單鏈抗體JZC00聯(lián)合2-脫氧葡萄糖的抗腫瘤活性

高 琪，韓 月，許 薇，徐靜靜，王 旻，張 娟

(中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院抗體工程實驗室，南京 211198)

腫瘤比正常組織代謝更快[1]，因此腫瘤的發(fā)生與發(fā)展需要更多的營養(yǎng)物質(zhì)，為了滿足其需求，腫瘤在生長過程中會通過分泌細胞因子誘導(dǎo)血管新生[2-4]。臨床數(shù)據(jù)證明，實體瘤生長過程中都伴有血管新生，即便在血液瘤患者的骨髓中也發(fā)現(xiàn)大量的新生微血管，證明血管生成對實體瘤和血液瘤的發(fā)展都有重要的作用，因此抑制腫瘤血管新生成為抗腫瘤的一個策略[5]。目前已上市的針對血管生成的單克隆抗體藥物有靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的貝伐珠單抗及靶向血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR2)的雷莫盧單抗[6]，其中雷莫盧單抗能夠阻斷VEGF與VEGFR2結(jié)合，抑制VEGFR2的磷酸化，抑制下游信號通路，抑制腫瘤血管新生，從而發(fā)揮抗腫瘤效果[7]。但隨著腫瘤的快速生長，腫瘤內(nèi)部氧供應(yīng)不足引起缺氧，進一步激活下游相關(guān)基因的表達，影響單抗藥物對腫瘤生長的抑制作用，最后導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生[8]，如何提高缺氧環(huán)境下抗腫瘤血管生成抗體的藥效，成為亟待解決的重要問題。

2-脫氧葡萄糖(2-deoxyglucose，2-DG)是一種人工合成的葡萄糖衍生物，50年代以來被廣泛用于科研和臨床研究[9]，其能夠被葡萄糖轉(zhuǎn)運體(GLUT)轉(zhuǎn)移至細胞內(nèi)，從而抑制細胞攝取葡萄糖。進入細胞后2-DG被己糖激酶磷酸化生成6-磷酸-2-DG，而6-磷酸-2-DG不能被進一步代謝，非競爭性地抑制己糖激酶，從而抑制糖酵解[10-11]。由于2-DG抑制了糖酵解的關(guān)鍵步驟，細胞糖酵解被抑制，導(dǎo)致ATP的產(chǎn)生減少，因此減緩細胞生長甚至導(dǎo)致細胞死亡[12-13]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，2-DG能夠抑制HIF-1α的表達，改善腫瘤缺氧微環(huán)境[14]。

JZC00是本實驗室篩選得到的單鏈抗體，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)其能夠靶向VEGFR2，抑制VEGF與VEGFR2的結(jié)合，降低腫瘤血管密度，抑制腫瘤生長[15-16]。為了提高其活性，本研究選擇了2-DG與JZC00聯(lián)合使用，旨在探究JZC00與2-DG聯(lián)用在體外對小鼠腫瘤細胞LLC及4T1的抑制作用，并且建立體內(nèi)模型初步探究體內(nèi)抗腫瘤效果。

1 材 料

1.1 試 劑

羥氨芐青霉素、硫酸鏈霉素(上海生物工程股份有限公司)；2-脫氧葡萄糖(2-DG，上海源葉生物科技有限公司)；His標(biāo)簽抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG (H+L) 、MTT粉末、蛋白Marker(上海翊圣生物科技有限公司)；乳酸測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)；葡萄糖測定試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；JZCOO由本實驗室篩選構(gòu)建，經(jīng)搖瓶發(fā)酵并純化得到。

1.2 細胞株

小鼠非小細胞肺癌細胞系LLC、鼠乳腺癌細胞系4T1購自中科院上海細胞所。

1.3 動 物

四周齡雌性C57BL/6J小鼠(合格證號：201918997)和四周齡雌性BALB/c小鼠(合格證號：201927296)均購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心。所有動物均自由進食水。動物實驗符合動物倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

2.1 細胞培養(yǎng)

LLC、4T1細胞均貼壁生長，采用含有10% FBS、0.1%氨芐青霉素、0.1%鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天傳1代。

