倪凱 李文琦 張婭 高敏 劉寶林 田利民 田秀蘭 何鵬飛 梁志慶
摘要:目的?觀察佤藥日不潤(rùn)卜歪抑制肝纖維化實(shí)驗(yàn)大鼠的作用,以期進(jìn)確定其靶點(diǎn),為日后進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法?85只雄性SD大鼠,隨機(jī)均分為空白組、模型組、陽(yáng)性組、日不潤(rùn)卜歪高、中、低劑量組,除空白組10只外,其余每組15只。除空白組外,模型組、陽(yáng)性組、日不潤(rùn)卜歪高、中、低劑量組采用復(fù)合造模方法建立肝纖維化模型,空白組、模型組灌胃飲用水,陽(yáng)性組灌胃復(fù)方鱉甲膠囊(0.027?g/mL),日不潤(rùn)卜歪高劑量組(0.3?g/mL)、中劑量組(0.15?g/mL)和低劑量組(0.075?g/mL)灌胃日不潤(rùn)卜歪提取液。以上各組均按20mL/Kg灌胃,持續(xù)灌胃4周。于建模后4周,取血清測(cè)生化指標(biāo),取肝臟測(cè)臟器系數(shù)、肝纖四項(xiàng),觀察肝纖維化大鼠模型組及陽(yáng)性組、各治療組大鼠血清生化、肝纖四項(xiàng)等情況。結(jié)果?與模型組比較,陽(yáng)性組、給藥高、中、低劑量組丙氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽紅素、甘油三酯等均有下降(P<0.01,P<0.05);與模型組比較,陽(yáng)性組、給藥高、中、低劑量組IV型膠原的表達(dá)均有有非常顯著性差異(P<0.01),其中給藥組中劑量組還透明質(zhì)酸差異有顯著性意義(P<0.05);與陽(yáng)性組比較,給藥高、中、低劑量組IV型膠原的表達(dá)均有有非常顯著性差異(P<0.01)。?結(jié)論?佤族肝病用藥日不潤(rùn)卜歪可能是通過(guò)干預(yù)脂代謝異常等來(lái)阻止肝纖維化的,其對(duì)復(fù)合造模大鼠肝纖維化進(jìn)程有一定抑制作用。
關(guān)鍵詞:佤藥;日不潤(rùn)卜歪;肝纖維化;大鼠
中圖分類號(hào):R29?文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A?文章編號(hào):1007-2349(2020)03-0083-03
肝纖維化是一種病理學(xué)概念,以肝組織的細(xì)胞外基質(zhì)異常增生與分布為特征,導(dǎo)致肝臟的結(jié)構(gòu)和功能改變。肝纖維化是多種慢性肝病的共同病理特點(diǎn)和病理發(fā)生機(jī)制,病毒性肝炎、酒精、藥物、脂肪肝、自身免疫性肝病、膽汁淤積和遺傳代謝性疾病等原因引起的慢性肝病均存在肝纖維化的病理特點(diǎn)。肝纖維化是一個(gè)動(dòng)態(tài)發(fā)展過(guò)程。隨著纖維化程度的加重,慢性肝炎可進(jìn)一步演變?yōu)楦斡不?,甚至肝癌。因此,積極防治肝纖維化對(duì)于慢性肝病具有重要意義[1]。
目前肝纖維化動(dòng)物模型也較成熟,如四氯化碳、異種血清、膽總管結(jié)扎、乙醇、復(fù)合因素及二甲基硝胺(DMN)等,均可致大鼠肝纖維化[2]。
本實(shí)驗(yàn)在項(xiàng)目組前期佤族肝病用藥細(xì)胞篩選實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上,選擇對(duì)肝星狀細(xì)胞作用較好的佤藥日不潤(rùn)卜歪進(jìn)行抗大鼠肝纖維化作用研究。佤藥日不潤(rùn)卜歪為龍膽科獐牙菜屬植物青葉膽Swertia?mileensis?T?N?Ho?et?W?L?Shih(QYD)干燥全草[3],是佤族最常用的肝病用藥之一。
1??材料與儀器
1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?選取雄性SD大鼠,體重160g~200g,購(gòu)自昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部,生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(滇)k2015-0002。
