將酸性完全生長培養(yǎng)基和酸性膽鹽培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為5.5。

1.4 阿司匹林干預在Western blotting實驗中，用100 μmol/L的阿司匹林預處理細胞2 h，再加入含有阿司匹林的酸和膽鹽培養(yǎng)基30 min，然后收集細胞裂解物。在RT-PCR實驗中，用100 μmol/L的阿司匹林預處理細胞2 h，再加入含有阿司匹林的酸和膽鹽培養(yǎng)基24 h， 然后收集總RNA。在細胞系實驗中，加入含有阿司匹林的酸性和膽鹽培養(yǎng)基60 min，然后去除并置換中性 pH 培養(yǎng)基6 h。然后測定細胞提取物的熒光素酶活性。對照組為中性完全生長培養(yǎng)基(pH值為7.2)，加或不加阿司匹林。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測用胰酶消化收集細胞，裂解液裂解細胞提取總蛋白。水浴法蛋白變性后，加入蛋白上樣緩沖液，采用質(zhì)量濃度為100 g/L聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠進行電泳分離，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，質(zhì)量濃度為50 g/L牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗按1∶1 000稀釋，4 ℃下孵育過夜，二抗在室溫下孵育2 h，使用ECL顯影液發(fā)光顯影。

1.6 染色質(zhì)免疫沉淀法檢測取提取的組織蛋白樣品500 μg，加入抗p65或p50抗體10 μl，4 ℃輕搖2 h，加入20 μl蛋白A-瓊脂糖，4 ℃輕搖過夜。4 ℃ 1 000×g離心，棄上清。1 ml PBS懸浮沉淀，4 ℃ 1 000×g離心5 min，洗滌沉淀。重復3次。4 ℃ 1 000×g離心，棄上清，留沉淀。上樣緩沖液加入沉淀，煮沸5 min，離心后上樣，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白、轉(zhuǎn)膜，含5%(W/V)卵清蛋白的 TTBS緩沖液封閉，室溫輕搖1 h，加入抗CDX2抗體，用TBS 緩沖液稀釋抗CDX2抗體(1∶500)，將膜和適量的抗體稀釋液放入雜交袋，4 ℃輕搖過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶10 000)，與膜室溫孵育1 h，用ECL增強發(fā)光顯影。

1.7 熒光素酶報告基因檢測NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性每個轉(zhuǎn)染樣品準備質(zhì)粒-Lipo 2000混合液。 將質(zhì)粒-Lipo 2000混合液加入含有細胞和培養(yǎng)基的48孔板中搖勻，置于37 ℃體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，移去培養(yǎng)液，更換新鮮培養(yǎng)基，培養(yǎng)到48 h測熒光素酶活性。取5 μl細胞裂解液與螢火蟲熒光素酶緩沖液及底物5 μl(按Promega雙熒光報告系統(tǒng)測量試劑盒說明)混勻測量熒光強度，然后加入海腎熒光素酶反應緩沖液及腔腸素底物5 μl，混勻再次測得海腎熒光素酶活性。將每個樣品按照海腎熒光素酶活性進行均一化處理，比較螢火蟲熒光素酶活性并繪制圖表。

1.8 免疫熒光技術(shù)檢測p65蛋白的核轉(zhuǎn)位滴加以0.01 mol/L，pH值為7.4的PBS稀釋的特異性p65熒光抗體標本，覆蓋p65抗原標本片，玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)37 ℃保溫30 min。先用PBS沖洗2次，然后按順序過PBS三缸浸泡，每缸5 min，不時振蕩，取出玻片，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)37 ℃保溫30 min，再重復上述操作1次，取出玻片，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察。

1.9 qRT-PCR法檢測CDX2 mRNA的表達采用TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用qRT-PCR試劑盒進行擴增操作，以GAPDH為內(nèi)參檢測細胞中CDX2 mRNA的表達量。引物序列：CDX2 上游5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′，下游5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′；GAPDH上游5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′；下游5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

2 結(jié)果

2.1 酸和膽鹽暴露后NES-B細胞和NES-G細胞中NF-κB亞基p50和 p65的核移位比較與未經(jīng)處理的對照組比較，NES-B細胞和NES-G細胞具有相似水平的細胞質(zhì)和細胞核p65和p50蛋白。用酸、膽鹽或兩者聯(lián)合處理NES-B細胞，可以消除p65和p50的胞漿水平，并導致細胞核中p50和p65的水平顯著升高。與此相反，用酸和膽鹽處理NES-G細胞，細胞質(zhì)中p50和p65的水平降低而不消除，并導致細胞核中p50水平升高，而p65水平僅略微升高(見圖1)。