2.2 細胞增殖實驗

將處于對數(shù)生長期的細胞消化后計數(shù)，按每孔2×103個細胞加入96孔板中，24 h后更換含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，高低劑量組改變2-DG濃度，JZC00濃度不變，每個濃度設(shè)置3個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，用MTT法測定細胞增殖。每孔加入MTT 10 μL，混勻后置于37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定490 和630 nm處吸收度，繪制細胞增殖抑制曲線。計算公式：抑制率=(對照組吸收度-實驗組吸收度)/(對照組吸收度-空白組吸收度)×100%。

2.3 葡萄糖攝取及乳酸釋放速率測定實驗

將處于對數(shù)生長期的細胞消化后計數(shù)，按每孔2×105個細胞加入6孔板中，過夜后更換含有不同濃度藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集上清液。葡萄糖濃度利用葡萄糖測定試劑盒檢測。乳酸濃度利用乳酸測定試劑盒檢測。乳酸釋放抑制率計算公式：抑制率=[1-(實驗組乳酸濃度/對照組乳酸濃度)]×100%；葡萄糖攝取抑制率計算公式：抑制率=[1-(實驗組葡萄糖攝取率/對照組葡萄糖攝取率)]×100%。

2.4 蛋白免疫印跡

每個泳道中加入蛋白樣品50 ng，80 V恒壓30 min使樣品完全濃縮，轉(zhuǎn)換120 V恒壓電泳1.5 h。電泳結(jié)束后，200 mA轉(zhuǎn)膜100 min。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用含有5%脫脂牛奶的TBS溶液37 ℃封閉2 h，封閉后鼠抗His標(biāo)簽一抗4 ℃孵育過夜。一抗孵育結(jié)束后，TBST洗膜3次，TBS洗膜3次，之后孵育二抗。孵育結(jié)束后TBST洗膜3次，TBS洗膜3次，凝膠成像系統(tǒng)成像并保存圖片。

2.5 動物模型

LLC皮下移植瘤模型：小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，將1×106個LLC細胞接種于C57BL/6J小鼠左側(cè)皮下，待平均瘤體積達到100 mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為4組，每組5只：PBS對照組、JZC00單獨用藥組(5 mg/kg,iv,3次/周×2周)、JZC00與2-DG 低劑量聯(lián)合用藥組(JZC00:5 mg/kg,2-DG:200 mg/kg,iv,3次/周×2周)、JZC00與2-DG高劑量聯(lián)合用藥組(JZC00:5 mg/kg,2-DG:800 mg/kg,iv,3次/周×2周)。給藥期間每兩天測量一次瘤體積，利用公式V= LW2/2(L,腫瘤最長直徑；W，垂直于L方向最長直徑)。兩周后處死小鼠，剝離瘤塊用于后續(xù)分析。

4T1原位乳腺癌模型：小鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，麻醉小鼠將1×106個4T1細胞接種于BALB/c小鼠第4對乳腺脂肪墊內(nèi)，待平均瘤體積達到100 mm3時，將荷瘤小鼠隨機分為4組，分組、給藥方式、給藥劑量、分析方法同LLC皮下移植瘤模型。

2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 22、GraphPad Prism 8.0進行分析，圖中數(shù)據(jù)進行3次獨立實驗，不同組別間差異用t檢驗分析，P<0.05認(rèn)為差異具有顯著性。

3 結(jié) 果

3.1 單鏈抗體的表達純化及鑒定

單鏈抗體JZC00由大腸埃希菌原核表達，利用鎳柱純化，將蛋白洗脫液制樣SDS-PAGE檢測，鑒定其純度及相對分子質(zhì)量。如圖1-A所示，JZC00經(jīng)鎳柱純化后相對分子質(zhì)量約為28 kD，符合理論值，并且條帶單一，達到電泳純度。對蛋白洗脫液進行Western blot檢測。如圖1-B所示，在28 kD左右檢測到條帶與SDS-PAGE結(jié)果保持一致，證明大腸埃希菌表達的單鏈抗體正確，可用于后續(xù)活性的研究。

Figure1 Purification and identification of single-chain antibody JZC00

A：SDS-PAGE of JZC00 after purification of nickel column；B：Western blot result of JZC00