1.2?藥物與試劑?復(fù)方鱉甲軟肝片,內(nèi)蒙古福瑞醫(yī)療科技股份有限公司,批號(hào):20190802。四氯化碳(分析純),天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司,批號(hào)20141215。輻照鼠用滅菌飼料,蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司,蘇飼審(2009)05032。試劑盒購(gòu)自江蘇卡爾文生物有限公司;BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司飲用水(珍茗純凈水符合GB2762-2012、GB19298-2003的要求),昆明珍茗食品有限責(zé)任公司。
1.3?主要儀器?日立7100全自動(dòng)生化分析儀,日本日立公司。Epoch連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)Bio-Tek公司。
1.4?實(shí)驗(yàn)環(huán)境?云南省中醫(yī)中藥研究院IVC獨(dú)立送風(fēng)系統(tǒng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK(滇)2017-0003,溫度20℃-26℃,濕度40-60%。
2?實(shí)驗(yàn)方法
2.1?藥材提取?QYD粉碎至粗粉,加水浸泡1?h,分別加8倍量、6倍量、4倍量純凈水,每次加熱至微沸計(jì)時(shí)30分鐘,合并三次濾液,濃縮備用。
2.2?動(dòng)物分組、造模及給藥?SD雄性大鼠85只,給予普通輻照繁殖飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)5天,隨機(jī)分為6組,依次為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、復(fù)方鱉甲軟肝片陽(yáng)性對(duì)照組、日不潤(rùn)卜歪高劑量組、中劑量組、低劑量組。空白對(duì)照組10只大鼠,其余各組每組15只大鼠。
除空白對(duì)照組外,其余各組采用復(fù)合因素誘導(dǎo)建立肝纖維化動(dòng)物模型。具體方法為[4]:每只動(dòng)物皮下注射40%油劑CCl4,首次按照5.0?mL/kg注射,以后每隔3天,按照3.0?mL/kg皮下注射40%油劑CCl4,連續(xù)注射4周??瞻讓?duì)照組給予普通輻照繁殖飼料喂養(yǎng),其余各組采用高脂飼料(2%膽固醇、10%豬油、0.2%甲基硫氧嘧啶、0.2%豬膽鹽、87.6%普通飼料)喂養(yǎng),喂養(yǎng)周期4周。同時(shí),除空白組外,其余各組用10%乙醇按照2?mL/kg劑量灌胃,每隔1天1次。
造模開始后,陽(yáng)性組(0.027?g/mL),給藥高劑量組(0.3?g/mL)、中劑量組(0.15?g/mL)和低劑量組(0.075?g/mL)大鼠均按20?mL/kg劑量每天以經(jīng)口灌胃方式給藥,空白對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃等體積純水,每日1次,連續(xù)灌胃4周。
動(dòng)物每周稱量體重1次,根據(jù)體重變化,調(diào)整給藥量。
2.3?日常觀察?實(shí)驗(yàn)過(guò)程中,每日觀察大鼠的一般情況,包括飲食、毛色、二便等。每周稱量體重1次,對(duì)大鼠體重、進(jìn)食和飲水量進(jìn)行記錄。觀察造模過(guò)程中,注射CCl4后的情況。
2.4?指標(biāo)檢測(cè)?末次給藥后,各組大鼠禁食8h,大鼠股動(dòng)脈取血,36℃水浴恒溫靜置1?h,3000?rpm離心5?min,分離血清,取上清液。
摘取大鼠肝臟,觀察其大小、色澤等并記錄,稱取肝臟質(zhì)量,根據(jù)大鼠的體重和肝臟的質(zhì)量計(jì)算大鼠的肝臟系數(shù)。
取大鼠肝臟左葉做肝纖維化關(guān)鍵指標(biāo)檢測(cè),右葉做病理檢測(cè)。
一般檢查:觀察大鼠一般癥狀和體征包括生長(zhǎng)發(fā)育狀況、死亡情況、精神狀況、活動(dòng)狀況、飲水有無(wú)異常、食欲、毛色、體重變化、大便等。
肝臟情況:肝臟大小、外形、質(zhì)地、色澤,肝臟臟器系數(shù)。