注：A：單純酸組; B：單純膽鹽組; A&B: 酸及膽鹽組; C：對照組。

圖1 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-B和NES-G細胞中胞質(zhì)和胞核p65和p50蛋白的表達水平變化

Fig 1 Changes of cytoplasmic and nucleus p65 and p50 protein expression levels in NES-B and NES-G cells after exposureto acid, bile salts and acidic bile salts

在本研究中使用NES-G細胞進行染色質(zhì)免疫沉淀實驗，結(jié)果顯示，未經(jīng)處理的NES-G細胞中p50和p65與CDX2啟動子DNA的結(jié)合程度最低，雖然酸和膽鹽暴露引起NES-G細胞中p50的核轉(zhuǎn)位，但核轉(zhuǎn)位并不伴隨p50與CDX2啟動子的結(jié)合增加(見圖2)。

2.2 酸和膽鹽對NES-B細胞和NES-G細胞中p50/p65異二聚體形成及與IκB和PKAc結(jié)合的p65量的影響對p50進行免疫沉淀，然后對p65進行蛋白質(zhì)印跡，以證實NF-κB蛋白在NES-G和NES-B細胞系中形成異二聚體。結(jié)果顯示，未受刺激的兩種細胞均表現(xiàn)出p50/p65異二聚體形成。暴露于酸、膽鹽和酸性膽鹽后，NES-G細胞中的異二聚體形成量增加不明顯，而NES-B細胞中的異二聚體形成量輕微增加(見圖3)。對p65進行免疫沉淀法測定，然后對IκB進行蛋白質(zhì)印跡測定，以確定細胞質(zhì)中與IκB結(jié)合的p65的量。結(jié)果顯示，在NES-G細胞中，暴露于酸、膽鹽和酸性膽鹽僅導致與IκB結(jié)合的p65極小量降低。 同樣的暴露使NES-B細胞中仍與IκB結(jié)合的p65量明顯減少。通過對p65蛋白的免疫沉淀法分析，發(fā)現(xiàn)蛋白激酶A (PKAc) 確實是NES 細胞中IκB-NF-κB復合物的一個組成部分。在NES-G細胞中，暴露于酸和膽鹽僅引起PKAc結(jié)合的p65的最小量變化。在NES-B細胞中，暴露于酸和膽鹽的結(jié)合，實際上消除了PKAc與p65的結(jié)合(見圖4)。

注：A：單純酸組; B：單純膽鹽組; A&B：酸及膽鹽組; C：對照組。

注：IP為免疫沉淀法; IB為免疫印跡法。A：單純酸組; B：單純膽鹽組; A&B：酸及膽鹽組; C：對照組。圖3 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-G和NES-B細胞質(zhì)中p50/p65異二聚體形成情況Fig 3 Formation of p50/p65 heterodimer in NES-G and NES-B cytoplasm after exposure to acid, bile salts and acidic bile salts

2.3 酸和膽鹽對NES-B細胞和NES-G細胞NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性的影響暴露于酸、膽鹽和酸性膽鹽后，NES-B細胞的 IκB(Ser32/36)和 p65(Ser276)磷酸化水平明顯升高。在NES-G細胞中這些相同的暴露導致IκB的磷酸化只有較少的增加，而p65的磷酸化僅有極少的增加(見圖5)。利用NF-κB熒光素酶報告基因構(gòu)建體，發(fā)現(xiàn)酸性膽鹽處理能顯著提高NES-B細胞中NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性，但在NES-G細胞中無這種效應(見圖6)。

注：IP為免疫沉淀法; IB為免疫印跡法。A：單純酸組; B：單純膽鹽組; A&B：酸及膽鹽組; C：對照組。圖4 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-G和NES-B細胞質(zhì)中與IκB和PKAc結(jié)合的p65蛋白水平的變化 Fig 4 Changes of p65 protein bound to IκB and PKAc in NES-G and NES-B cytoplasm after exposure to acid, bile salts and acidic biles

注：A：單純酸組；B：單純膽鹽組；A&B：酸及膽鹽組；C：對照組。

圖5 酸、膽鹽和酸性膽鹽暴露后NES-G和NES-B細胞中IκB(Ser32/36)和p65(Ser276)磷酸化水平的變化

Fig 5 Changes of phosphorylation levels of IκB (Ser32/36) and p65 (Ser276) of NES-G and NES-B cells after exposure toacid, bile salts and acidic bile salts