3.2 JZC00及2-DG對腫瘤細胞增殖的影響

首先研究了JZC00與2-DG對小鼠腫瘤細胞系LLC、4T1增殖的影響。如圖2-A所示單鏈抗體JZC00對兩株細胞的增殖都有較顯著的抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴性，JZC00濃度越高抑制作用越顯著。圖2-B顯示2-DG也可有效抑制兩株腫瘤細胞的增殖，隨著濃度的升高2-DG對腫瘤增殖的抑制作用增強。

3.3 JZC00及2-DG對腫瘤細胞糖酵解的影響

在不同濃度藥物作用48 h后，使用葡萄糖測定試劑盒及乳酸測定試劑盒檢測上清液中葡萄糖和乳酸的濃度，探究JZC00和2-DG對腫瘤細胞糖酵解的影響。如圖3所示，在體外常氧條件下，JZC00能夠抑制腫瘤細胞的葡萄糖攝取速率及乳酸釋放速率，證明JZC00能夠抑制腫瘤細胞糖酵解。當(dāng)JZC00與2-DG聯(lián)合使用時，腫瘤細胞乳酸釋放速率及葡萄糖攝取速率與2-DG單藥組相比顯著下降，證明JZC00與2-DG能夠協(xié)同抑制腫瘤細胞糖酵解。在體內(nèi)，腫瘤內(nèi)部微環(huán)境中的氧含量顯著低于正常組織，低氧環(huán)境下腫瘤組織中HIF-1α的含量升高，升高的HIF-1α激活下游相關(guān)基因的表達?？寡苌伤幬镌谀[瘤缺氧條件下藥效下降甚至產(chǎn)生耐藥[2，17]，而2-DG可以在體內(nèi)下調(diào)HIF-1α的含量[18]，因此猜測2-DG 在缺氧條件下可以恢復(fù)抗血管生成藥物對于腫瘤生長的抑制作用。本研究選擇了二甲氧乙二酰甘氨酸(DMOG)，它是HIF-1α脯氨酰羥化酶抑制劑，能夠抑制HIF-1α的降解，因此通過DMOG可以在體外模擬HIF-1α高表達的缺氧環(huán)境。如圖4所示在加入DMOG后，JZC00對于腫瘤細胞葡萄糖攝取及乳酸釋放抑制能力顯著下降。當(dāng)加入2-DG后JZC00對腫瘤細胞糖酵解抑制能力恢復(fù)至常氧時的水平，說明HIF-1α?xí)p弱JZC00對腫瘤細胞的抑制，但2-DG能夠逆轉(zhuǎn)HIF-1α對JZC00的抑制。

A:MTT assays of JZC00 on the inhibition of LLC and 4T1 cells;B:MTT assays of 2-DG on the inhibition of LLC and 4T1 cells

Figure3 JZC00 and 2-DG inhibit glycolysis in cancer cells

Figure4JZC00 and 2-DG inhibit glycolysis in cancer cells under hypoxia

3.4 單鏈抗體及2-DG的體內(nèi)活性研究

前期的實驗證明，JZC00及2-DG在體外能夠抑制腫瘤細胞的糖酵解從而抑制其增殖，為了探究二者聯(lián)合用藥在體內(nèi)實驗中對腫瘤的抑制作用，構(gòu)建了小鼠非小細胞肺癌皮下移植瘤模型及小鼠乳腺癌原位模型。給藥2周后，處死小鼠剝離腫瘤組織進行分析。如圖5-A、5-B所示，JZC00單獨用藥組、JZC00聯(lián)合2-DG(200 mg/kg)組、JZC00聯(lián)合2-DG(800 mg/kg)組均具有抗腫瘤活性，另外發(fā)現(xiàn)聯(lián)合2-DG后JZC00的抑瘤效果顯著提升。對剝離的腫瘤進行稱重并計算抑瘤率。從圖5-C、5-D發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥低劑量組、聯(lián)合用藥高劑量組與對照組相比瘤重顯著降低，且高劑量組藥效提高最顯著，抑瘤率達到75%。圖5-E是各組小鼠給藥期間體質(zhì)量曲線，根據(jù)圖中所示給藥期間各組小鼠體質(zhì)量變化無顯著性差異，證明單鏈抗體JZC00及2-DG在產(chǎn)生抗腫瘤作用的同時對小鼠沒有顯著毒性。