肝纖四項(xiàng)指標(biāo):透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原蛋白(PCⅢ)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)。
生化指標(biāo):總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、AST/ALT、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)。
病理檢測(cè):肝臟纖維化情況,病理形態(tài)學(xué)的改變。
3?結(jié)果
3.1?各組一般情況?除空白組外,其余各組一般情況稍差,精神狀況不好、活動(dòng)偏少,體重有減輕,見表1。
3.2?各組大鼠肝臟形態(tài)比較?除空白組外,模型組肝臟質(zhì)地變硬、色澤灰白,陽(yáng)性組和給藥組肝臟質(zhì)地柔軟、色澤淡紅,所有組別肝臟重量無(wú)差異(P>0.05)(見表2)。從肝臟系數(shù)(見表3)可以看出,模型組與空白組比較,差異有非常顯著性意義(P<0.01),與模型組比較,陽(yáng)性組與給藥高、中、低劑量組無(wú)差異,均P>0.05。
2.3?各組大鼠生化指標(biāo)比較?從生化檢測(cè)(見表4)可以看出,模型組與空白組相比較,所有生化檢測(cè)指標(biāo)升高明顯,差異有非常顯著性意義(P<0.01);與模型組比較,陽(yáng)性組、給藥高、中、低劑量組丙氨酸氨基酸轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽紅素、甘油三酯等均有下降(P<0.01,P<0.05),給藥組與模型組比較無(wú)差異(P>0.05)。
2.4?各組大鼠肝纖四項(xiàng)比較?模型組與空白組比較,肝纖四項(xiàng)(見表5)中透明質(zhì)酸差異有顯著性意義(P<0.05),與模型組比較,陽(yáng)性組、給藥高、中、低劑量組IV型膠原的表達(dá)均有有非常顯著性差異(P<0.01),其中給藥組中劑量組還透明質(zhì)酸差異有顯著性意義(P<0.05);與陽(yáng)性組比較,給藥高、中、低劑量組IV型膠原的表達(dá)均有有非常顯著性差異(P<0.01)。
3?結(jié)論
佤族肝病用藥日不潤(rùn)卜歪可能是通過(guò)干預(yù)脂代謝異常等來(lái)阻止肝纖維化的,其對(duì)復(fù)合造模大鼠肝纖維化進(jìn)程有一定抑制作用。
4?討論
從血清生化指標(biāo)、肝纖四項(xiàng)、病理檢測(cè)等可以看出,本實(shí)驗(yàn)造模成功。各給藥組大鼠肝臟大小適中,質(zhì)地偏軟,顏色稍紫紅,較模型組肝臟顏色灰白、質(zhì)地稍硬有明顯改善。肝臟臟器系數(shù)的差異應(yīng)該是與復(fù)合造模造成造模大鼠體重下降有關(guān)。和陽(yáng)性藥一樣,給藥組能不同程度降低甘油三酯等指標(biāo),疑似其可通過(guò)改善脂代謝等路徑達(dá)到抑制肝纖維化的目的。肝纖四項(xiàng)因模型組與空白組比較數(shù)據(jù)無(wú)明顯變化,某種程度上不具可比性。病理組織檢測(cè)顯示,給藥組肝臟纖維化程度與模型組比較有明顯改善。一定程度上顯示日不潤(rùn)卜歪有一定的抑制肝纖維化形成的作用。實(shí)驗(yàn)中模型組出現(xiàn)大鼠死亡,經(jīng)解剖觀察,系操作不慎灌胃死亡。
參考文獻(xiàn):
[1]趙志敏,劉成海.中醫(yī)藥治療肝纖維化研究進(jìn)展[J].實(shí)用肝臟病雜志,2016(1):12-15.
[2]魏偉,吳希美,李元建.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].4版.2010:1137.
[3]王國(guó)強(qiáng).全國(guó)中草藥匯編卷三[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2014:342.
[4]陳奇,張伯禮.中藥藥效研究方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2016:341.
(收稿日期:2020-02-17)