2.4 阿司匹林對酸和膽鹽誘導的NES-B細胞 IκB 磷酸化、 p65核轉(zhuǎn)位、 CDX2啟動子活化及CDX2 mRNA表達的影響用酸性膽鹽和阿司匹林(100 μmol/L)處理NES-B細胞，并檢測IκB和p65的磷酸化水平及CDX2啟動子活性和mRNA表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn),阿司匹林預處理消除了酸性膽鹽誘導的IκB磷酸化增加，而不消除p65的磷酸化(見圖7)，并阻斷了p65核轉(zhuǎn)位的增加(見圖8)。 阿司匹林消除了NES-B細胞中酸性膽鹽誘導的CDX2啟動子活性的增加(見圖9)和CDX2 mRNA表達的增加(見圖10)。

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對照組；與C比較,*P<0.05。

圖6 NES-G和NES-B細胞在酸性膽鹽暴露后NF-κB/p65的轉(zhuǎn)錄活性

Fig 6 Transcriptional activity of NF-κB/p65 in NES-G andNES-B cells after acidic bile salts exposure

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對照組。

圖7 阿司匹林對酸和膽鹽誘導的NES-B細胞中IκB (Ser32/36)和p65(Ser276)磷酸化水平的影響

Fig 7 Effect of Aspirin on the levels of IκB (Ser32/36) and p65 (Ser276) phosphorylation in NES-B cells induced by acid and bilesalts

3 討論

Huo等[16]發(fā)現(xiàn)，酸和膽鹽在NES-B細胞和NES-G細胞中激活NADPH氧化酶系統(tǒng)以產(chǎn)生H2O2，后者通過一系列的磷酸化作用激活I(lǐng)κB-NF-κB-PKAc復合物。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，在NES-B細胞中IκB和p65的磷酸化水平遠高于暴露于相同濃度酸和膽鹽的NES-G細胞中的水平。由于NES-G細胞中IκB-NF-κB-PKAc復合物的有限激活，NF-κB亞基p65在細胞質(zhì)中仍與IκB結(jié)合，與亞基p50不同，p65不會轉(zhuǎn)移到細胞核中，這一點很關(guān)鍵，因為即使只有p50與CDX2啟動子相結(jié)合，但核p65蛋白水平的增加是CDX2啟動子被酸和膽鹽激活所必需的[16]。最后，我們證明了阿司匹林可以阻止IKKβ激活 IκB，阻斷酸和膽鹽誘導的NES-B細胞IκB的磷酸化、p65的核轉(zhuǎn)位、CDX2啟動子的激活和CDX2 mRNA的表達。

注：DAPI顯示同一區(qū)域的細胞核數(shù)目(比例尺=50 μm)。A&B：酸及膽鹽組; C：對照組。

圖8 免疫熒光技術(shù)觀察阿司匹林對酸和膽鹽誘導的NES-B細胞中p65蛋白核轉(zhuǎn)位的影響

Fig 8 The effect of Aspirin on acidic bile salts-induced nucle-ar translocation of p65 protein in NES-B cells observed by im-munofluorescence technology

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對照組;與C比較,*P<0.05。

Fig 9 Effect of Aspirin on activation of CDX2 promoter inNES-B cells induced by acidic bile salts

注：A&B：酸及膽鹽組; C：對照組。

圖10 阿司匹林對酸和膽鹽誘導的NES-B細胞中CDX2 mRNA表達的影響

Fig 10 Effect of Aspirin on expression of CDX2 mRNA in NES-B cells induced by acidic bile salts

本研究已經(jīng)闡明了合并與不合并BE的GERD患者食管細胞在酸和膽鹽激活 IκB-NF-κB-PKAc復合物程度之間的主要差異。這些差異可以解釋為什么酸和膽鹽能誘導NES-B細胞而不誘導NES-G細胞中CDX2的表達。CDX2是腸型柱狀上皮形成所需的關(guān)鍵同源異型基因，CDX2在食管鱗狀細胞中的表達預示著腸化的發(fā)生。因此，GERD患者在反流引起食管IκB-NF-κB-PKAc復合物激活(NF-κB信號導致CDX2的表達)程度上的差異可能決定了其是否導致Barrett腸型化生的發(fā)展。