A:Image of tumor mass peeled from different treatments after 15-day treatment;B:Tumor growth curve of each group under different treatment;C:Average tumor weight of different groups after 15-day treatment;D:Inhibition rate of different groups;E:The body weight curve of different group*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001.NS:no significance

2-DG聯(lián)合JZC00在體外顯著抑制腫瘤細胞LLC、4T1的糖酵解及增殖能力，同時在LLC皮下移植瘤模型中具有較好的抑瘤效果，因此建立了小鼠乳腺癌原位模型。如圖6-A、6-B所示聯(lián)合用藥高劑量組相較于JZC00組、聯(lián)合用藥低劑量組有更優(yōu)的抗腫瘤效果。圖6-C、6-D所示聯(lián)合用藥組、JZC00組均顯著降低了瘤重，且高劑量組藥效提高最顯著，抑瘤率達到了58%。并且根據(jù)圖6-E所示，各組小鼠給藥期間體質(zhì)量無顯著變化，顯示聯(lián)合用藥對小鼠無顯著毒性。

4 討 論

肺癌和乳腺癌分別是中國男性和女性發(fā)病率最高的癌癥，研究表明這兩種腫瘤在生長過程中均會誘導(dǎo)血管新生，以滿足其對氧和營養(yǎng)物質(zhì)的需求,進而維持腫瘤生長。

本課題組在前期工作中得到了靶向VEGFR2的單鏈抗體JZC00，通過驗證其能與VEGFR2結(jié)合，抑制腫瘤血管新生，具有較強的抑瘤作用。 2-DG是一種人工合成的糖酵解抑制劑，它在抑制腫瘤細胞糖酵解和腫瘤細胞生長的同時，還能在體內(nèi)下調(diào)HIF-1α的表達[15，19]。腫瘤細胞的主要產(chǎn)能方式是糖酵解但其還會通過線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生能量，因此在臨床試驗中2-DG單獨使用療效不顯著。但本研究認(rèn)為抑制腫瘤細胞糖酵解能夠抑制腫瘤細胞的生長，同時能夠下調(diào)HIF-1α的表達，下調(diào)相關(guān)基因的表達從而改善腫瘤微環(huán)境，提高抗體藥物對腫瘤的抑制作用?；诖诉x擇將JZC00與2-DG聯(lián)合使用提高抗腫瘤活性。

Figure6 JZC00 and 2-DG demonstrateinvivoefficacy against 4T1 orthotopic model

A:Image of tumor mass peeled from different treatments after 19-day treatment;B:Tumor growth curve of each group under different treatment;C:Average tumor weight of different groups after 19-day treatment;D:Inhibition rate of different group;E:Body weight curve of different group

*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.NS:no significance (n=5)

本實驗通過大腸埃希菌發(fā)酵得到了單鏈抗體JZC00，利用MTT法分別檢測了JZC00、2-DG對小鼠腫瘤細胞系LLC、4T1的增殖抑制活性。隨后在體外常氧及體外模擬缺氧條件下測定乳酸釋放速率、葡萄糖攝取速率，發(fā)現(xiàn)JZC00在HIF-1α高表達情況下抑制腫瘤細胞糖酵解能力下降，而2-DG可以逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。選用C57BL/6J小鼠建立LLC皮下移植瘤模型、BALB/c小鼠建立4T1原位乳腺癌模型，以JZC00為對照初步驗證了聯(lián)合用藥組的療效，當(dāng)2-DG達到臨床給藥劑量時，聯(lián)合用藥組抑瘤效果顯著增強。JZC00與2-DG的聯(lián)合使用通過抑制腫瘤血管新生及腫瘤細胞的糖酵解途徑提高了JZC00的抑瘤效果。本文研究了JZC00與2-DG在常氧及誘導(dǎo)缺氧條件下對于腫瘤細胞糖酵解的抑制作用，但對于真正缺氧條件下的抑制作用未作研究，同時本實驗對腫瘤細胞系進行了研究，但對于抗腫瘤血管生成抗體耐藥細胞株還需下一步研究。