NF-κB活性可由多種信號觸發(fā)，所有這些信號最終都會匯聚到一個共同的靶點—細胞質(zhì)IκB-NF-κB-PKAc復合物上。復合物中IκB蛋白的磷酸化導致其降解，同時釋放 PKAc和NF-κB亞基p65。觸發(fā)IκB降解的信號也可激活PKAc，導致p65(Ser276)磷酸化，這是一種有利于p50/p65異二聚體形成和刺激p65轉(zhuǎn)錄活性的翻譯后修飾。此外，在免疫沉淀實驗中，PKAc的激活強度已被證明與p65結(jié)合的PKAc的丟失相關(guān)[17]。使用免疫沉淀法和蛋白質(zhì)印跡法，我們發(fā)現(xiàn)，PKAc確實與IκB和p65共存于食管鱗狀細胞的復合物中。我們還發(fā)現(xiàn)，酸和膽鹽使NES-B細胞而非NES-G細胞中結(jié)合在IκB和PKAc上的p65明顯減少，伴隨著p50/p65異二聚體形成的輕微增加和NF-κB/p65轉(zhuǎn)錄活性的顯著增加。

NSAIDs、Barrett化生和Barrett癌癥之間的關(guān)系仍是一個極具爭議的話題，不同的研究有時會得出相互矛盾的結(jié)論。例如，最近的一項使用Meta分析方法對病例對照研究的數(shù)據(jù)進行匯總的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，NSAIDs(包括阿司匹林)的使用和BE的存在無相關(guān)性[18]。與其他NSAIDs不同，阿司匹林阻斷ATP與IKK-β的結(jié)合，從而使其磷酸化IκB的主要功能喪失[19]。我們發(fā)現(xiàn)，濃度為100 μmol/L的阿司匹林消除了NES-B細胞中酸和膽鹽誘導的IκB磷酸化、 CDX2啟動子活化和 CDX2 mRNA 表達的增加。阿司匹林對 p65的磷酸化無影響，這是因為PKAc 的作用，PKAc是一種不被阿司匹林抑制的酶。服用阿司匹林治療慢性炎癥性疾病的患者血清濃度范圍為1 000～5 000 μmol/L，故通過口服給藥很容易達到100 μmol/L的血清濃度[7]。因此，本研究闡明了阿司匹林可以預防GERD患者發(fā)展為BE(在應對酸和膽汁的反流過程中其鱗狀上皮表達CDX2)的分子機制。

最后，本研究結(jié)果可能對采用射頻消融術(shù)(RFA)治療的BE患者的管理有重要意義，RFA是目前消除發(fā)育異常的BE的首選內(nèi)鏡治療方式[2]。RFA使用以導管為基礎(chǔ)的球囊電極，向化生的黏膜提供射頻能量，造成廣泛的周圍熱損傷。然后，患者接受質(zhì)子泵抑制劑(PPIs)治療，以控制酸反流和使消融的化生柱狀黏膜與新鱗狀上皮愈合。早期研究表明，RFA后Barrett化生復發(fā)率較低，但最近的研究顯示復發(fā)率高得多，在一些報道中，4年內(nèi)復發(fā)率接近50%[20]。這些復發(fā)的原因尚不清楚，但很可能是由于GERD誘導的食管損傷引起的，因為PPIs治療并不能完全阻止這種損傷。即使是高劑量的PPIs，也不會使許多BE患者的食管酸暴露正常化，盡管有PPIs治療，但膽汁酸反流仍然存在[21]。如果復發(fā)性Barrett化生的發(fā)病機制涉及反流的酸和膽鹽觸發(fā)IκB-NF-κB-PKAc復合物和NF-κB信號的激活導致CDX2的表達，那么阿司匹林治療可能會中斷這一過程。因此，本研究結(jié)果為阿司匹林(聯(lián)合PPIs)阻斷食管上皮細胞中NF-κB的激活從而防止RFA后復發(fā)性Barrett化生的臨床試驗提供了分子理論基礎(chǔ)。

總之，本研究證明了合并BE與不合并BE的GERD患者食管鱗狀細胞在酸和膽鹽激活NF-κB通路的強度方面存在顯著差異，這可解釋充分激活的NF-κB通路僅在BE患者的鱗狀細胞中引起CDX2表達。此外，可以通過使用阿司匹林抑制IκB的磷酸化來阻斷酸和膽鹽誘導的CDX2表達。這些結(jié)果闡明了分子機制并可以解釋為什么一些GERD患者會發(fā)展成BE而其他人卻未發(fā)展成BE，以及為什么阿司匹林可以防止BE的發(fā)展。